DEL 1 Acteosid undertrykker RANKL-medieret osteoklastogenese ved at hæmme C-Fos-induktion og NF-KB-vej og dæmpe ROS-produktion

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Sea Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Research Institute of Clinical Medicine ved Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, Sydkorea, 2 Department of Orthodontics, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South Korea, 3 Institut for Bioaktive Materialer, Forskningscenter for Bioaktive Materialer, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Sydkorea

Abstrakt

Talrige undersøgelser har rapporteret, at inflammatoriske cytokiner er vigtige mediatorer for osteoklastogenese, og derved forårsager overdreven knogleresorption og osteoporose.Acteosid, den vigtigste aktive forbindelse afRehmannia glutinosa, som bruges meget i traditionel orientalsk medicin, har antiinflammatoriske og antioxidante potentialer. Det fandt vi i denne undersøgelseakteosidmarkant hæmmede osteoklastdifferentiering og dannelse fra knoglemarvsmakrofager (BMM'er) og RAW264.7 makrofager stimuleret af receptoraktivatoren af ​​nuklear faktor-kappaB (NF-kB) ligand (RANKL). Acteosid-forbehandling forhindrede også knogleresorption af modne osteoklaster på en dosisafhængig måde.Acteosid(10 mM) svækkede RANKL-stimuleret aktivering af p38-kinase, ekstracellulære signal-regulerede kinaser og c-Jun N-terminal kinase og undertrykte også NF-kB-aktivering ved at hæmme phosphorylering af p65-underenheden og inhibitoren kBa. Derudover RANKL-medierede stigninger i ekspressionen af ​​c-Fos og nuklear faktor af aktiverede T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) og i produktionen af ​​tumornekrosefaktor-a, interleukin (IL)-1b , og IL-6 blev tilsyneladende hæmmet af acteosid-forbehandling. Yderligere mundtligakteosidreduceret ovariektomi-induceret knogletab og inflammatorisk cytokinproduktion for at kontrollere niveauer. Vores data tyder på detakteosidhæmmer osteoklastdifferentiering og modning fra osteoklastiske prækursorer ved at undertrykke RANKL-induceret aktivering af mitogenaktiverede proteinkinaser og transkriptionsfaktorer såsom NF-kB, c-Fos og NFATc1. Samlet tyder disse resultater på detakteosidkan virke som et anti-resorptivt middel til at reducere knogletab ved at blokere osteoklastaktivering.

For mere information kontakt venligst:emily.li@wecistanche.com

Introduktion

Knogle omdannes konstant af balanceret osteoklast- og osteoblastaktivitet [1]. Osteoklaster opstår fra hæmatopoietiske precursorceller af monocyt/makrofage-slægten, mens osteoblaster er af mesenchymal-slægt [2]. Abnormalosteoklastaktivering eller reduceret osteoblastogenese kan forstyrre knoglehomeostase og i sidste ende forårsage sygdomme som osteoporose, arthritis og knoglekræft [3,4]. Osteoporose er en almindelig knoglesygdom, der fører til en øget risiko for fraktur. Den mest almindelige form for osteoporose er forårsaget af østrogenmangel hos kvinder i overgangsalderen. Medicin som kortikosteroider og antiepileptika kan også forårsage ubalance mellem knogleresorption og dannelse, hvilket kan resultere i osteoporose [5]. Mange anti-resorptive inhibitorer, herunder bisphosphonater, calcitonin, østrogen og selektive østrogenreceptormodulatorer, er blevet brugt til at behandle osteoporose. Disse inhibitorer opretholder knoglemassen ved at hæmme osteoklastfunktionen [6]. Østrogenerstatningsterapi er den mest populære behandling til at forebygge og behandle postmenopausal osteoporose. Imidlertid kan langvarig østrogenerstatningsterapi øge risikoen for endometrie- og brystkræft. Derfor har mange efterforskere fokuseret deres indsats på at udvikle et nyt anti-resorptivt middel, der ikke har bivirkninger [7-10]. Fordi osteoklaster fungerer i knogleresorption, er specifikt inhiberende osteoklaster blevet betragtet som hovedmålet i adskillige undersøgelser. Osteoklaster er multinukleære kæmpeceller dannet af mononukleære progenitorer af monocyt/makrofager-familien via sekventiel proliferation, differentiering og fusion af hæmatopoietiske precursorceller [11]. Makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og receptoraktivator af nuklear faktor (NF)-kB (RANK)ligand (RANKL) er væsentlige faktorer for osteoklastdifferentiering[12]. Derudover bidrager adskillige inflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin (IL)-1b, til osteoklastogenese ved at modulere induktionen af ​​RANKL, osteoprotegerin og M-CSF [7,13]. RANKL-binding til celleoverflade-RANK-receptoren resulterer i RANKL/RANK/TNFR

