Nanozymhydrogel til forbedret generering af alkylradikal og potent antitumorterapi†

Alkylradikaler (Rc), som ikke er afhængige af iltdannelse til at forårsagecellulær stress, er blevet anvendt itumorbehandling, men en stor mængde glutathion (GSH) i tumorcellerne reagerer med alkylradikaler, hvorvedreducere deres antitumoreffekt. I denne undersøgelse, et forbedret alkylradikalgenereringssystem, der reagerer pånær-infrarødt lysblev designet. Alkylradikalet udløser 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (AIPH) og enzympyrit (FeS2) blev indkapslet i agarosehydrogel for at fremstille AIPH'en–FeS2–hydrogel (AFH) system. FeS2 kan bruges som et fototermisk middel til at omdanne nær-infrarødt lysenergi til varmeenergi, hvilket fører til opløsning af hydrogelen. AIPH induceres samtidig til at producere alkylradikaler. FeS2 kan også bruges som enoxidativ stress forstærkerat reducere intracellulært GSH-indhold og derved booste den terapeutiske effekt af alkylradikaler. Til sidst kan de ilt-uafhængige frie radikaler genereret af AFH-systemet under nær-infrarød laserbestråling og fototermisk behandlingdræbe kræftcellergennem det synergistiskeOxidation/fototermisk effekt. AFH-systemet udviklet heri giver ny indsigt i at forbedre den terapeutiske virkning af alkylradikaler.

KLIK HER FOR AT VIDE HVORDAN CISTANCHE TIL ANTI-CANCER

Introduktion

I de senere år er frie radikaler-baserede behandlinger såsom fotodynamisk terapi, så ikke-dynamisk terapi og elektrodynamisk terapi blevet populære valg til behandling af brystkræft.1-3 Eksterne stimuli (laser, ultralyd, elektriske felter) fremmer produktionen af reaktive oxygenarter (ROS), der inducerer celledød ved at forårsage alvorlig oxidativ skade eller cellemetabolisme dysfunktion.4-6 Desværre reducerer det hypoxiske tumormiljø og hurtige tumorcelleproliferation de terapeutiske resultater af sådanne behandlinger, der er afhængige af ROS-produktion, især i behandlingen af ​​solide tumorer.7-10 Alkylradikaler er en ny type frie radikaler, der ikke er afhængige af iltdannelse for at dræbe celler og har vist sig at være effektive til behandling af tumorer i normoxiske og hypoksiske miljøer.11 Det frigivne alkyl radikaler kan inducere apoptose af kræftceller ved at øge oxidativt stress, hvilket fører til cellulær lipid- og DNA-skade. Som en typisk fri radikal-initiator kan 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (AIPH) generere alkylradikaler ved høje temperaturer. 12 Det gør den selv i fravær af ilt. De genererede frie radikaler er giftige for celler og vil øjeblikkeligt oxidere celleelementer eller interagere med oxygen for at producere sekundære giftige stoffer.13 Selv i et hypoksisk tumormikromiljø kan AIPH producere alkylradikaler for at øge intracellulært lipidhydroperoxid og yderligere udløse tumorcelleapoptose.14 Alle disse indikerer, at Rc er et lovende kræftbehandlingsmiddel.

Lys eller varme bruges som ekstern stimulus i fototermisk terapi.15–17 Fototermisk terapi (PTT) baseret på nær-infrarød (NIR) laserbestråling er blevet brugt til at forhindre tumorcelleaggregation; den er afhængig af lokale termiske effekter for at fjerne tumorerne.18–20 Adskillige fototermiske midler (PTA'er) såsom guldnanokrystaller og molybdændisulfid bruges i kombination med AIPH til at frigive alkylradikaler som reaktion på infrarød laserbestråling.19,21–23 , har tumormikromiljøet (TME) sædvanligvis et højt niveau af glutathion (GSH)-ekspression i solide tumorer, fordi GSH spiller en vigtig rolle i at modstå strålebehandling gennem en spontan reaktion eller en GSH S-transferase-katalyseret reaktion med xenogenic.24,25. som et reduktionsmiddel kan GSH direkte fjerne alkylradikaler.21,26 Dette reducerer effektiviteten af ​​alkylradikalbaserede terapier. Pyrit (FeS2) nano-enzym, som et nyt fototermisk nanomateriale, har ikke kun en god fototermisk effekt under NIR-lys, men har også en nanoenzymaktivitet.27 FeS2 nanasen har vist lignende aktivitet som glutathionoxidase (GSH OXD), oxiderende GSH til oxideret glutathion (GSSG).28 I TME blev GSH-depletion fundet at forstyrre REDOX-balancen af ​​celler og forårsage oxidativt stress.29 Derfor forventes FeS2 at opnå en god synergistisk effekt med AIPH.

