Plantebaseret kost er blevet forbundet med en lavere risiko for at udvikle kroniske sygdomme som fedme

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt:Det er blevet foreslået, at spinat methanolisk ekstrakt (SME) hæmmer dannelsen af ​​avancerede glycation slutprodukter (AGEs), som øges under diabetesprogression, så det er vigtigt at vide, om SMV'er har gavnlige virkninger på den diabetiske nethinde. I denne undersøgelse viste in vitro assays, at SME inhiberer glycation, carbonylgruppedannelse og reduceret thiolgruppeudtømning i bovint serumalbumin inkuberet enten reducerende sukkerarter eller methylglyoxal. SME-effekten i nethinderne hos streptozotocin-inducerede diabetiske rotter (STZ2) blev også undersøgt (n=10) i den normoglykæmiske gruppe, STZ, STZ-rotter behandlet med SME og STZ-rotter behandlet med aminoguanidin (anti-AGEs reference gruppe) i 12 uger. Nethinden blev sektioneret og immunfarvet for Ne-carboxymethyllysin (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS), 3-nitrotyrosin (NT), nuklear NF-kB, vaskulær endotelvækstfaktor ( VEGF), gliafibrillært surt protein (GFAP), S100B-protein og TUNEL-assay. Lipidperoxidation blev bestemt i hele nethinden ved malondialdehyd (MDA) niveauer. Resultaterne viste, at i den diabetiske nethinde reducerede SME CML-RAGE co-lokalisering, oxidativt stress (NOX4,iNOS,NT,MDA), inflammation (NF-B,VEGF,S10B, GFAP) og apoptose (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Nøgleord:spinat; diabetisk retinopati; avancerede glycation slutprodukter; oxidativt stress; betændelse; RASERI; carboxymethyl L-lysin

Klik venligst her for at vide mere

1. Introduktion

Plantebaseret kost er blevet forbundet med en lavere risiko for at udvikle kroniske sygdomme som fedme, type 2-diabetes og koronar hjertesygdom. Spinat (Spinacia oleracea L.) er en spiselig bladgrøntsag, der indtages over hele verden på grund af at give en mærkbar mængde fibre, vitaminer og mineraler [1,2]. Flere af dets fytokemikalier er blevet identificeret, herunder klorofyler, carotenoider (lutein og zeaxanthin) [3] og phenoliske forbindelser (flavoner, flavonoider, coumariner) [4-8] (se supplement 1). Det er blevet rapporteret, at spinat, når det indtages som fødevare, vandopløseligt ekstrakt eller i frysetørret form, og dets thylakoider har anti-cancer, anti-fedme og hypoglykæmiske egenskaber [9]. Den anti-inflammatoriske virkning af spinat er blevet påvist i dyreendotoksæmimodeller, overvægtige dyr og raske mennesker [9]. Dets antioxidantvirkning blev undersøgt i humane prostatacarcinomceller, dyremodeller med fedme, UV-bestrålede mus og adenokarcinom i den transgene museprostata [9,10]. De anti-glykerende og anti-inflammatoriske virkninger af spinat methanolisk ekstrakt (SME) er blevet undersøgt i modellen for glukose-induceret diabetes i henholdsvis zebrafisk og isoproterenol-induceret myokardienekrose i rotter [11,12]. SME reducerede niveauerne af glycosyleret hæmoglobin og fructosamin, inklusive niveauerne af glykosyleret protein, ved at reducere aldosereduktaseaktiviteten i linsens okular [11]. Ovenstående resultater tyder på, at SMV'er kan have en forebyggende effekt på udviklingen af ​​diabetes mellitus-komplikationer såsom diabetisk retinopati (DR).

DR fører gradvist til tab af synsstyrke eller blindhed, der har været relateret til inflammation, oxidativt stress og akkumulering af avancerede glycation slutprodukter (AGEs)[13,14]. AGE'erne inducerer proteintværbinding, ændrer struktur/funktion og dets omsætning/clearance. AGE'er kan produceres af en ikke-enzymreaktion mellem glucosen med en fri aminogruppe af proteiner, der danner reversible mellemprodukter såsom Schiffs baser og Amadori-produkter (fructosamin)[15]. Andre mekanismer for AGEs-dannelse omfatter "carbonylstress"-vejen, hvor oxidation af sukkerarter og lipider skaber dicarbonyl-mellemprodukter såsom glyoxal og methylglyoxal (MGO), som fører til AGE-dannelse som N:-carboxymethyllysin (CML)[ 16]. Forhøjede CML-niveauer i serum og glaslegeme kan være en biokemisk markør for både udseende og progression af DR [17,18]. I nethinden inducerer aktiveringen af ​​receptor RAGE af AGEs (AGEs-RAGE) overekspression af glial fibrillært surt protein (GFAP) og pro-inflammatoriske faktorer, reguleret af den nu-clear faktor kappa-let-kæde-enhancer af aktiveret B celler (NF-kB)[19]. NF-kB regulerer positivt RAGE-ekspression ved at fungere som en positiv feedback-mekanisme [20].hvad er cistanchePå den anden side kan høje koncentrationer af S100B, et calciumbindende protein, også aktivere NF-kB, hvilket inducerer neuroinflammation og gliacelleaktivering [21]. Overekspressionen af ​​S100B i astrocytter fremkalder neurotoksiske virkninger manifesteret af retinal astrogliose [22].

Cistanche kan anti-aging

Der er eksperimentelt udviklet strategier for at forhindre nethindeskader. Nogle fytokemikalier af spinat isoleret fra andre planter er blevet forbundet med hæmning af AGE'er og oxidativt stress [8,23-26]. Lutein, astaxanthin og kaempferol har beskyttet human-afledte retinale pigmentepitelceller (ARPE-19) mod skader gennem deres anti-AGEs, antioxidant og anti-apoptose egenskaber [26-28]. Disse resultater tyder på, at spinats fytokemikalier har en relevant rolle i forebyggelsen af ​​nethindegeneration som DR. En anden strategi har været at bruge aminoguanidin (AG) som en potent hæmmer af glycation og iNOS-aktivitet, der dæmper CML-akkumuleringen og dannelsen af ​​reaktive dicarbonyliske prækursorer hos rotter [29]. I et multicentrisk og randomiseret klinisk forsøg med 690 diabetespatienter blev den gavnlige effekt imidlertid ikke fastslået klart [30].

Ændringerne i nethindens degeneration under hyperglykæmiske forhold er næppe blevet undersøgt. Derfor er det interessant at vide, om SME beskytter retinale lag mod skader relateret til dets anti-AGEs, antioxidant og antiinflammatoriske egenskaber i nethinden hos streptozotocin-inducerede diabetiske rotter.

2. Materialer og metoder

2.1. Fremstilling af methanolekstrakten af ​​spinat (SMV)

De friske blade af spinat (S.oleracea L.) blev høstet i efterår-vinter sæsonen i en landbrugsmark i Puebla-provinsen, Mexico, og identificeret af en botaniker i herbariet på The National Polytechnic Institute (IPN, Mexico City, Mexico). Kuponprøve nummer 4532 blev deponeret i herbariet på National School of Biological Sciences i IPN.

Bladene var dehydrerede og fint malede. De tørrede blade blev macereret med methanol ved stuetemperatur, filtreret gennem cellulosefiltre (Whatman, Maidstone, UK) og tørret ved hjælp af en roterende vakuumfordamper (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Schweiz) ved 45 grader til giver et grønt tyggegummi (95,0 g/kg tørre blade).Anti-aging cistancheSME'en blev opbevaret i mørke ved 4 grader indtil brug. Til alle assays blev ekstraktet rekonstitueret i destilleret vand[11].

2.2. In vitro-assays af SMV-anti-glykeringsaktivitet

2.2.1. Dannelse af avancerede glykeringsslutprodukter afledt af bovint serumalbumin (BSA-AGEs)

BSA-AGEs assayet blev udført som beskrevet tidligere [31]. Kort fortalt blev 10 mg/ml BSA (fraktion V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tilsat enten i D-glucose 0.5 M, D-fructose {{12 }},5 M, eller methylglyoxal 2,5 mM, og fremstillet i en opløsning 0,1 M PBS (pH 7,4) og 0,02 procent natriumazid. SME-koncentrationer (5, 10, 25, 50, 100 og 200 mg/ml) blev tilsat til hver blanding og derefter inkuberet ved 37 grader i 4 uger. Bagefter blev de uomsatte sukkerarter fjernet ved dialyse mod destilleret vand i to dage ved 4 grader. BSA-AGE-niveauer blev bestemt ved fluorescensspektrofotometri (Ex370/Em 440 nm; model LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. Glykeringen af ​​BSA-protein ved at reducere sukkerarter og MGO var en positiv kontrol (BSA-glykeret), mens inkubationen af ​​BSA-glykeret med aminoguanidin (1 mg/ml) blev anvendt som den negative kontrol (BSA-glykeret-AG). Assayene blev udført i tre eksemplarer.