associerede faktorer (TRAF) komplekser, der sekventielt aktiverer NFkB og mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK'er), herunder cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase og ekstracellulær signalrelateret kinase (ERK) [14]. Denne aktivering spiller en nøglerolle i at mediere osteoklastdifferentiering, aktivering og overlevelse.RANKL aktiverer også ekspressionen af ​​transkriptionsfaktorer såsom nuklear faktor af aktiverede T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) og-Fos, som er essentielle for osteoklastudvikling [ 7,9]. Derfor betragtes RANKL-signalering som hovedmålet for anti-resorptive midler, der undertrykker osteoklastaktivering og er knogleløse.Acteosider den vigtigste aktive forbindelse af Rehmannia glutinosa, som bruges meget i traditionel orientalsk medicin [15,16].Acteosider en stærk antioxidant og har antihepatotoksiske, antiinflammatoriske og anti-nociceptive aktiviteter [17-20]. Det har vi tidligere fundetakteosidreducerer tyrosinaseaktivitet og melaninbiosyntese ved at regulere ERK-signalering [21], beskytter mod reaktive oxygenarter (ROS)-medieret tandkødsskade[22], og undertrykker mykotoksin-medieret celleskade [23]. Disse effekter er tæt forbundet medakteosid's evne til at fjerne ROS og regulere MAPK-medieret signalering. Især foreslås ROS til at formidle RANKL-inducerede signalveje og cellulære hændelser i osteoklaster. Forbehandling med antioxidanter hæmmede RANKL-induceret aktivering af NF-kB, ERK og IkBa og undertrykkede derved osteoklastogenese [24]. Disse resultater tydede stærkt på, at ud over anti-inflammatorisk aktivitet og antioxidantaktivitet er afgørende for et anti-resorptivt middel, såledesakteosidkan undertrykke RANKL-induceret osteoklastogenese. I nærværende undersøgelse undersøgte vi omakteosidhar en terapeutisk effekt på knogletab. Vi undersøgte virkningerne afakteosidom osteoklastdifferentiering og knogleresorption og de relaterede cellulære mekanismer ved anvendelse af in vitro og in vivo eksperimentelle systemer.

akteosid

Materialer og metoder

Etikerklæring

Dyrepleje og -brugspraksis blev godkendt af Chonbuk National University Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (tilladelsesnr. CBU 2010-0007). Alle forsøg i denne undersøgelse blev udført i henhold til retningslinjerne fra dyrepleje- og brugsudvalget på universitetet.

Mus, kemikalier og laboratorieartikler

Fire uger gamle ICR-hunmus blev købt fra OrientBio Inc. (Seoul, Korea) og anbragt ved 2261uC og 5565 procent luftfugtighed i en 12 timers lys/mørke-cyklus med fri adgang til mad og vand. Acteosid (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranosid; C29H36O15) (Fig. S1) blev isoleret fra Rehmannias blade glutinosa. Acteosid blev opløst i phosphatpufret saltvand (PBS) før brug. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 og M-CSF blev købt fra R&D-systemer (Minneapolis, MN, USA). Antistoffer specifikke for c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa og b-actin blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antistoffer for p-p38 og p38 blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). CalciumAssay og Osteocalcin (OC) EIA Kits blev købt fra henholdsvis BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) og Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), for at bestemme serum biokemiske parametre. Muse-tartrat-resistent sur phosphatase (TRAP) assay kit (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) blev også brugt til at måle serum TRAP5b niveau. Medmindre andet er angivet, blev yderligere kemikalier opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), og laboratorievarer var fra SPL Life Sciences (Pochun, Sydkorea).