Minimalt invasive fotoresponsive hydrogeler er for nylig blevet populære som en platform for kontrolleret lægemiddelfrigivelse.30–32 Hydrogeler koagulerer, når de injiceres i tumorvæv og fungerer som et langtidsdepot.33 Denne topiske administrationsform kan gentages efter en enkelt indsprøjtning. Derudover kan parametre som laserstyrke og bestrålingstid modificeres for at ændre lægemiddelfrigivelseshastigheden, og dermed udvide anvendeligheden af ​​denne behandlingsmetode.34,35 I betragtning af disse fordele blev det antaget, at brugen af ​​hydrogeler til at levere FeS2 og AIPH til TME ville forbedre effektiviteten af ​​frie radikaler-baserede terapier.

I denne undersøgelse blev der designet en metode, der anvender intratumoral levering af en injicerbar hydrogel indeholdende FeS2-enzym og frie radikal-initiatoren AIPH. Først blev et hybridsystem af AIPH-FeS2-hydrogel (AFH) fremstillet ved at fylde FeS2 nanopartikler og AIPH i agarosehydrogel. Hydrogelen er fast ved stuetemperatur, og FeS2 og AIPH er indkapslet i dens matrix. Når først det er bestrålet af nær-infrarødt (NIR) lys, omdanner FeS2 NIR-lysenergi til varmeenergi, hvilket får AFH-systemet til at varme op, og derefter smelter hydrogelen og frigiver FeS2 og AIPH. Ved høje temperaturer nedbrydes AIPH og producerer alkylradikaler. Efterfølgende reducerer FeS2-enzym, som efterligner aktiviteten af ​​GSH-OXD, det intracellulære GSH-indhold. Ødelæggelsen af ​​GSH vil fremme dræbende virkning af alkylradikaler. Fordi AFH kan opholde sig på tumorstedet i lang tid, kan AFH-systemet tillade præcis kontrol over frigivelsen af ​​alkylradikaler ved at ændre laserintensiteten og strålingstiden. Endelig kan de oxygen-uafhængige frie radikaler genereret af AFH-systemet under NIR-bestråling og fototermisk behandling synergistisk dræbe kræftceller gennem den synergistiske oxidation/fototermiske effekt, og tumorvækst under behandlingscyklussen er godt beboet. Kort sagt forstærker AFH-systemet, der er designet heri, yderligere den terapeutiske virkning af AIPH ved at ændre redox-homeostasen (skema 1).