2.2.2. Fructosamin assay

Fructosaminniveauet blev bestemt ved nitroblåt tetrazolium (NBT) assay [33], som er baseret på fructosamins evne til at reducere NBT og danne formazan, et farvet slutprodukt under alkaliske forhold. Ti mikroliter af en af ​​kontrollerne eller glyceret BSA-inkuberede SME-koncentrationer (BSA-SME) blev tilsat til 90 μL NBT ved 2,5 mM, fremstillet i en carbonatbuffer (0,1 M; pH 10,3); alle blev inkuberet ved 37 grader C i 30 min. Absorbansen ved 530 nm blev målt. Fruktosaminkoncentrationer (nmol/mg) blev beregnet ifølge en standardkurve for formazan.

2.2.3. Bestemmelse af dannelse af carbonylgrupper og depletering af thiolgrupper i BSA-AGE'er

Carbonylgruppekoncentration blev målt i BSA-SME og kontrolprøver ifølge Levine et al. [34]. En opløsning af 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH;10 mM) i 400 μL 2,5 M HCl blev tilsat til 100 μL hver prøve og inkuberet i mørke i 60 minutter ved stuetemperatur.cistanche benefíciosDerefter blev 500 μL trichloreddikesyre (20 procent w/v) tilsat og holdt på is i 5 min. Prøverne blev centrifugeret ved 4 000 rpm i 15 minutter, og proteinpellet blev vasket tre gange med ethylacetat/ethanol (1:1 v/v). Efterfølgende blev prøverne suspenderet i 250μL guanidinhydrochlorid til 6 M. Koncentrationen af ​​carbonylgrupper (nmol/mg protein) blev beregnet ved spektrofotometri ved 370 nm absorbans (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) ved hjælp af absorptionskoefficient for DNPH (22.000 M-1 cm-1).

Ifølge Ellmans metode blev bestemmelsen af ​​thiolgruppeudtømning i BSA-SME og kontrolprøver udført. Kort fortalt blev 10 μL 5,5'-disulfandiylbis（2-nitrobenzoesyre）（DNTB;10 mM, fremstillet i PBS） med 50 μL glycerede prøver inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur, derefter blev absorbansen ved 410 nm målt. Niveauet af frie thiolgrupper blev beregnet ved hjælp af en standardkurve af L-cystein (0.4-11 μM) og udtrykt i nmol/mg protein [34].

2.3. Effekt af SMV på nethinden hos diabetiske rotter 2.3.1. Diabetesinduktion hos rotterne

Wistar-hanrotter, der vejede 250±10 gr(N=40), fastede i 8 timer, blev brugt. En intraperitoneal dosis af streptozotocin (60 mg/kg) i citratbuffer (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) blev indgivet [35]. Tre dage senere blev glucoseniveauet målt (glukometer; ACCU-CHEK aktiv; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland) ved at opsamle en dråbe af en blodprøve fra halen. Dyr med glykæmiske niveauer højere end 350 mg/dL blev rekrutteret til undersøgelsen. Glukosen i blodet blev målt ugentligt i 12 uger.

2.3.2. Eksperimentelt design

De streptozotocin-inducerede diabetiske rotter (STZ) blev opdelt tilfældigt i følgende grupper (n =10): STZ behandlet intragastrisk med 2 ml drikkevand (STZ); STZ behandlet med SME ved 400 mg/kg (STZ-SME); normoglykæmiske rotter (NG); og STZ behandlet med 50 mg/kg aminoguanidin (AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG). STZ-AG blev anvendt som en anti-AGE referencegruppe. De tildelte doser blev administreret hver 24. time (9:00) i 12 uger. Det glykæmiske niveau i alle grupper blev overvåget ugentligt. SME-doseringsregimet ved 400 mg/kg var baseret på følgende: 7 g SME opnås fra 100 g frisk spinat (data ikke vist). Denne mængde svarer til det daglige forbrug af en gennemsnitlig person på 70 kg i den amerikanske kost [36], hvilket svarer til 100 mg ekstrakt/kg kropsvægt.Cistanche Extract Anti RadiationPå den anden side, på grund af forskellen i den accelererede metabolisme af rotter, anbefales det at øge forbruget af ethvert naturligt ekstrakt op til 6,4 gange til sammenligningsstudier med mennesker [37]. Dosis på 400 mg/kg, som vi brugte, var hovedsageligt baseret på resultaterne opnået i en model af myokardienekrose induceret i Wistar-rotter, som viste, at den antiinflammatoriske effekt af SME er mere signifikant ved 300 mg/kg [12].

