Multi-komponent Prime-boost Chlamydia Trachomatis-vaccinationsregimer inducerer antistof- og T-celle-responser og fremskynder clearance af infektion i en ikke-human primatmodel Ⅱ

Materialer og metoder

Vaccineantigener og adjuvanser

Forskellige vaccineantigener og adjuvanser blev brugt i denne undersøgelse: CTH522-vaccineantigen, baseret på MOMP (11) blev administreret via den intramuskulære vej (IM) med CAF01 adjuvans (42) eller aluminiumhydroxid (AlOH) adjuvans, eller gennem den intranasale vej ( IN) uden adjuvans. Plasmid-DNA-vaccine, pcDNA3.1-MOMP, blev fremstillet ved at klone konsensus-MOMP ind i plasmidvektoren pcDNA3.1 (14) og administreret ad intradermal (ID) vej med elektroporation (EP) i ryggen. Rekombinant Human Adenovirus serotype 5 (rHuAd5)-vaccine, der udtrykker MOMP (HuAd5-MOMP), blev fremstillet ved homologt at kombinere konsensus-MOMP (AAC45154.1) i en E1- og E2-deleteret HuAd5-plasmid pAL1112-vektor og administreret via intramuskulær vej (14) . Modificeret vaccinia Ankara-MOMP-vaccine lavet afrekombination af konsensus MOMP(AAC45154.1) ind i p3186-plasmidet og svækket MVA-vektor (14) og indgivet gennemintramuskulær vej.

Klik her for at få Cistanche til anti-inflammatorisk

C. trachomatis serovar D stam

Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og opformeret i HeLa{ {2}} celler, høstet og oprenset som beskrevet af Caldwell et al. (43). C. trachomatis SvD-stamopløsningen blev opbevaret ved -80 grad i 0,2 M saccharose, 20 mM natriumphosphat (pH 7,4) og 5 mM glutaminsyre (SPG), og koncentrationen af ​​inklusionsdannende enheder (IFU'er) blev bestemt i HeLa-229-celler og McCoy-celler.

Ikke-menneskelige primater

Tredive cynomolgusmakaker (Macaca fascicularis) med en vægt på 3 til 5 kg blev inkluderet i undersøgelsen, der blev håndteret i biosikkerhedsniveau 3 (ABSL3) NHP-faciliteter hos IDMIT ("Infectious Disease Models and Innovative Therapies" ved CEA "Commissariat à l'Energie Atomique," Fontenay-aux-Roses, Frankrig; akkrediteringsnr. #D92- 032-02). Protokollerne blev godkendt af den institutionelle etiske komité "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) under erklæring nummer A14-026. Undersøgelsen blev godkendt af "Research, Innovation, and Education Ministry" under registreringsnummer APAFIS#720-201505281237660. Alle dyr blev testet negative for SIV, SHIV, STLV (simian Tlymphotropic virus), herpes B-virus, filovirus, SRV-1, SRV-2 før undersøgelsen og bekræftet at være seronegative for Chlamydia-infektion. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med europæiske retningslinjer for dyrepleje ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", direktiv 2010/63/UE, 22. september 2010).

Vaccinationsprotokoller

De 30 makakaber blev tilfældigt opdelt i 6 grupper med 5 dyr i hver. De forskellige vaccinations-prime-boost-regimer for de 6 grupper er illustreret i detaljer i figur 1. Under alle vaccinationer blev makakerne bedøvet med ketaminchlorhydrat (10 mg/kg legemsvægt intramuskulært). CTH522 (85 µg pr. dyr) blev administreret intramuskulært (IM) med enten CAF{{20}}1 adjuvans (625 µg/125 µg) eller AlOH-adjuvans (0.425 mg 1. IM-immuniseringer blev udført i 0,6 ml volumen i dyrets højre lår (M. quadriceps). CTH522 Intranasale (IN) immuniseringer (30 µg pr. dyr) blev udført med en Vaxinator-anordning forbundet til en 1 ml sprøjte med to på hinanden følgende indgivelser på 0,25 ml, en i hvert næsebor. DNA-MOMP-vaccinen blev administreret ad intradermal (ID) vej med elektroporation (EP) i huden på ryggen. 6 gentagne volumener på 0,1 ml blev injiceret ID (i alt 1 mg) efterfulgt af EP ved hjælp af Nepagen™-systemet (indstillinger: 6 square-ware pulser på 10 ms med 90 ms intervaller ved 110V, (300- 700mA)) . hAd5-MOMP-vaccinen blev administreret IM med en dosis på 1011 virale partikler i 1 ml pr. dyr. MVA-MOMP-vaccinen blev administreret IM med en dosis på 4*108 PFU pr. dyr i 0,5 ml volumen**. Den naive gruppe blev ikke vaccineret og blev anset for at være kontrolgruppen.

