Del 1: Bioaktive forbindelser fra Ephedra Fragilis: Ekstraktionsoptimering, kemisk karakterisering, antioxidant- og antiglykationsaktiviteter

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Responsoverflademetodologi (RSM) med et Box-Behnken-design (BBD) blev brugt til at optimere udvindingen af ​​bioaktive forbindelser fra Ephedra fragilis. Resultaterne antydede, at ekstraktion med 61,93 procent ethanol ved 44,43 grader i 15,84 timer var den bedste løsning for denne kombination af variable. Den rå ethanolekstrakt (CEE) opnået under optimale ekstraktionsbetingelser blev sekventielt fraktioneret med opløsningsmidler med stigende polaritet. Indholdet af total phenol (TP) og total flavonoid (TF) samtantioxidantog antiglykationsaktiviteter blev målt. Den fytokemiske fingeraftryksprofil for fraktionen med den højeste aktivitet blev karakteriseret ved anvendelse af RP-HPLC. Ethylacetatfraktionen (EAF) havde det højeste TP- og TF-indhold og udviste de mest potente antioxidant- og antiglykeringsaktiviteter. Pearson-korrelationsanalyseresultaterne viste, at TP- og TF-indhold var meget signifikant korreleret med antioxidant- og antiglykeringsaktiviteterne. I alt blev seks forbindelser identificeret i EAF fra E. fragilis, herunder fire phenolsyrer og to flavonoider. Derudover viste molekylær docking-analyse også den mulige sammenhæng mellem identificerede bioaktive forbindelser og deres virkningsmekanismer. Vores resultater tyder på ny evidens for antioxidant- og antiglykeringsaktiviteterne af E. fragilis bioaktive forbindelser, der kan anvendes til behandling og forebyggelse af aldring og glycation-associerede komplikationer.

Nøgleord: Ephedra fragilis; respons overflade metodologi; Box-Behnken design; bioaktive forbindelser; RP-HPLC; antioxidant og antiglykerende aktiviteter

Klik her for at lære flere produkter

1. Introduktion

Den kontinuerlige eksponering for aggressorer fra forskellige kilder kan føre til en stigning ifrie radikalerproduktion i den menneskelige krop, der overstiger dens kapacitet til at regulere dem, og bidrager over tid til udviklingen af ​​adskillige oxidativ stress-associerede sygdomme, herunder aldring og diabetes[1]. Derfor,antioxidantertilskud kan hjælpe med at opretholde et optimalt biologisk system ved at fjerne for store koncentrationer af frie radikaler [2]. Det er blevet påvist, at frie radikaler deltager i glykeringsprocessen. Glykering, en spontan ikke-enzymatisk reaktion mellem tilgængelige aminogrupper af aminosyrerester i proteiner og reducerende sukkerarter, forekommer i højere grad under aldring og hyperglykæmi, hvilket resulterer i avanceret glycation slutprodukter (AGEs) produktion og akkumulering 3]. Udover at det interfererer med proteiner og ændrer deres funktionalitet, kan AGE'er også

engagere sig med receptoren for AGE'er (RAGE), en 45 KDa multi-ligand-celleoverfladereceptor, der tilhører immunoglobulinsuperfamilien [4], og aktivere adskillige nedstrøms intracellulære signalveje ledsaget af en stigning i frie radikaler produktion, der bidrager til patologiske komplikationer relateret til diabetes [5].

Det er veletableret, at antioxidanter og radikale scavenger-molekyler er gode beskyttere mod disse processer [6]. Brugen af ​​lægeplanter til at forebygge og modvirke sygdomme forbundet med oxidativt stress er en gammel medicinsk tradition. For nylig har mange undersøgelser vist, at sekundære metabolitter såsom tanniner, phenolsyrer og flavonoider med dobbelt antioxidant- og antiglycationspotentiale er mere effektive til behandling af diabetes mellitus [7]. Derfor er det af stor interesse at identificere nye kilder til fytokemikalier, der effektivt opfanger frie radikaler og reducerer ikke-enzymatisk glycering.