Cellekulturer

Knoglemarvsceller blev opnået fra tibiae og femora af 6 uger gamle hun-ICR-mus ifølge metoder beskrevet tidligere [25]. Knoglemarvssuspensionen blev inkuberet i en 100-mm kulturskål i nærværelse af 50 ng/ml M-CSF. Efter 3 dage blev adhærente celler brugt som knoglemarvsmakrofager (BMM'er) for at inducere osteoklastisk differentiering. Nogle knoglemarvsceller blev også inkuberet i 48 timer uden M-CSF, og adhærente celler blev dyrket i et osteoblast-differentierende medium, som beskrevet andetsteds [25]. RAW264.7 makrofagceller blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L glutamin og antibiotika. Disse celler blev brugt som en modstykke cellelinje for BMM'er til at udforske virkningen af ​​acteosid på osteoklastogenese.

Osteoklastisk differentiering og TRAP-farvning

BMM'er blev forbehandlet med forskellige koncentrationer (0-50 mM) af acteosid i 2 timer før stimulering med 100 ng/ml RANKL. Kulturmedier blev erstattet med friske medier på dag 2 og 5. Efter 7 dages inkubation blev kulturerne fikseret i 4 procent PBS-pufret paraformaldehyd og farvet med TRAP under anvendelse af et sigma Aldrich-kit i henhold til producentens instruktioner. TRAP-positive celler blev talt ved hjælp af optisk mikroskopi, og celler indeholdende 3 eller flere kerner blev anset for at være osteoklaster.RAW 264.7 celler blev også udsat for 100 ng/ml RANKL efter forbehandling med acteosid i 2 timer og efter 7 dages inkubation, cellerne blev behandlet til TRAP-farvning.

Måling af cellelevedygtighed

Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af et vandopløseligt tetrazoliumsalt (WST)-8-reagens. Kort fortalt blev BMM'er eller RAW264.7-celler dyrket i et vækstmedium indeholdende 10 procent FBS og antibiotika behandlet med 10 mM acteosid eller phenoliske forbindelser såsom quercetin, luteolin, apigenin eller epigallocatechin-3-gallat (EGCG). WST-8-reagens blev tilsat til kulturerne efter 48 timers inkubation. Efter inkubation i yderligere 4 timer blev den WST-8-specifikke absorbans målt ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Knogleresorptionsanalyse

BMM'er (16105 celler/ml) blev suspenderet i a-MEM indeholdende 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL og derefter delt på tværs af en 24-brøndsplade coatet med calciumphosphat nanokrystaller (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Sydkorea) ved en tæthed på 26104 celler/cm2 med og uden acteosid. Efter inkubering i 7 dage blev cellerne fjernet fra pladerne med 5% natriumhypochlorit, og grubedannelse blev observeret under et optisk mikroskop. Det resorberede område blev også målt med en billedanalysator og udtrykt som en procentdel af kontrolværdien.