Resultater og diskussion

En agarosehydrogel med lavt smeltepunkt blev brugt til at fremstille en sammensat hydrogel indeholdende FeS2 og AIPH. FeS2 blev blandet med en vandig agaroseopløsning ved 6 0 C og derefter fyldt med alkylradikaludløseren AIPH, efterfulgt af hurtig afkøling til stuetemperatur. Således blev AFH-hydrogelmatrixen dannet. Transmissionselektronmikroskopi blev brugt til at karakterisere morfologien af ​​FeS2 (fig. 1A). FeS2 nanozymet viste sfærelignende morfologi med en gennemsnitlig partikelstørrelse på omkring 148 nm (Fig. S1†). UV-vis absorptionsspektrene for FeS2 (fig. 1B) viste, at FeS2 var stærkt absorberet i NIR-området ved 808 nm. Denne egenskab gør FeS2 til en god PTA. Den fototermiske ydeevne af FeS2-enzymet ved forskellige koncentrationer (0, 25, 50 og 100 mg ml 1 ) blev undersøgt ved at bestråle opløsningen med et 0,5 W cm 2 808 nm lasersystem (fig. 1C). Opvarmningseffekten af ​​opløsningen var direkte proportional med FeS2-koncentrationen. Temperaturen af ​​en 100 mg ml 1 FeS2-opløsning steg med ca. 17,5 C på kun 5 minutters laserbestråling, hvilket viser FeS2's gode fototermiske ydeevne. Scanningelektronmikroskopi viste også, at AFH-hydrogelen har et komplekst netværk af porestruktur og porestørrelsesfordeling (fig. 1D), hvilket gør hydrogelen egnet til lægemiddelladning til levering. Fototermisk stabilitet er også et vigtigt kriterium for vurdering af kvaliteten af ​​en PTA.36 En 200 mg ml 1 FeS2-opløsning blev opvarmet med en 808 nm NIR-laser i 5 minutter, hvorefter laseren blev slukket, og FeS2-opløsningen fik lov til at køle af. naturligt til stuetemperatur. Denne proces blev gentaget flere gange for at evaluere den fototermiske stabilitet af FeS2 (fig. 1E). Der var ingen tydelig ændring i varmekurven for hver fototermisk cyklus, og kun en lille forskel blev observeret i toptemperaturen opnået efter 5 minutters bestråling, hvilket bekræftede den fototermiske stabilitet af FeS2. Den rheologiske analyse afslørede også et højt opbevaringsmodul af den fremstillede hydrogel i fast tilstand ved stuetemperatur (fig. 1F). Efterhånden som temperaturen steg, blev hydrogelen gradvist opløst og opløst, og opbevaringsmodulet faldt gradvist. Dernæst blev et fototermisk opløsningseksperiment udført på FeS2-hydrogelen. Den størknede AFH (FeS2 indeholdt i hydrogelen) blev anbragt i en glasskål indeholdende deioniseret vand. Ved stuetemperatur bevarede den fremstillede AFH-hydrogel sin størknede form, men efter 10 minutters bestråling med en 808 nm laser opløstes hydrogelen næsten fuldstændigt, og FeS2-nanomaterialet blev frigivet og opløst i vandet i glasskålen (fig. 1G). En termisk infrarød billedkamera bekræftede også den signifikante stigning i temperaturen af ​​AFH under bestrålingen (fig. 1H). Røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) spektrum af FeS2 efter reaktion med hydrogel viste, at FeS2 indeholdt Fe- og S-elementer (Fig. S2†). Som vist i Fig. S3, † GSH-indhold var signifikant faldet efter co-inkubation af FeS2 og GSH, det har en positiv korrelationskurve med tid og koncentration. Ydermere var den POD-lignende aktivitet af FeS2 størrelsesafhængig. Nanozymer med en størrelse på 150 nm viste højere aktivitet end dem med størrelser på 280 og 687 nm (Fig. S4†).

Baseret på AFH's højtydende egenskaber blev dets antitumoreffekter evalueret. Indledningsvis blev fluoresceindiacetat/propidiumiodid-levende/døde celle-farvningssættet brugt til at udforske den dræbende effekt af den fremstillede AFH-hydrogel kombineret med NIR-bestråling. PBS plus NIR-gruppen og AFH-only-gruppen viste stærk grøn fluorescens, hvorimod AIPH næsten ikke viste nogen dræbende effekt (fig. 2A). Vi forberedte hydrogel kun indeholdende FeS2 (FH) for at verificere relative eksperimenters resultater. Den fremstillede hydrogel indeholdende kun FeS2 (FH) kombineret med NIR havde en moderat dræbende virkning. Det er bemærkelsesværdigt, at AFH plus NIR-behandling havde den bedste cytotoksiske effekt.