2.3.3. Histologiske og immunhistokemiske evalueringer

Enukleerede øjne blev fikseret i neutral formalin og blev derefter dehydreret i graderede alkoholer og indlejret i paraffin. Histologiske snit på 2 μm blev monteret på elektroladede objektglas, afvokset og rehydreret op til antigengenvindingsopløsning (K035; 10× citratbuffer, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Et polymerbaseret immundetektionssystem (PolyVuemous/kanin DAB-detektionssystem, Diagnostic BioSystems) blev brugt. Følgende primære antistoffer blev anvendt: gliafibrillært surt protein (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); vaskulær endothelial dyrket faktor (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 calciumbindende protein B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) og nuklear faktor kappa-let-kæde-enhancer af aktiverede B-celler (anti-NF-kB p65;sc-8008). Alle fortyndinger var ved 1:200 og inkuberede natten over ved 4 grader. Et sekundært antistof (Mouse/Rabbit PolyVueTM) blev tilsat i henhold til leverandørens instruktioner.cistanche herbaSektioner blev farvet med DAB plus/chromogen substrat og hæmatoxylin. Histologiske observationer og optagelse af billeder blev udført i et Carl Zeiss mikroskop (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland).

Til immunfluorescensfarvning blev objektglassene inkuberet natten over ved 4 grader C med følgende primære antistoffer: carboxymethyllysin (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE-receptor (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oxidase 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrosin (anti-NT; ab110282) og nitrogenoxidsyntase (inducerbar)(anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Derefter blev følgende sekundære antistoffer anvendt: til anti-RAGE, gede-anti-muse-IgG(FITC)-konjugeret (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); for anti-CML og anti-NT, muse anti-kanin IgG-PE (SC-3753); og for anti-iNOS og anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Alle blev inkuberet ved stuetemperatur i 60 min. Bagefter blev sektioner monteret i et medium indeholdende 4',6-diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid (DAPI). Anti-CML- og anti-RAGE-antistoffer blev co-hybridiseret i det samme objektglas. FLoidTM Cell Imaging Station (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA) blev brugt til fluorescensbilleder.

2.3.4. Apoptosevurdering

Apoptosen af ​​retinale celler blev detekteret i overensstemmelse med manualen beskrevet af terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-medieret deoxyuridintriphosphat (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) assay ved hjælp af In Situ Cell Death Detection Kit, TMR(tetramethyl-rhodamin{{ 3}}dUTP) rød, version 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Kort fortalt blev de afvoksede objektglas rehydreret og skyllet to gange med PBS. Derefter blev de inkuberet med TUNEL-reaktionsblandingen i en befugtet atmosfære i 60 minutter ved 37 C. Bagefter blev sektioner monteret med DAPI og observeret i fluorescensmikroskopi (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD for TUNEL blev beregnet for nethindelag.

2.3.5. Lipidperoxidationsanalyse

Til evaluering af malondialdehyd (MDA)-niveauer i retinalvævet blev ca. 3 mg frisk væv (n=3) homogeniseret og behandlet som tidligere rapporteret [38]. MDA-niveauer blev kvantificeret efter kitleverandørens instruktioner (OXItek-TBARS assaykit, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4.Statistisk analyse

Til statistisk analyse blev alle nethindemikrofotografier taget med en størrelsesorden på 200× ved 100 μm ud over synsnerveregionen. Ca. 40 billeder pr. gruppe af dyr (n=7) blev analyseret. Billedanalyse blev udført med software Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Vi brugte GraphPad Prism-software (La Jolla, CA, USA; version 8.0). Figurerne viser værdier grafisk i boks-og-whisker-plot (median, første-tredje kvartil, minimum-maksimum værdi) for gangliecellelaget (GCL), indre kernelag (INL) og ydre kernelag (ONL). Middelværdien og standardafvigelsen (middelværdi ± SD) er vist i appendiks A (Tabel A1-A3). I alle tilfælde blev der udført en envejs ANOVA-test efterfulgt af Tukeys test. s<0.05 was="" considered="" statistically="">