Western Blot Analyse

Hele proteinlysater blev fremstillet i en lysisbuffer som beskrevet andetsteds [26]. Cytosoliske og nukleare proteiner blev fremstillet som beskrevet tidligere [25]. Lige store mængder proteinekstrakt blev adskilt med 12-15 procent SDS-PAGE og blottet på polyvinyldifluoridmembraner. Blottene blev probet med primære antistoffer natten over ved 4uC før inkubation med sekundært antistof i blokerende buffer i 1 time. Blottene blev udviklet med forstærket kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) og eksponeret for røntgenfilm (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

MAPK aktivitetsanalyse

Celler blev forbehandlet med acteosid i 2 timer og derefter stimuleret med RANKL i yderligere -30 min. MAPK-aktiviteter blev bestemt under anvendelse af immunometriske assay-sæt, såsom p-p38kinase-assay-kittet (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK-enzym-assay-kit (Assay Designs) og p-SAPK/JNK sandwich ELISA-kit ( Cell Signaling Technology, MA, USA). Alle procedurer fulgte producentens instruktioner, og absorbansen blev målt med en mikropladelæser.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA-proteinbindingsreaktioner blev udført i 3 0 min ved stuetemperatur med 10-15 mg protein i 20 ml buffer indeholdende 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 procent glycerol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM af [a-32P] dCTP-mærkede oligonukleotider og Klenow-fragmentet af DNA-polymerase. Prøverne blev adskilt på 6 procent polyacrylamidgeler, som blev tørret og udsat for røntgenfilm (Eastman Kodak Co.) i 12-24 timer ved 270uC. Oligonukleotidprimersekvenserne specifikke for NF-var 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 og 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB Luciferase Assay

RAW264.7-makrofager i 24-brøndsplader blev transficeret med 0,8 mg kB-luciferase-reportervektor under anvendelse af 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. 24 timer efter transfektion blev cellerne stimuleret med RANKL i nærvær og fravær afakteosidi 24 timer. Celler blev resuspenderet i 100 ml reporterlysebuffer (Promega, Madison, WI, USA). Lige store mængder af proteinprøver blev anbragt i 96-brønds mikroplader og blandet med luciferasesubstrat. Luminescens blev målt ved anvendelse af et mikropladeluminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). I dette eksperiment blev et permeabelt NF-B-inhibitorpeptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) anvendt som en positiv kB-hæmmer.

Måling af cytokiner

BMM'er eller RAW264.7-celler blev stimuleret med RANKL i nærvær af acteosid i 24-brøndskulturplader. Efter 48 timers inkubation blev kultursupernatanter opsamlet og vurderet ved ELISA under anvendelse af TNF-a-, IL-1b- og IL-6-specifikke OptEIATM-kits i henhold til producentens instruktioner.

Real-time omvendt transkription-polymerase kædereaktion (RT-PCR)

mRNA-ekspressionen af ​​osteoklastiske markører, såsom c-Fos, NFATc1 og TNF-a, blev bestemt ved real-time RT-PCR. Kort fortalt blev totalt RNA ekstraheret fra makrofager med Trizolreagens i overensstemmelse med producentens instruktioner (Invitrogen). cDNA blev syntetiseret med 1 mg totalt RNA under anvendelse af SuperScript Reverse Transcriptase II og primere (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) blev brugt til at detektere akkumulering af PCR-produkt under cykling med ABI 7500 sekvensdetektionssystemet (AppliedBiosystems). Efter denaturering ved 95uC i 10 minutter var PCR

Måling af intracellulær ROS

En stamopløsning af 29,79-dichlordihydrofluorescein-diacetat(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) blev fremstillet i DMSO og opbevaret ved 220uC i mørke. Kort fortalt blev BMM'er (106 celler/ml i 6-brøndsplader) dyrket med 50 ng/MLM-CSF i 24 timer og derefter behandlet med forskellige koncentrationer (0-10 mM) af acteosid 2 timer før stimulering med 100 ng/mlRANKL. Efter 1 times co-inkubation blev disse celler efterfølgende inkuberet med 25 mM DCFH-DA i 30 min. Den grønne fluorescens af 29,79-dichlorfluorescein (DCF) blev registreret ved 515 nm (FL 1) ved hjælp af et FACS VantageH-system (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) og 10,000 begivenheder blev talt pr. prøve.

Induktion af ovariektomi-induceret osteoporose

ICR-hunmus (6 uger gamle) blev brugt til denne undersøgelse. Mus modtog en falsk operation (Sham, n=10) eller kirurgisk ovariektomi (OVX, n=20) under anæstesi. En uge efter operationen blev OVX-musene tilfældigt opdelt i 2 grupper på 10 mus hver: bilateral OVX og bilateral OVX suppleret med 200 ml PBS indeholdende 1 mM acteosid oralt (AC-gruppe). Mundtligakteosidblev administreret én gang hver 3. dag i 8 uger efter operationen, og den samme mængde PBS blev administreret til Sham- og OVX-grupperne. Efter 1 dag efter den sidste administration blev mus aflivet, og derefter blev biokemiske parametre i serum og 3-dimensionel knoglestruktur analyseret.

Bestemmelse af serum biokemiske parametre

Blodprøver blev opsamlet via hjertepunktur, og serum blev opsamlet ved centrifugering. Serumprøver blev opbevaret ved 280uC til analyser af biokemiske parametre. Serumniveauerne af IL-1b og IL-6 blev estimeret ved at bruge ELISA-kittet som beskrevet ovenfor, mens alkalisk phosphatase (ALP) aktivitet blev bestemt ved at bruge et biokemisk kolorimetrisk assay, der måler mængden af ​​p -nitrophenol produceret fra et p-nitrophenolphosphatsubstrat, som beskrevet andetsteds [27]. For at estimere biomarkørerne for knogledannelse og resorption blev serum-OC, calcium og TRAP5b-niveauer også bestemt i henhold til producentens instruktioner.

Analyser af knoglestruktur og morfometriske parametre

Lårbenet hos mus (Sham-, OVX- og AC-grupper) blev dissekeret og fyldt med fysiologisk saltvand til mekanisk testning. Den mekaniske styrke af lårbenet blev målt som beskrevet andetsteds [28]. Frakturbelastningen blev registreret som spidskraften i newton på det punkt, hvor midtskaftet af højre lårbensbrud. Derudover blev det lette lårben fra hvert dyr histomorfometrisk analyseret under anvendelse af et mikrocomputertomografi (mikro-CT) system (SkyScan 1076 mikrofokus røntgensystem, Kontich, Belgien). Kort fortalt blev knoglerne i 4 procent formaldehyd-opbevaring tørret overfladisk på papirservietter, før de blev pakket ind i plastik-''husholdningsfilm'' eller i parafilm for at forhindre udtørring under scanning. Hver plastikindpakket knogle blev anbragt i plastik/polystyrenskumrør, som blev monteret lodret vandret i 1076 scannerprøvekammeret til mikro-CT-billeddannelse. Scanning blev udført ved anvendelse af 100 kV kildespænding og 140 mA kildestrøm med 35 mm opløsning. Tredimensionelle modeller af lårbenets trabekulære knogler blev rekonstrueret ved hjælp af SkyScan CT Analyzer version 1.11. De strukturelle parametre såsom trabekulær knoglemineraltæthed (BMD, g/cm3), procent knoglevolumen (knoglevolumen (BV)/vævsvolumen (TV), procent ), tykkelse (Tb.Th, mm), separation (Tb.Sp) , mm), og antal (Tb.N, 1/mm) blev derefter målt.