Dichlorfluoresceindiacetatproben blev brugt til at påvise AIPH's evne til at producere ROS. AIPH viste en svagere evne til at inducere ROS i fravær af laserbestråling, mens FH fyldt med FeS2 viste en moderat grad af ROS-produktion efter NIR-bestråling (fig. 2B). Den lyse grønne fluorescens observeret i AFH plus NIR-behandlingsgruppen kunne tilskrives frigivelsen af ​​FeS2 og AIPH efter laserbestråling (fig. 2C). Endvidere viste grupperne af AIPH og AIPH plus NIR meget lidt grøn fluorescens (fig. S5†). CCK-8-analysen viste også de samme resultater. Cellelevedygtigheden af ​​AFH plus NIR-gruppen var omkring 8,5 procent, hvilket var signifikant forskelligt fra de andre gruppers (fig. 2D). Høj temperatur vil fremme nedbrydningen af ​​AIPH for at producere alkylradikaler. Samtidig kan FeS2 udøve GSH-OXD aktivitet for at reducere intracellulær GSH. GSH, som et allestedsnærværende thiolholdigt tripeptid, syntetiseres ud fra dets aminosyrer (glutaminsyre, cystein og glycin) i mange celler. GSH produceres rigeligt i forskellige typer kræftceller. GSH i celler findes generelt i reduceret form, som kan reagere med oxiderende stoffer såsom alkylgrupper, mens det bliver oxideret til dets oxiderede form glutathiondisulfid (GSSG), og derved reducerer antitumoreffekten baseret på frie radikaler.37 Nedbrydningen af ​​GSH vil forstyrre cellernes redoxbalance, forårsage oxidativ stress og i sidste ende føre til celleapoptose.38 Ellmans reagens blev brugt til at teste hver gruppes evne til at nedbryde GSH. AFH kombineret NIR-gruppe viste den bedste GSH-nedbrydende evne (fig. 2E).

Skema 1 Nanozyme hydrogel til forbedret alkylradikalgenerering og potent antitumorterapi

Fig. 1 (A) TEM-billede af FeS2. (B) UV-Vis-NIR-absorbansspektrum for en FeS2-opløsning. (C) Varmekurver for de forskellige koncentrationer af FeS2 nanopartikelopløsninger ved laserbestråling ved 808 nm (0.5 W cm 2 ) i 5 min. (D) SEM-billede af hydrogelen. (E) Temperaturvariation af en FeS2-opløsning under cyklisk laserbestråling. (F) Rheologiske kurver og temperaturkurver (henholdsvis rød og sort) for den forberedte AFH som reaktion på 0,5 W cm 2 808 nm laserbestråling. (G) Morfologien af ​​den præparerede AFH før og efter 0,5 W cm 2 808 nm laserbestråling i 10 minutter og (H) infrarøde termiske billeder af den præparerede AFH efter bestråling.

I lyset af dets gode in vitro ydeevne som et PTA- og GSH OXD-efterlignende enzym, blev virkningen af ​​AFH på NIR-lys-til-varme-omdannelsen undersøgt in vivo. BALB/c-mus blev injiceret subkutant med 4T1-celler for at danne tumorer. Fig. 3A viser temperaturændringskurven for PBS-gruppen og AFH-gruppen efter 808 nm NIR-laser 0,5 W cm2-bestråling i 10 min. AFH-gruppens temperatur steg med ca. 17,6 C efter bestrålingen, mens temperaturen i PBS-gruppen næsten ikke steg. Høj temperatur kan ændre fugtigheden i tumorcellemembranen og derved øge cellemembranens permeabilitet, hvilket igen forårsager termisk skade på proteiner.39,40 Til sidst mister kræftcellerne evnen til at formere sig. Dernæst blev AFH-medieret antitumoraktivitet evalueret i 4T1-tumorbærende mus. Tumorbærende mus blev opdelt tilfældigt i fem grupper. Tumorvolumenet af mus i PBS plus NIR-gruppen og AIPH-gruppen steg hurtigt i løbet af den to-ugers behandlingsperiode, og AFH-gruppen viste en let tumorundertrykkende effekt (fig. 3C). Dette skyldtes, at agarose langsomt blev metaboliseret, og nogle lægemidler blev langsomt frigivet. AFH plus NIR-gruppen havde den stærkeste effekt på tumorvækst. Under behandlingen blev musenes tumorvolumen signifikant undertrykt. Efter behandlingsperioden blev musene aflivet, og tumorerne blev isoleret og vejet. Resultater for tumorvægt var i overensstemmelse med resultater for tumorvolumen (fig. 3D).

Det er vigtigt, at der under hele undersøgelsen ikke blev observeret nogen ændringer i kropsvægt i behandlingsgruppen, hvilket indikerer, at behandlingen ikke forårsagede nogen signifikant systemisk toksicitet for musene (fig. S6†). Dette resultat er meget opmuntrende, fordi selvom mange materialer har vist gode eksperimentelle resultater, forårsagede de også alvorlige bivirkninger, som alvorligt hæmmer deres kliniske udsigter.41,42 20,70 - Dichlorourescin diacetat blev brugt til at måle intra -tumoral ROS-generering i de behandlede mus. Farvningen blev signifikant forbedret i de tumorer, der blev udsat for kombinationsterapien af ​​AFH plus NIR (fig. 3E). Den øgede frie radikalproduktion førte til en forbedret terapeutisk effekt i dyremodellen. TUNEL- og Ki-67-farvningsanalyser blev brugt til at verificere celleapoptose og proliferation (fig. 3E). Tumorvæv i AFH plus NIR-gruppen var massivt nekrotisk uden signifikant proliferation.

Fig. 3 (A) Infrarøde termiske billeder af tumorer efter bestråling med 808 nm laser (0.5 W cm2) i 10 min i de angivne behandlingsgrupper. (B) Temperaturstigninger hos mus implanteret med 4T1-tumorer efter 808 nm laserbestråling (0,5 W cm 2 ) i 10 minutter i de angivne behandlingsgrupper. (C) Tumorvolumen ændres over tid i grupper behandlet som angivet. (D) Gennemsnitlige tumorvægtværdier forbundet med de angivne behandlinger. (E) ROS-, Ki-67- og TUNEL-farvede tumorsektioner fra de angivne behandlingsgrupper. **P < 0,01, ***P < 0,005; Elevens t-test.

Efter behandlingen havde de vitale organer (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) ingen betændelse eller skade. Lever- og nyreindekset var normalt (fig. 4A-D og S7†). Omfattende in vivo eksperimentelle data viser, at synergistisk AFH- og PTT-terapi har gode terapeutiske virkninger og biokompatibilitet. Det har gode udsigter til klinisk medicinsk anvendelse i fremtiden.

Fig. 4 Resultat af in vivo sikkerhedseksperimenter. Blodbiokemiske data inklusive nyrefunktionsmarkører: (A) leverfunktionsmarkører: CRE, (B) BUN og (C) ALT efter forskellige behandlinger. (D) Histopatologiske analyseresultater (H&E-farvede billeder) af de vigtigste organer, hjerte, lunge, lever, nyrer og milt, fra mus, der blev udsat for forskellige behandlinger 16 dage efter injektion. Skala stænger: 100 mm.

Konklusion

Vi designede en injicerbar foto-responsiv hydrogel, der samtidigt kan opnå fri radikalterapi og PTT ved at indkapsle enzymet FeS2 og alkylradikalkilden AIPH i agarosehydrogel. Under 808 nm laserbestråling fremmer PTA FeS2 opvarmningen af ​​AFH-systemet og fører til frigivelse af AIPH og dets nedbrydning for at producere alkylradikaler. Samtidig kan FeS2 reducere det intracellulære GSH-indhold og derved yderligere ødelægge redox-homeostase. Hydrogelens opløsningshastighed kan ændres af parametre som lasereffekttæthed og pletstørrelse. Både in vivo og in vitro undersøgelser har vist, at kombinationen af ​​AFH med NIR-bestråling kan opnå kraftige tumordræbende effekter med ubetydelige bivirkninger. Hydrogelsystemet designet i denne undersøgelse giver en strategi til at forbedre terapeutiske systemer baseret på alkylradikaler.

Referencer

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo og BZ Tang,Adv. Sci., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang og F.-B. Wang,Nanoskala, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He og Z. Qian,Hage. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai og S. Xu,J. Nanobioteknologi., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li og BZ Tang,Biomaterialer, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li og X. Wang,Nano Res., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang og K. Li,J. Mater. Chem. B, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan og GG Qiao,ACS Nano, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia og K. Li,Biomaterialer, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu og C. Gong,Hage. Chem. Lett., 2021, DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.