Samling af prøver

Under alle prøveudtagningsprocedurer blev makakerne bedøvet med ketaminchlorhydrat (10 mg/kg legemsvægt IM). Blod blev opsamlet via femoral venepunktur i uge 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Cervicovaginal væske til antistofpåvisning blev opsamlet med Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL , USA) i uge 4, 8, 16, 18, 20, 22 og 24. Cervicovaginale prøver til påvisning af klamydiabelastning blev indsamlet med almindelige flatlock-podninger (Mast Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Efter kontakt med den vagino-cervikale slimhinde blev podepinden anbragt i et hætteglas indeholdende UTM-RT-medium (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) og holdt på is.

Vaginal udfordringsinfektion med 5*107 IFU'er af C. trachomatis SvD

Dyrene blev bedøvet med ketaminchlorhydrat (10 mg/kg IM), anbragt i ventral liggende med hævede hofter, og 1 ml af inokulumet blev traumatisk påført direkte på vaginalslimhinden ved den vagino-cervikale overgang under anvendelse af en 1 ml sprøjte. En dosis på 5*107 IFU'er blev givet til hvert dyr. Dyret fik lov til at forblive i ventral liggende med deres hofter hævet i kort tid efter podningen.

Enzym-linked immunosorbent assay

CTH522specifikke antistofferi serum og podningsprøver blev påvist med en indirekte ELISA. Maxisorp® plader (NUNC A/S, Roskilde, Danmark) blev coatet med CTH522 (0,5 µg/ml) natten over ved 4 grader. Isotyperne IgG og IgA blev påvist med HRP-konjugerede antistoffer, der var specifikke mod ikke-humant primat-IgG (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75.{{10 }}) og IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, USA, 1:50.000). Reaktionerne blev visualiseret med TMB PLUS-substrat (KemEnTec, Taastrup, Danmark) og stoppet med 0,5 M svovlsyre. Pladerne blev aflæst på en ELISA-læser ved 450 nm med korrektion ved 650 nm. En positiv kontrol (serum fra en tidligere undersøgelse) blev brugt som en intern standard til at korrigere for plade-til-plade variation. To brønde blev kørt uden substrat som en negativ kontrol på hver plade. Antistoftitrene blev beregnet som det reciproke af den højeste fortynding med en optisk densitet (OD) værdi højere end cut-off. Cut-off blev bestemt fra dag 0 prøvegennemsnit plus 2*SD.

Peptid array og analyse

CTH522-peptid-arrayet blev designet med triplikater af immobiliserede 15-mer-peptider, der overlapper med 14 aminosyrer, som blev trykt på funktionaliserede objektglas og inkuberet med serumprøver af JPT Peptide Technologies, Berlin. Kort fortalt blev arrayet inkuberet med serumprøver indsamlet i uge 24, og IgG-peptidkomplekser blev visualiseret ved hjælp af biotinyleret gede-anti-abe-IgG og Alexa Fluor® 647 Streptavidin. Slides blev scannet med en højopløsningsscanner ved 635 nm, og data blev rapporteret som vilkårlige fluorescensenheder. Middelværdien af ​​tredobbelte værdier blev bestemt, hvis variationskoefficienten var større end 0.5, blev kun de 2 nærmeste værdier brugt. 10 procent af det maksimale intensitetssignal (65.535) blev brugt som cut-off for enpositiv respons, og middelsignaler under denne tærskel blev tildelt en værdi svarende til halvdelen af ​​tærskelværdien (3277).