Osteogen differentierings- og mineraliseringsanalyse

Knoglemarvsceller dyrket i {{{{10}}}}brøndskulturplader blev behandlet med DAG (10 nM dexamethason, 50 mM ascorbinsyre og 20 mM b-glycerophosphat) i nærvær af 10 mM acteosid. Efter 2 ugers differentiering blev cellerne fikseret med iskold 70% (vol/vol) ethanol i 1 time og farvet med 0,2% alizarin rød Sin-destilleret vand i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter at cellerne var blevet affarvet og lufttørret, blev cellekulturpladerne vurderet ved lysmikroskopi under anvendelse af et omvendt mikroskop (Nikon TS100, Japan). For at kvantificere mængden af ​​rødt farvestof blev pletten elueret med 10% acetylpyridiniumchlorid ved omrystning i 20 minutter, og absorbansen blev målt ved 560 nm. Mængden af ​​calcium aflejret i cellelagene blev også målt under anvendelse af et Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) ifølge producentens instruktioner. Derudover blev ekspressionen af ​​knoglespecifikke mRNA-markører, såsom run-relateret transkriptionsfaktor -2(Runx2), osterix, knoglesialoprotein (BSP) og OC bestemt ved real-time RT-PCR. Oligonukleotidprimere af disse markører blev designet med produktstørrelser mindre end 200 bp ved hjælp af PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) som beskrevet andetsteds[27].

Statistisk analyse

Medmindre andet er angivet, er alle data udtrykt som den gennemsnitlige6 standardafvigelse (SD) af 3 eller flere uafhængige eksperimenter. En envejs ANOVA blev brugt til flere sammenligninger ved hjælp af SPSS version 12.0 software. En p-værdi ,0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Acteosid hæmmer osteoklastdannelse ved makrofager på en dosisafhængig måde

For at verificere virkningen af ​​acteosid på BMM-differentiering til osteoklaster blev cellerne dyrket med forskellige koncentrationer (0-20 mM) af acteosid i 7 dage i nærværelse af 50 ng/ml M CSF og 100 ng/ml RANKL . Acteosid reducerede antallet af osteoklaster på en dosisafhængig måde. Når cellerne blev forbehandlet med 10 mM acteosid i 2 timer, faldt osteoklastantallet med 43 procent sammenlignet med celler suppleret med M-CSF og RANKL (fig. 1A). Fig. 1B viser den RANKL-medierede osteoklastdifferentiering og dens inhibering ved kombineret behandling med acteosid. I overensstemmelse med dette resultat reducerede acteosid-forbehandling den RANKL-stimulerede differentiering af RAW264.7-celler og osteoklastdannelse (fig. 1C og D). Når det anti-osteoklastiske potentiale af acteosid på BMM'er blev sammenlignet med anti-osteoklastpotentialerne for flere phenoliske forbindelser ved samme koncentration (10 mM), viste luteolin den højeste aktivitet (fig. 2A). Imidlertid reducerede luteolin, quercetin eller apigenin i sig selv cellernes levedygtighed (fig. 2B). Alle forbindelserne hæmmede osteoklastisk differentiering af RAW264.7 makrofager med følgende relative aktiviteter: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=akteosid (fig. 2C). Luteolin, quercetin eller apigenin i sig selv viste også den nedsatte levedygtighed af cellerne (fig. 2D). I modsætning hertil forårsagede quercetinbehandling kun en signifikant reduktion af levedygtigheden i både BMM'er og RAW264.7-celler, når disse celler blev udsat for 10 mM af hver forbindelse i 2 dage med 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, eller begge dele (data ikke vist). Når koncentrationen af ​​disse forbindelser er påkrævet for at hæmme 50 procent af

osteoklastdannelse i BMM'er (IC50) blev beregnet ved hjælp af koncentrations-aktivitetskurver, IC50 for acteosid, quercetin, luteolin, apigenin og EGCG var henholdsvis 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 og 6,6 mM (fig. 2E). Dette resultat lignede det tilfælde, hvor RAW264.7-makrofager blev undersøgt. Disse data antydede, at luteolin og quercetin havde anti-klastogene aktiviteter højere end acteosid. I modsætning hertil havde quercetin ved IC50 også en mild toksisk virkning på cellerne (data ikke vist).

ActeosidHæmmer knogleresorption af makrofagerActeosid forhindrede også RANKL-medieret knogleresorption på en dosisafhængig måde, målt med et in vitro-modelsystem (fig. 3A). Knogleresorption blev signifikant hæmmet, når BMMs blev inkuberet med 1 mM acteosid (fig. 3B). En 10 mM acteosidbehandling svækkede næsten fuldstændig RANKL-induceret pitdannelse af BMM'er. Tilsvarende nedsatte acteosid knogleresorption i RANKL-stimulerede RAW264.7-celler (fig. S2A og B). Evnen tilakteosidat hæmme knogleresorption afhang af tidspunktet for behandlingen i forhold til RANKL-stimulering. Acteosid (10 mM) tilsat 4 dage efter RANKL-stimulering reducerede ikke pitdannelse i BMM'er, hvorimod det undertrykte antallet af dannede osteoklaster (fig. 3C). Dette anderledes resultat skyldtes delvist pitområdet, der allerede var dannet efter 4 dages RANKL-stimuleringsdannelse (fig. 3D).

ActeosidNedregulerer tidlige RANKL-signalveje

RANKL inducerer aktiveringen af ​​3 velkendte MAPK'er og NF-kB i osteoklastprækursorer, og denne aktivering er nødvendig for tidlig osteoklastdifferentiering. For at forstå de mulige mekanismer, hvorved acteosid hæmmer osteoklastogenese, undersøgte vi virkningen af ​​acteosid på MAPK'er og NF-B-aktivering i makrofager. BMM'er og RAW264.7-celler blev forbehandlet med 10 mM acteosid i 2 timer og derefter stimuleret med 100 ng/ml RANKL i 30 min. MAPK-phosphorylering blev undersøgt ved Western blotting og immunometrisk analyse. RANKL-inducerede phosphorylering af p38, ERK og JNK iBMM'er (fig. 4A) og RAW264.7-celler (fig. 4B). Acteoside forhindrede disse RANKL-inducerede stigninger i p-p38, p-ERK og p-JNK. Dette resultat blev understøttet af immunometrisk analyse, hvorved den forbehandling med 10 mM acteosid signifikant hæmmede niveauerne af phosphorylerede MAPK'er i disse makrofager (fig. 4C). RANKL-behandling øgede DNA-bindingen af ​​NF-kB, hvorimod acteosid inhiberede RANKL-induceret aktivering af NF-kB-DNA-binding (fig. 5A). Denne hæmning var mere fremtrædende i BMM'er end i RAW264.7-celler. Acteosid formindskede også RANKL-stimuleret p65- og IkBa-phosphorylering i BMM'er og RAW264.7-celler (fig. 5B og C). Tilsætning af 10 mMacteosid inhiberede næsten fuldstændigt både nedbrydningen og aktiveringen af ​​IkBa i BMM'er (fig. 5B). For yderligere at bekræfte, at NF kB-aktivering er involveret i virkningen af ​​acteosid, blev kB-promotor-luciferase-konstruktioner forbigående transficeret ind i RAW264.7-celler. Cellerne inkuberet med 100 ng/ml RANKL havde 3- gange højere kB-promotoraktivitet, som var signifikant svækket af 10 mM acteosid (fig. 5D).

Acteosid undertrykker produktionen af ​​inflammatoriske cytokiner og ekspressionen af ​​TNF-a, c-Fos og NFATc1in RANKL-stimulerede makrofager

TNF-a, IL-1b og IL-6 er vigtige i osteoklastdannelse og -funktion, som medieres af NF-kB-signalering i RANKL-stimulerede makrofager. RANKL stimulerede produktionen af ​​disse cytokiner, og denne produktion blev markant reduceret med 10 mM acteosid-forbehandling i BMM'er (fig. 6A). Tilsvarende svækkede acteosid den RANKL-inducerede produktion af cytokiner, undtagen IL-6, i RAW264.7 makrofager (fig. S3). For at forstå de molekylære mekanismer for acteosidvirkning i osteoklastogenese undersøgte vi yderligere virkningen af ​​acteosid på TNF-a, c-Fos og NFATc1-ekspression. RANKL opregulerede mRNA-ekspressionen af ​​disse faktorer i BMM'er og RAW264.7-celler (fig. 6B og C). Forbehandling med 10 mM acteosid hæmmede signifikant den RANKL-inducerede ekspression af disse faktorer i begge

BMM'er og RAW264.7-celler. Acteosid-forbehandling reducerede også kraftigt proteinniveauerne af c-Fos og NFATc1 i RANKL-stimulerede BMM'er (fig. 6D). Disse resultater tyder på detakteosidnedregulerer RANKL-inducerende mediatorer af osteoklastdannelse ved gen- og proteinniveauer.

Acteosid mindsker intracellulær ROS-generering i BMM'er på en dosisafhængig måde

Da det er kendt, at intracellulær ROS-produktion er korreleret med RANKL-stimuleret osteoklastogenese, undersøgte vi, om acteosid hæmmer ROS-produktion under RANKL-medieret osteoklastdifferentiering ved hjælp af et cellegennemtrængeligt, oxidationsfølsomt farvestof, DCFH-DA. Flowcytometrianalyse viste, at det gennemsnitlige fluorescenssignal, der er specifikt for DCF i BMM'er, tilsyneladende var højreskiftet efter stimulering med RANKL sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller (fig. 7A). Dette skift svarede til det tilfælde, hvor RAW264.7-makrofager blev observeret efter RANKL-stimulering (data ikke vist). Behandling af BMM'er med acteosid reducerede signalintensiteten af ​​DCF på en dosisafhængig måde. Forbehandling med 10 mM acteosid reducerede næsten fuldstændigt niveauerne af intracellulær ROS produceret under osteoklastdifferentiering til de ubehandlede kontrolniveauer (fig. 7B).

Oral Acteosid-administration hæmmer ændring af osteoporotiske biokemiske markører og knogletab hos ovariektomiserede mus

For at udforske virkningen af ​​acteosid på knogletab, forberedte vi en osteoporotisk dyremodel ved ovariektomi. Der var ingen signifikant forskel i kropsvægt mellem OVX og Shammice i løbet af forsøgsperioden (data ikke vist). Gruppen havde signifikant højere serumniveauer af IL-1b og IL-6 end Sham-gruppen (fig. 8). Ovariektomi-inducerede stigninger i disse inflammatoriske cytokiner blev svækket ved oral acteosidadministration (AC-gruppe). Serumniveauerne af knogleomsætningsmarkører såsom ALP, calcium, TRAP5b og OC var signifikant øget i OVX-gruppen. Af disse osteoporotiske markører blev de øgede niveauer af calcium, TRAP5b og OC i OVX-mus tilsyneladende hæmmet af acteosidbehandling, hvorimod serumniveauet af ALP ikke blev ændret ved behandlingen. Den gennemsnitlige maksimale frakturbelastning til midten af ​​højre lårbensskaft var signifikant lavere i OVX-gruppen end i Sham-gruppen (fig. 9A). Acteosid-behandling hævede den maksimale frakturbackup til den for Sham-gruppen. Når lårbenets kortikale knogle blev dissekeret og observeret ved optisk mikroskopi, var de osteoporotiske træk vist i OVX-gruppen næsten fuldstændigt forsvundet i AC-mus (fig. 9B). For at verificere virkningen af ​​acteosid på den OVX-inducerede osteoporosemodel, blev BMD og knoglemorfologiske parametre i trabekulæren af ​​den lette proksimale femur analyseret ved hjælp af mikro-CT. Som vist i fig. 9C blev en ændring af den femorale trabekulære arkitektur fundet i OVX-mus, hvorimod denne ændring blev formindsket ved behandling med acteosid. Resultaterne fra mikro-CT-analysen viste, at BMD, et mål for knoglestyrke, var dramatisk reduceret i OVX-mus (fig. 9D). Sammenlignet med Sham-gruppen viste OVX-mus også signifikante ændringer i BV/TV, Tb. Sp og Tb. N, men ikke Tb.Th. Oral acteosidbehandling af OVX-mus forhindrede signifikant ændringen i BMD samt BV/TV og Tb.N.