Ephedra fragilis er et medlem af Ephedra-slægten (Ephedracea-familien), der indeholder mere end 60 arter, der vokser i ørken og halvtørre forhold på begge halvkugler på seks kontinenter [8]. I mere end 5000 år har mange arter i Ephedra-slægten været almindeligt anvendt i traditionel kinesisk medicin (TCM) til behandling af flere sygdomme; der har været adskillige undersøgelser, der har rapporteret deres mange sundhedsmæssige fordele såsom anti-inflammatorisk [9, anti-invasiv, anti-angiogen, [10], antimikrobiel, antiproliferativ, pro-apoptotisk[11], neurobeskyttende [12], leverbeskyttende og anti -oxiderende egenskaber [13]. Flavonoider, alkaloider, phenolsyrer og andre forbindelser i Ephedra-planter er blevet betragtet som de vigtigste fytokemiske komponenter for disse farmakologiske egenskaber [14]. I den farmaceutiske industri er omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) i vid udstrækning anvendt som en analytisk metode til at påvise og identificere kemiske forbindelser baseret på deres forskellige hydrofobe egenskaber, selvom få undersøgelser er beskrevet i litteraturen til kemisk analyse af Ephedra arter.

Ekstraktionsprocessen af ​​disse bioaktive forbindelser fra forskellige plantekilder er det første vigtige trin involveret i deres kvalitative og kvantitative analyse [15]. Forskellige faktorer, dvs. ekstraktionsmetode, opløsningsmiddeltype og koncentration, temperatur, tid og andre kan have en væsentlig indflydelse på sammensætningen og ekstraktionshastigheden af ​​disse forbindelser [16]. Derfor kræves optimering af ekstraktionsprocesserne for at give et højt indhold af planteaktive stoffer. Oprindeligt udviklet i 1950'erne af Box og Wilson, er responsoverflademetodologi (RSM) i dag det mest almindeligt anvendte værktøj til at udføre, forbedre og optimere sådanne processer, hvor uafhængige faktorer har en kombineret effekt på den ønskede respons. Et af de hyppigst udvalgte designs i RSM af forskere er Box-Behnken-designet (BBD), fordi det har brug for en begrænset afprøvning og derfor repræsenterer et alternativ, der undgår langvarige eksperimenter og reducerer udgifterne [17-19].

Op til dato er der ingen undersøgelser tilgængelige i litteraturen vedrørende ekstraktionsoptimering af E. fragilis bioaktive forbindelser. Derfor sigtede denne undersøgelse på at optimere ekstraktionen af ​​totalt phenol (TP) og flavonoid (TF) indhold fra E.fragilis ved at anvende en BBD. Det rå ethanolekstrakt (CEE) opnået under optimale ekstraktionsbetingelser blev sekventielt fraktioneret med opløsningsmidler med stigende polaritet, og deres antioxidant- og antiglyceringsaktiviteter blev undersøgt under anvendelse af forskellige in vitro-tests. Endelig udførte vi i silico-analyse for yderligere at forstå de mekanismer, hvorved bioaktive forbindelser i EAE, som identificeret ved omvendt-fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC), binder til BSA og RAGE som målproteiner.

2. Resultater og diskussion

2.1. Montering af modellerne

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) for to svar angiver egnetheden af ​​modeller til nøjagtig forudsigelse af variationen i resultaterne [20]. En god præcision beskrives som et signal-til-støj-forhold større end 4, hvilket anses for ønskeligt [21]. Værdierne for tilstrækkelig præcision er 29,4772 og 28,729 for henholdsvis TP- og TF-indhold, hvilket viser et tilstrækkeligt signal. Samtidig indikerer de mindre værdier af variationskoefficient (CV procent) (1,52 og 0,4246 procent for henholdsvis TP- og TF-indhold) bedre præcision og pålidelighed af eksperimentelle værdier. For hver responsfaktor blev indflydelsen af ​​ekstraktionsfaktorerne XI (ethanolkoncentration), X2 (ekstraktionstemperatur) og X3 (ekstraktionstid) omhyggeligt undersøgt (tabel 2). Signifikansen af ​​hver koefficient blev testet ved hjælp af F- og p-værdier i betragtning af, at en større F-værdi og en mindre p-værdi altid førte til mere signifikant overensstemmelse mellem forskellige uafhængige variable [22]. Samlet viste disse resultater, at modellerne var reproducerbare og egnede til optimering.

2.2. Effekter af ekstraktionsvariabler på TP-indhold

Som angivet i tabel 2 viste ANOVA-resultaterne signifikante lineære (X og X2), kvadratiske (Xj, X5 og X) og interaktive (X1X og X2X3) effekter på TP-indhold. Blandt disse er TP-indhold hovedsageligt afhængigt af X, X3 på p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Værdien af ​​manglende tilpasning var ikke-signifikant (F-værdi =11.02, p-værdi=0.0843), hvilket indikerer, at modellen er velindrettet med god forudsigelse (R{ {9}}.9935; Adj R2=0.9818)(tabel 2).

Interaktionerne mellem ethanolkoncentration og ekstraktionstemperatur (XjX2) producerer en meget signifikant (s<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Disse effekter kan skyldes, at phenolforbindelser er polære molekyler, der naturligt forekommer med glucosider, som gør dem mere vandopløselige [23]. Da ekstraktionen af ​​phenolforbindelser er stærkt afhængig af opløsningsmiddelpolariteten, er en vand-alkoholblanding mere effektiv i sin ekstraktion end alkohol alene [20]. Med hensyn til princippet om "lige-opløses-lignende" fører et fald i ethanolkoncentrationen til en stigning i opløsningsmidlets polaritet, hvilket hjælper med at opløse TP[15]. Ikke desto mindre kan en høj ethanolkoncentration påvirke ekstraktionshastigheden ved at forhindre opløsning af phenolforbindelser. Ligeledes øgede en stigning i ekstraktionstemperaturen genvindingen af ​​målphenolforbindelser ved blødgøring af væv, svækkede cellevæggens integritet, øgede masseoverførsel og penetration af opløsningsmiddel ind i plantematrixen og øgede både opløselighed og diffusionshastighed; dog kan temperaturer for høje til en længere ekstraktionstid øge chancerne for deres nedbrydning [23]. Desuden har en lang ekstraktionsperiode vist sig potentielt at forlænge ilt- og lyseksponeringen, hvilket i sidste ende øger risikoen for dannelse af frie radikaler, som kan opfanges af phenolforbindelser [23]. Derfor var en forlænget ekstraktionstid ikke nyttig til at maksimere ekstraktionsudbyttet [24].

2.3. Effekter af ekstraktionsvariabler på TF-indhold

Som det fremgår af tabel 2, er de lineære virkninger af X og X3; kvadratiske effekter af X og X; og interaktionseffekten af ​​X1X2 og XjXg viste signifikante effekter på TF-indhold. Blandt alle væsentlige faktorer er TF hovedsageligt afhængig af X3,X,X,X og X1X2 ved p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Den ikke-signifikante værdi af manglende tilpasning(F-værdi=1.13; p-værdi=0.5024) antydede, at den foreslåede model passede til variablernes rumlige indflydelse på responsen med god forudsigelse (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (tabel 2).

Forskellige 3D-responsoverfladegrafer blev genereret for TF-indhold og vist i figur 1D-F. Interaktionseffekten af ​​ethanolkoncentration og ekstraktionstemperatur (X1X2) viste en signifikant (s<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

På samme måde viste interaktionen mellem ethanolkoncentration og ekstraktionstid (XIX3) en lignende korrelation (figur 1F). Ekstraktionsudbyttet af TF steg gradvist med stigende både ethanolkoncentration (Xj) og ekstraktionstid (X3). Nær midtpunktet af responsplottet (61,89 procent og 15,81 timer for henholdsvis X og X3) nåede TF-udbyttet sit højeste, men faldt langsomt derefter. Dette fænomen skyldes højst sandsynligt Ficks anden diffusionslovsprincip, der afslører, at den endelige ligevægt mellem opløsningskoncentrationen i den faste matrix og opløsningsmidlet vil blive opnået efter en bestemt varighed, hvilket fører til en deceleration i ekstraktionsudbyttet af målforbindelser [26] .

2.4. Validering af optimerede betingelser

Målet med optimeringen var at bestemme de ekstraktionsbetingelser, der samtidig ville give det højeste TP- og TF-indhold. Designekspertsoftware blev brugt til at udføre optimering. BBD foreslog, at den optimale ethanolkoncentration, ekstraktionstemperatur og -tid skulle være henholdsvis 61,93 procent, 44,43 grader og 15,84 timer for ekstraktion af E. fragilis bioaktive forbindelser. På dette optimale tidspunkt var det forudsagte TP- og TF-indhold henholdsvis 15,335 mg GAE/g dw og 2,972 mg OE/g dw (tabel 3). Validering af modellernes forudsigelseskapacitet blev udført eksperimentelt under de optimale betingelser opnået fra RSM. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer under de opnåede betingelser, og det gennemsnitlige TP- og TF-indhold var henholdsvis 14,98±0.29GAE/g DW og 2.92±0.09 QE/g dw. De eksperimentelle værdier af undersøgte svar var sammenlignelige og på linje med værdierne for forudsagte værdier, hvilket bekræftede, at modellerne var tilstrækkelige til at afspejle den forventede optimering.

2.5. Ekstraktionsudbytte og fytokemisk analyse

Tabel 4 viste ekstraktionsudbyttet af E. fragilis CEE og dets fraktioner. Vores resultater viste, at ekstraktionsudbyttet i forskellige fraktioner adskiller sig signifikant fra 0.78 til 10,6 procent (w/wo). Som vist i tabel 4 er CEE(1{{14} },6 procent )havde det højeste procentvise udbytte, efterfulgt af WF (2,73 procent), WBF (2,04 procent), DMF(0,64 procent) og EAF(0,93 procent), hvorimod HF (0,78 procent). )havde det laveste procentvise udbytte.

TP-indholdet af E. fragilis CEE og dets fraktioner blev bestemt gennem en regressionsligning af kalibreringskurven (y {{0}}.009x-0.{{ 25}}154; R2=0.9973) og udtrykt i milligram gallussyreækvivalenter (GAE) pr. gram tørret vægt (tabel 4). Generelt havde EAF det højeste TP-indhold (32,78±0,49 mg GAE/g DW) efterfulgt successivt af WBF, DMF og CEE (25,02±1,01, 19,21±0,22 og 14,98±0,29 mg GAE/g DW), hvorimod WF og HF præsenterede det laveste indhold (henholdsvis 10,47±0,71 og 8,14±0,17 mg GAE/g DW). TF-indholdet af E. fragilis CEE og dets fraktioner blev evalueret ved aluminiumchlorid kolorimetrisk assay vha.quercetinas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Interessant nok var TP- og TF-indholdet i EAF 2,18 og 3.59- gange højere end CEE-indholdet, hvilket tyder på, at ethylacetat kan være det passende opløsningsmiddel til at koncentrere flere tilgængelige phenol- og flavonoidforbindelser under CEE-fraktioneringen. Vores data vedrørende TP- og TF-indhold er i overensstemmelse med Yao et al. [27] som rapporterer, at EAF opnået fra lægeplanten Pyrola asarifolia havde de højeste niveauer af phenoler og flavonoider sammenlignet med de andre fraktioner (petroleumsether, n-butanol og vand). I deres undersøgelse, Bhardwaj et al. [28] rapporterede også lignende resultater ved brug af flere opløsningsmidler med stigende polaritet (n-hexan, chloroform, ethylacetat og n-butanol) i spaltningen af ​​en lægeplante Codonopsis clematidea. Ifølge disse forfattere har EAF det højeste TP- og TF-indhold fjernt efterfulgt af n-butanol, chloroform og hexan. Denne betydelige variation i ekstraktionsudbyttet, sammensætningen og renheden af ​​phenolforbindelser mellem fraktionerne skyldes sandsynligvis forskellene i polariteten af ​​bestanddele fundet i plantematerialer, deres kemiske struktur, deres polymerisationsgrad og deres interaktion med hinanden [29 ].

