DEL 1 Antioxidant og antikoagulerende virkninger af phenylpropanoidglycosider isoleret fra broomrapes (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria og P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

et universitet i Ło'd'z, Institut for Generel Biokemi, Det Biologiske Fakultet og Miljøbeskyttelse, 90-236 Ł'od'z, Polen

b Institut for Biokemi og Afgrødekvalitet, Institut for Jordbundsvidenskab og Plantedyrkning, Statens Forskningsinstitut, 24-100 Puławy, Polen

Center for Forskning og Bevarelse af Biodiversitet, Institut for Miljøbiologi, Biologisk Institut, Jan Kochanowski Universitet, 25-406 Kielce, Polen

Abstrakt

Holoparasitiske planter af Orobanchaceae, herunderCistanche, Orobanche og Phelipanche spp, er kendt for deres rigdom af phenylpropanoid glycosider (PPG'er). Mange PPG-forbindelser har vist sig at besidde et bredt spektrum af aktiviteter, såsom antimikrobielle, antiinflammatoriske, antioxidante og hukommelsesforbedrende. For bedre at udforske bioaktivitetspotentialet i europæiske broomrapes (O. Caryophyllaceae - OC, P. Arenaria - PA, P. ramosa - PR) og ti enkeltisolerede phenylpropanoidbestanddele undersøgte vi deres antiradikale virkning, beskyttende virkning mod oxidation i plasma in vitro-systemet og indflydelse på koagulationsparametre. De testede ekstrakter viste en oprensningsaktivitet på 50-70% af Trolox's effekt. OC-ekstraktet, rig påacteosid, havde over 20 % bedre antiradikalt potentiale end PR-ekstrakt, som var det eneste, der indeholdt PPG'er, der manglede en B-ring catechol moiety i acylenheden. Desuden blev det konstateret, at kun otte testede PPG'er viste antioxidantpotentiale i humant plasma behandlet med H2O2 / Fe; De tre testede PPG'er havde imidlertid antikoagulerende potentiale ud over antioxidantegenskaber. Det ser ud til, at strukturen af PPG'er, især tilstedeværelsen af acyl- og catechol-moieties, hovedsageligt er relateret til deres antioxidantegenskaber. Det antikoagulerende potentiale af disse forbindelser er også relateret til deres kemiske struktur. Udvalgte PPG'er udviser potentialet for behandling af hjerte-kar-sygdomme forbundet med oxidativ stress.

For mere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosa har mange effekter

1. Indledning

Oxidativ stress er kendt for sin negative indvirkning på levende organismers sundhed, herunder accelereret aldring og nogle kræftformer. Forekomsten af oxidativ stress er forbundet med en forstyrret balance mellem de oxidative og antioxidative mekanismer (herunder enzymatisk (katalase, glutathionperoxidase) og ikke-enzymatisk (glutathion) forsvar) i kroppens celler [1]. Overproduktionen af reaktive iltarter (ROS), herunder oxiderende radikaler og lukkede skalarter, er en af de vigtigste mekanismer bag dannelsen af oxidativ stress. Den biologiske virkning forårsaget af ROS afhænger imidlertid i vid udstrækning af koncentrationen, eksponeringstidspunktet og placeringen. Under normale forhold (lav koncentration) kan ilt / nitrogenradikaler spille rollen som sekundære budbringere, men på det højere niveau kan de begynde at reagere med biologiske strukturer, som cellemembraner [2]. Blandt alle ROS-arter forårsager et hydroxylradikal (HO.) en af de største skader på biomakromolekyler: proteiner, lipider og DNA. Oxidativ stress er kendt for at spille en vigtig rolle i en række sygdomme, herunder kardiovaskulære. Forstyrrelser i blodsystemet er blevet korreleret og /eller forud for ændringer i forskellige parametre for hæmostase og plasmabiomarkører [1,3].

På den anden side er mange naturlige stoffer, såsom polyfenoler og flerumættede fedtsyrer, blevet identificeret som potente antioxidanter, der er i stand til at forhindre dannelsen og / eller mindske reaktive iltarter. Forbindelser med sådanne egenskaber findes i mange fødevarer og farmaceutiske præparater af vegetabilsk oprindelse. En kost beriget med friske grøntsager og frugter og antioxidative terapier baseret på naturlige antioxidanter anbefales derfor bredt, da de kan reducere niveauet af oxidativ stress og forhindre forskellige patofysiologiske processer [4,5]. Plantepolyfenoler er en forskelligartet gruppe af sekundære metabolitter, blandt hvilke phenolsyrer indtager et vigtigt sted, da de er bredt fordelt og udviser en række biologiske virkninger, såsom antimikrobielle, antioxidante og antiinflammatoriske. Phenylpropanoidglycosider (PPG'er) er esterde- slægtninge til hydroxycinnaminsyre, og de er den vigtigste/eneste klasse af sekundære metabolitter, der er til stede i holoparasitiske Orobanchaceae-planter, herunderCistanche, Orobanche og Phelipanche spp. Flere arter af denne familie er alvorlige skadedyr af afgrøder, som landmændene ønsker at slippe af med i markerne (eksempel på Phelipanche ramosa), få anvendes i farmakologi, mens de fleste er af ringe betydning for mennesker. HerbaCistancheanvendes i vid udstrækning i asiatisk traditionel medicin til behandling af nyremangel og som et immunitets- og hukommelsesforbedrende, anti-aging og antifatigue middel [6]. Fytokemiske analyser fra forskellige forskergrupper har vist, at phenylpropanoidglycosider, såsom acetonid, echinacosid og podiumside, er en af de vigtigste aktive ingredienser i Herba Cistanche [7]. En nylig undersøgelse af flere broomrape-arter fundet i Polen af Jedrejek et al. [8] har vist, at dette plantemateriale har en lignende kvalitativ sammensætning (dominans af PPG'er), og det er desuden lig med eller endda overstigerCistanchespp. med hensyn til indholdet af aktivstoffer [8].

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

Den foreliggende undersøgelse havde til formål at evaluere det antiradikale og antioxidante potentiale samt indflydelsen på hæmostaseparametre af de tre broomrapeekstrakter (Orobanche Caryophyllaceae - OC, Pheli- panache Arenaria - PA og P. ramosa - PR) rig på forskellige phenyl-

prostanoider, såvel som deres enkelte PPG-bestanddele. Den antiradikale kapacitet blev målt ved anvendelse af 2,2′-azinobis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsyre/troloxækvivalent (ABTS/TE) og 2,2-diphenyl-1-picrylhybrazil (DPPH) test. Den oxidative stress i plasmatestsystemet blev induceret under anvendelse af et hydroxylradikal (H2O2 / Fe), derefter lipidperoxidation (thiobarbiturinsyre-reaktive arter (TBARS) assay), og niveauet af proteincarbonyl- og thiolgrupper blev målt. Blandt de bestemte parametre for hæmostase var: aktiveret partiel tromboplastintid (APTT), protrombintid (PT) og trombintid (TT).

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylradikale (DPPH), 2,2′-azinobis-3-eth- ylbenzthiazolin-6-sulfonsyre (ABTS), kaliumpersulfat, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylsyre (Trolox), dimethylsulfoxid (DMSO), thiobarbitursyre (TBA), myresyre (LC-MS-kvalitet) og H2O2 blev købt hos Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA). Methanol (HPLC gradient grade) og acetonitril (LC-MS grade) blev erhvervet fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Ti phenyl-

propanoiske forbindelser testet i dette arbejde, herunder 2′-O-acetylacteosid (97%), 2′-O-acetylpoliumosid (98%), 3-O-methylpoliumosid (96%), acetonid (99%), arena indeni (97%), crenatosid (98%), teniposid (99%), poliumosid (99%), tubulosid A (96%) og wiedemanniosid D (96%) blev tidligere isoleret af os fra nedenstående plantemateriale [8]. Renheden af forbindelser blev vurderet ved hjælp af en UHPLC-PDA-MS-analyse. Ultrarent vand blev tilberedt internt ved hjælp af et Milli-Q vandrensningssystem (Millipore Co.). Andre reagenser var af analytisk kvalitet og blev leveret af indenlandske kommercielle leverandører.

2.2. Plantemateriale

Blomstrende planter af tre broomrape arter, herunder Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel og P. Ramos (L.) Pomel blev identificeret af prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski Uni- versity, Kielce, Polen) og indsamlet fra en naturlig kilde i Polen.

Kuponprøver (O. Caryophyllaceae - Chomento'wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), xeroterme græsarealer, parasiterer Galium boreale, maj 2014; P. Arenaria - Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), psammoma- lous græsarealer og brak, parasiterer Artemisia campestris, juni 2014;

P. ramosa - Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), felt, parasitere Solanum Lycopersicum, september 2014) deponeres på herbariet ved Jan Kochanowski Universitet i Kielce (KTC). Plantematerialet blev lyofiliseret og finmalet før ekstraktion.