In vitro neutralisationsassay

In vitro neutralisationsassayet blev udført for at teste de vaccine-inducerede serumantistoffers evne til at neutralisere Chlamydia-infektion af HaK-celler in vitro. Assayet fulgte hovedsageligt den tidligere beskrevne protokol (44). Først blev serumprøver fra individuelle dyr inkuberet ved 56 grader i 30 minutter for at inaktivere komplementet. Chlamydia-stamopløsning (SvD, SvE og SvF) blev blandet og inkuberet med seriefortyndinger af inaktiveret serum fra hvert af de vaccinerede dyr i 30 minutter og derefter podet på et monolag af HaK-celler i 96-brøndfladbunde plader i dubletter. Efter 30 timers inkubation blev celler og inklusioner fikseret og visualiseret med polyklonalt kanin anti-Ct043 serum og fluorescensmærket sekundært antistof (Alexa Flour 488, gede-anti-kanin IgG, A11008, Life Technologies) i fortyndingen 1:500 . Optælling af indeslutninger blev udført manuelt i 20 synsfelter ved 40x forstørrelse (Olympus IX71 inverteret fluorescensmikroskop). Neutralisering blev beregnet som den procentvise reduktion i det gennemsnitlige antal IFU'er sammenlignet med en pulje af sera fra kontrolgruppedyr (naive).

Intracellulær PBMC-cytokinfarvning og med-cytometri

PBMC'er blev isoleret og ({{0}} x 106 ) blev resuspenderet i 150 µl komplet medium indeholdende 0,2 µg af hvert costimulerende antistof CD28 og CD49b. Stimulering blev udført i 96 brønde/plader under anvendelse af 2 µM af hver peptidpulje eller SEB (som positiv kontrol) eller medium alene (som negativ kontrol). Brefeldin A blev tilsat til hver brønd i en slutkoncentration på 10 µg/ml, og pladen blev inkuberet ved 37 grader C, 5 procent CO2 natten over. Cellerne blev derefter vasket, farvet med et levedygtighedsfarvestof (violet, fluorescerende reaktivt farvestof, Invitrogen), fikseret og permeabiliseret med BD Cytofifix/Cytoperm-reagenset. Permeabiliserede celleprøver blev derefter opbevaret ved -80 grad før farvningsproceduren. Antistoffarvning blev udført i et enkelt trin efter permeabilisering. Alt det brugteantistofferer anført i tabel 1. Efter 30 minutters inkubation på is i mørke blev cellerne vasket i BD Perm/Wash buffer. Celler blev talt med en LSR II (BD) umiddelbart efter farvningsproceduren, og FlowJo-software blev brugt til dataanalyse.

TABEL 1 Antistoffer anvendt til farvning af immuncellemarkører og intracellulære cytokiner

Påvisning af vaginalt klamydiat DNA ved kvalitativ PCR

Abbott RealTime CT/NG-assayet (ABBOTT, Rungis, Frankrig) er et in vitro-polymerasekædereaktionsassay (PCR) til direkte, kvalitativ påvisning af plasmid-DNA for CT (C.trachomatis) og NG (N. gonorrhoeae) genomer . Nukleinsyre blev ekstraheret fra UTM (universal transport media) prøver på M2000SP og amplifikation blev udført på M2000SP i henhold til producentens instruktioner. Resultater blev udtrykt som cyklustærskel (Ct).

Statistisk analyse

Al statistik blev udført med GraphPad Prism-software (version 8.1.2). De ikke-normalfordelte data blev analyseret med ikke-parametriske tests; Kruskal–Wallis test og Dunns multiple sammenligningstest for at bestemme betydningen af ​​forskellen mellem grupper. Kurver, der viser procentvis PCR-negative dyr, blev sammenlignet med en log-rang (Mantel-Cox) statistisk test. Sammenligningerne blev betragtet som statistisk signifikante, hvis P-værdien var < 0.05 (P < 0.05). Yderligere niveauer af signifikans er angivet med stjerner *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Erklæring om datatilgængelighed

De originale bidrag præsenteret i undersøgelsen er inkluderet i artiklen/Supplerende materiale. Yderligere henvendelser kan rettes til den tilsvarende forfatter.