2.6. In vitro antioxidant aktivitet

2.6.1.DPPH"Scavenging-aktivitet

DPPH" er et blandt få stabile frie radikaler, der er meget brugt til at undersøge antioxidantpotentialet i planteekstrakter [30]. Et ekstrakts rensende potentiale er ofte forbundet med dets evne til at opfange stabile frie radikaler, hvilket skyldes dets hydrogendonerende evne .

Opfangningskapaciteten af ​​CEE/fraktioner såvel som VC ved forskellige doser på DPPH*frit radikal blev undersøgt. Figur 2A viser, at alle fraktioner udviste tydelig DPPH·fjernende aktivitet på en dosisafhængig måde i området fra 0.1 til 1 mg/ml. Ved en dosis på 1 mg/ml, 64.32,44.1{{22} },67.24,86.63,80.95,51.37 og 99.62 procent af DPPH"-radikal blev slukket af henholdsvis CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF og VC. Den laveste IC50 for fjernelse af DPPH"blandt alle fraktioner blev vist af EAF(0.116±{{30}}.015 mg/mL )fortsat af WBF (0.175 ± 0.03 mg/mL),CEE (0.23 ± 0.065 mg/mL) og DMF (0.297 ±0,044 mg/ml). WF og HF viste forholdsvis højere IC50-værdier (henholdsvis 0,964±0,178 og 1,245±0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

IC50-værdien for DPPH-radikalopfangning var signifikant positiv korreleret med både TP-indhold (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus rensningsaktivitet

ABTS scavenging assayet bruges i vid udstrækning som et indeks til at informere og undersøge antioxidantkapaciteten af ​​rene forbindelser såvel som naturlige ekstrakter [32,33]. Faldningen af ​​den blå/grønne farve af ABTS*-kromoforen ved 734 i nærværelse af planteekstrakt kan indikere en antioxidantaktivitet.

Som vist i figur 2B udviste rensekurven for CEE/fraktioner på ABTS* plus en opadgående tendens, efterhånden som koncentrationen steg. Ved 1 mg/mL var opfangningshastighederne for CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF og VC 80.31,40.54,88.76, 9{{2{ {22}}}}, henholdsvis 11,82,97, 67,36 og 94,90 procent. Blandt alle fraktioner blev minimums ICs0-værdien vist af EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ mL)fortsat af DMF(0.196±0.023 mg/mL),WBF (0.277±0.031 mg/ml), CEE(0.429 ± 0,039 mg/mL) og WF (0,654± 0,043 mg/mL), hvorimod HF viste den højeste ICs0-værdi (1,314± 0,104 mg/mL). Samlet set var dette fund i overensstemmelse med Kaewseejan og Siriamornpun [29]. Sammenligning med den inhiberende kapacitet af VC (0,025±0,005 mg/ml) viste, at CEE's og dets fraktioners opfangningsaktivitet var lidt svag.

Som vist i tabel 5 er der en meget signifikant korrelation mellem ABTS-radikalopfangning og TP-indhold (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. H2O2 rensende aktivitet

Som en hovedbidragyder til oxidativt stress diffunderer H2O2 let gennem celler over membranen som et budbringermolekyle [34]. Tilsammen er H2O2 i sig selv ikke farlig [35], men det kan reagere med Fe2 gennem Fenton-reaktion og giver anledning til det meget reaktive hydroxylradikal(OH*)[36]. Det er således den mest skadelige af ROS for biomolekyler. Det er derfor nødvendigt at evaluere CCE's og dets forskellige fraktioners evne til at opfange H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF og de tilsvarende renseevner ved 1.0 mg/mL var henholdsvis 84.56,75.24, 67.17,56.18, 50.19 og 34.95 procent, hvilket var meget lavere end VC (98.03 procent).

Blandt alle fraktioner viste EAF den laveste IC50-værdi (ICs0= 0.098±0.013 mg/mL), og den var signifikant højere end for VC (0,024±0,006 mg/ml). Dette kan skyldes tilstedeværelsen af ​​høje phenol- og flavonoidforbindelser i EAF, som er almindeligt kendt for at spille en afgørende rolle som antioxidanter i biologiske systemer. I vores nylige undersøgelse demonstrerede vi kapaciteten af ​​EAF fra E.fragilis til at beskytte Tetrahymena pyriformis mod H2O2-induceret oxidativ skade [37].

Vores dataanalyse viste, at der, som for DPPH"- og ABTS* plus-resultaterne, blev noteret en stærk positiv korrelation af ICs0-værdien for H2O2-opfangning med både TP-indhold (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Reducerende kraft

Den reducerende kraft af et ekstrakt fungerer som en indikator for dets potentielle antioxidantaktivitet [39, A40]. Antioxidantpotentialet estimeres ved antioxidanters evne til at reducere jern(Fe3) i jern(III)chlorid til jern(Fe2 plus ). Generelt tilskrives de reducerende egenskaber tilstedeværelsen i planteekstrakter af reduktoner, som er anerkendt for at udøve deres virkning ved at bryde den frie radikalkæde ved at donere et hydrogenatom [41].

Figur 2D viser dosis-respons-kurven for den reducerende kraft af E. fragilis-ekstrakter. Det er kendt, at jo højere absorbans ved 700 nm, jo ​​større reduktionsevne. I den aktuelle undersøgelse udviste CEE og dets fem fraktioner betydelig reducerende kraft på en koncentrationsafhængig måde.

EAF viste maksimal antioxidantaktivitet (EC{{0}}.136± 0.{{10}}13 mg/mL) sammenlignet med VC(EC{{4) }}.083± 0.005 mg/mL). Dette blev tæt fulgt af WBF (EC50=0.180 ± 0,028 mg/mL), DMF (EC50=0.319 ± 0,031 mg/mL), CEE (EC50=0.334±0.029mg/mL) og WF(EC50=0.398±0,064 mg/mL) .HF fulgte bagud og viste minimal reducerende effektaktivitet (EC5s0 =0.626±0,068 mg/mL) sammenlignet med andre fraktioner. Disse resultater tyder på, at EAF kan indeholde forskellige individuelle forbindelser, der har en effektiv og potent reducerende kraftaktivitet. Forskere har fundet ud af, at ethylacetatekstrakter kan tjene som stærke antioxidanter [42].

Positiv korrelation blev observeret mellem reducerende effekt og både TP- og TF-indhold (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Phosphomolybdæn-assay

TAC for CEE og dets fraktioner samt VC blev evalueret ved hjælp af phospho-molybdæn-assayet og udtrykt som EC'er0, hvilket er den koncentration, der giver 0.5 af absorbans. Metoden var baseret på reduktion af Mo(VI) til Mo(V) ved hjælp af ekstrakter for at danne et grønt fosfat/Mo(V)-kompleks ved sur pH med maksimal absorption ved 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(s<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Der blev observeret en meget signifikant sammenhæng mellem total antioxidantaktivitet og både TP-indhold og TF-indhold (r=0.978 for begge;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -Caroten-linoleat modelsystem

I -caroten-linolsyre-modellen gennemgår de stærkt umættede -carotenmolekyler hurtig misfarvning på grund af linoleat frie radikaler dannet ved oxidation af linolsyre [44]. Tilskud med antioxidanter kunne minimere -carotenoxidation ved at neutralisere frie linoleatradikaler og dermed hæmme -carotenblegning [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF viste minimum IC50 værdi(IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 mg/mL) sammenlignet med BHT (ICs { {5}}.049 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. VI. og HF viste forholdsvis højere ICs0-værdier på 0,5±0,111 mg/mL, 0,998 ± 0,101 mg/mL, 1,073± 0,084 mg/mL, 1,402±0,058 mg/mL, og 2,209±0,081 mg/ml, hhv.

En signifikant korrelation på en positiv måde blev observeret mellem -carotenoxidationsopfangning og både TP-indhold (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC og -caroten. Derfor viste vi, at de potente antioxidantaktiviteter af CEE og dets fraktioner udviste højere rensende aktiviteter, og dette kan stærkt skyldes deres sammensætning fra phenolsyre og flavonoider såsom gallussyre, rutin og quercetin.