2.3. Fremstilling af ekstrakter af

Pulveriseret plantemateriale (O. Caryophyllaceae (OC) - 2 g, P. Arenaria (PA) - 3 g og P. ramosa (PR) - 3 g) blev ekstraheret med 80% MeOH ved 40 ◦C og 1500 psi (opløsningsmiddeltryk) under anvendelse af en ASE 200 accelereret

opløsningsmiddelekstraktor (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Ekstrakterne blev fordampet og frysetørret (Gamma 2-16 LSC frysetørrer, Christ, Tyskland). Ekstraktionseffektiviteten for OC, PA og PR var henholdsvis 55%, 37% og 43 vægtprocent af plantematerialet. På grund af det høje indhold af kulhydrater (data ikke vist) blev de rå ekstrakter yderligere renset ved fastfaseekstraktion (SPE) på Oasis HLB-mikrokolonne (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Sukkerstofferne blev fjernet med 1% MeOH, hvorefter rentestoffer blev elueret med 80% MeOH. Efter fjernelse af opløsningsmidlet blev OC-, PA- og PR-ekstrakterne lyofiliseret (Gamma 2-16 LSC frysetørrer), og udbyttet af SPE-rensning var 53% (OC), 67% (PA) og 51% (PR).

2.4. Fytokemiske egenskaber ved ekstrakter af

Kvalitative og kvantitative analyser af broomrapeekstrakter blev udført ved hjælp af et ACQUITY UPLC-system (Waters) forbundet med en fotodiode array-detektor (PDA) og et tandem quadrupolmassespektrometer (TQD-MS/MS). Frysetørrede OC-, PA- og PR-ekstrakter blev opløst i 50% methanol i en koncentration på 0,50 mg/ml og derefter

kromatograferet på BEH C18-kolonnen (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, vand). Kromatografiske forhold var som følger: ovntemperatur – 25 ◦C,

lineær gradient 10→25% af mobil fase B (0,1% myresyre i acetonitril) i mobil fase A (0,1% myresyre i H2O) over 12 minutter, strømningshastighed - 0,4 ml / min, injektionsvolumen - 2 μL, UV-rækkevidde - 190-490 nm (3,6 nm opløsning). MS-analysen blev udført i negativ iontilstand med elektrosprayionisering (ESI) ved hjælp af følgende indstillinger: scanningsområde 100-1200 m / z; kapillærspænding 2,8 kV; keglespænding 35 V;

kildetemperatur 150 ◦C; isoleringstemperatur 450 ◦C; desolvation

gasstrøm 900 L/h og keglegasstrøm 100 L/h. Dataindsamling og -behandling blev udført ved hjælp af Waters MassLynx 4.1-software.

Phenylpropanoid glycosid (PPG) toppe blev identificeret ved sammenligning af de opnåede LC-MS data med dem af tidligere isolerede forbindelser [8]. Kvantiteten af PPG'er i broomrapeekstrakter var baseret på UPLC-UV-metoden med detektion ved 330 nm og en ekstern standardkalibrering ved hjælp afacteosid(Sigma-Aldrich, 99%, HPLC) som

gruppe standard. En lineær kalibreringskurve blev fremstillet i seks koncentrationer inden for området 1-200 μg/ml og viste god linearitet (R2

0,999). Kvantitative resultater repræsenterer den gennemsnitlige SD-værdi af tre injektioner og blev udtrykt som milligramacteosidækvivalenter (eq) pr. gram ekstrakt (mgacteosideq/g).

2.5. Antiradikal aktivitet in vitro

2.5.1. ABTS radikalt oprensningsassay

ABTS antiradikale test blev udført ved anvendelse af den metode, der er beskrevet af Kontek et al. [9], med små ændringer som følger: 20% MeOH blev anvendt til fremstilling af reagenser (7 mM ABTS og 4,9 mM kalium per-

sulfat); opløsningerne af OC-, PA- og PR-ekstrakter ved fire koncentrationsniveauer i området 100-400 μg/ml og Trolox-opløsninger ved seks koncentrationsniveauer i området 10 250 μg/ml blev fremstillet med 50 % MeOH. Andelen af prøve til ABTS-arbejdsløsning var 1:25 (v/v). Absorbansen ved 734 nm blev målt efter 30 minutters inkubation

i mørke ved hjælp af et UV-vis spektrofotometer (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

Absorbanshæmningen (%) blev beregnet som følger: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Trolox-ækvivalenterne (TE) af broomrapes' ekstrakter blev beregnet

ved hjælp af formlen TE = msample/mstandard, hvor m er hældningen af den lige

linjekurver (absorbanshæmning vs. koncentration). TE-værdien af

prøven beskriver sin normaliserede aktivitet mod Trolox (TEstandard =

1.0). IC50-værdierne for OC-, PA- og PR-ekstrakter og Trolox var

nået eksperimentelt og derefter beregnet ud fra deres lige linje

kurver (absorbanshæmning vs. koncentration) og udtrykkes i

μg/ml.

Assayet blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne præsenteres

som betyder ± standardafvigelser (SD).

2.5.2. DPPH radikalt oprensningsassay

DPPH-antiradikale test blev udført ved anvendelse af den metode, der er beskrevet af Jedrejek et al. [8] og Brand-Williams et al. [10], med små ændringer som følger: opløsningerne af OC-, PA- og PR-ekstrakter ved fire koncentrationsniveauer i området 50▽ 250 μg / ml og Trolox-opløsninger ved seks koncentrationsniveauer i området 10▽ 250 μg / ml, blev tilberedt med 50% MeOH. Andelen af prøven til DPPH var 1:19 (v/v). Absorbansen ved 517 nm blev målt efter 30 minutters inkubation i mørke ved hjælp af et UV-vis spektrofotometer (Evolution 260 Bio). Absorbanshæmningen (%) blev beregnet som følger: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Trolox-ækvivalenten (TE) og IC50-værdierne for testprøver blev beregnet på samme måde som i ABTS-testen (punkt 2.5.1). Assayet blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne præsenteres som midler ± SD.

2.6. Stamopløsninger af testede planteforbindelser og ekstrakter til forsøg med humant plasma

Stamopløsninger af de testede forbindelser og planteekstrakter blev fremstillet i 50% DMSO. Den endelige koncentration af DMSO i de testede prøver var lavere end 0,05%, og dens virkninger blev bestemt i alle forsøg.

2.7. Isolering af humant plasma

Humant blod eller plasma blev opnået fra seks regelmæssige donorer (ikke-rygende mænd og kvinder) til en blodbank (Lodz, Polen) og et medicinsk center (Lodz, Polen). Blod blev indsamlet som en CPD-opløsning (citrat/fosfat/dextrose; 9:1; v/v blod/CPD) eller CPDA-opløsning (citrat/fosfat/dextrose/adenin; 8,5:1; v/v; blod/CPDA). Donorerne havde ikke taget medicin eller vanedannende stoffer (herunder tobak, alkohol og antioxidanttilskud) i mindst to uger før en donation. Vores analyse af blodprøverne blev udført i henhold til retningslinjerne i Helsinki-erklæringen for menneskelig forskning og godkendt af Komitéen for Etik for Forskning i Human Experimentation ved University of Lodz. Plasma blev fremstillet ved centrifugering af frisk humant blod ved 4500x g i 25 minutter ved stuetemperatur. Proteinkoncentrationen blev beregnet ved at måle absorbansen af de testede prøver ved 280 nm i henhold til proceduren for Whitaker og Granum [11].

2.8. Markører for oxidativ stress i humant plasma

2.8.1. Måling af lipidperoxidation

Plasmalipidperoxidation blev kvantificeret ved at måle koncentrationen af thiobarbitursyrereaktive stoffer (TBARS). TBARS-koncentrationen blev beregnet ved hjælp af den molære udryddelseskoefficient (ε = 156.000 M 1 cm 1 ). Metoden beskrives mere grundigt ellers var [12,13]. 2.8.2. Måling af carbonylgruppe Niveauet af carbonylgrupper blev beregnet ved anvendelse af molar udryddelseskoefficienten (ε = 22.000 M 1 cm1 ) og blev udtrykt som nmolcarbonylgrupper / mg plasmaprotein ifølge Bartosz [13] og Levine et al. [14]. 2.8.3. Bestemmelse af thiolgruppe thiolgruppen i plasmaproteiner blev målt spektrofotometrisk ved anvendelse af en SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Tyskland) ved absorbans ved 412 nm med 5,5′ -dithiol-bis-(2- nitrobenzoesyre). Metoden er nærmere beskrevet andetsteds [15-17].

2.9. Parametre for hæmostase

2.9.1. Måling af protrombintid (PT)

PT blev bestemt koagulometrisk ved anvendelse af en optisk koagulation

Bogstaver angiver resultaterne af Tukeys test (p< 0.05),="" values="" with="" the="">

bogstav inden for en række er ikke væsentligt anderledes.

2.9.2. Måling af thrombintid (TT)

TT blev bestemt koagulometrisk ved hjælp af en optisk koagulationsanalysator (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polen) i henhold til metoden beskrevet af Malinowska et al. [18].

2.9.3. Måling af aktiveret partiel tromboplastintid (APTT)

APTT blev bestemt koagulometrisk ved hjælp af en K-3002 optisk koagulationsanalysator (Kselmed, Grudziadz, Polen) ifølge Malinow ska et al. [18].

2.10. Dataanalyse Q-Dixon-testen blev udført for at eliminere usikre data.

Dataene blev testet for normal fordeling med Shapiro-Wilk-testen og lighed i varians med Levenes test. Statistisk signifikante forskelle blev identificeret ved hjælp af ANOVA, efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest eller Kruskal-Wallis-testen. Sammenligninger blev betragtet som signifikante ved p< 0.05.="" the="" values="" are="" presented="" as="" means="" ±="">