Etikerklæring

Dyreundersøgelsen blev gennemgået og godkendt af "Comité d'Ethique en Experimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) under erklæring nummer A14-026. Undersøgelsen blev godkendt af "Research, Innovation and Education Ministry" under registreringsnummer APAFIS#720-201505281237660.

Forfatterbidrag

Udtænkte og designet eksperimenter: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Udførte eksperimenter: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Producerede vacciner og antigenkonstruktioner: IR, PM, AO. Analyserede data: JD, EL, FF, IR, HJ. Udarbejdet og redigeret papiret: JD, EL, FF. Hver af de anførte medforfattere ydede væsentlige bidrag til arbejdet gennem design og udformning og/eller erhvervelse, analyse og fortolkning af dataene. Alle forfattere bidrog til artiklen og godkendte den indsendte version.

Anerkendelser

Vi takker Fondation Dormeur, Vaduz for donationen til Viral Evolution and Transmission Unit for laboratorieinstrumenter, der er relevante for dette projekt.

Interessekonflikt FF, IR, PA og AWO er medopfindere af en patentansøgning på vacciner mod klamydia [WO2014146663A1]. Alle rettigheder er overdraget til Statens Serum Institut, et dansk non-profit statsligt institut. De resterende forfattere erklærer, at undersøgelsen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Udgiverens bemærkning Alle påstande, der er udtrykt i denne artikel, er udelukkende forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis påstandene fra deres tilknyttede organisationer eller udgiverens, redaktørerne og anmelderne. Ethvert produkt, der kan evalueres i denne artikel, eller krav, der kan fremsættes af dets producent, er ikke garanteret eller godkendt af udgiveren.

Referencer

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, et al. Globale skøn over prævalensen og forekomsten af ​​fire helbredelige seksuelt overførte infektioner i 2012 baseret på systematisk gennemgang og global rapportering. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Dyrs klamydioser og zoonotiske implikationer. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Risiko for følgesygdomme efter chlamydia trachomatis genital infektion hos kvinder. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. Aktuelle barrierer, udfordringer og muligheder for udvikling af effektive STI-vacciner: synspunkt fra vaccineproducenter, biotekvirksomheder og finansieringsbureauer. Vaccine (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Korrelation af værtens immunrespons med kvantitativ genvinding af Chlamydia trachomatis fra den humane endocervix. Infect Immun (1983) 39(3):1491-4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Beskyttende effekt af større ydre membranproteinspecifikke immunoglobulin a (IgA) og IgG monoklonale antistoffer i en murin model af chlamydia trachomatis genital tract infektion. Infect Immun (1995) 63(12):4704-14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Undersøgelser i knockout-mus afslører, at anti-chlamydial beskyttelse kræver TH1-celler, der producerer IFN-gamma: er dette sandt for mennesker? Scand J Immunol (1997) 46(6):546-52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. CD4 plus T-celler er nødvendige og tilstrækkelige til at give beskyttelse mod chlamydia trachomatis-infektion i den øvre murine genitalkanal. J Immunol (2012) 189(5):2441-9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Evaluering af intra- og ekstraepitelial sekretorisk IgA ved klamydiainfektioner. Immunology (2014) 143(4):520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Divergerende resultater efter transcytose af IgG rettet mod intracellulære og ekstracellulære klamydiaantigener. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417-26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Beskyttelse mod Chlamydia trachomatis-infektion og patologiske ændringer i øvre genitalkanal ved vaccine-fremmede neutraliserende antistoffer rettet mod VD4 af det store ydre membranprotein. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 T-celle-vævsresident immunitet øger beskyttelsen, men er ikke påkrævet i en vaccinestrategi mod genital infektion med chlamydia trachomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: plus 86 15292862950

Tilføj cistanche supplement til indkøbskurven:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop