Modulering af aryl-carbonhydridreceptorens signalvejs indvirkning på Junín-virusreplikation, del 2

3. Resultater og diskussioner

3.1. AHR Pathway er overrepræsenteret under JUNV-infektion

Leveren er et af hovedmålene under JUNV-infektion [22]. For at belyse de molekylære mekanismer, der er involveret i en hepatocytinfektion, udførte vi en Affymetrix-mikroarray-screening for at bestemme de differentielt udtrykte gener i leverafledte humane HepG2-celler inficeret med JUNV IV4454 i 24 eller 48 timer.

Vi brugte Transcriptome Analysis Console-softwaren fra ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA til at evaluere de differentielt udtrykte gener i de JUNV-inficerede celler sammenlignet med kontrollen (figur 1a,b). I alt 266 og 313 differentielt udtrykte gener blev påvist ved henholdsvis 24 og 48 timer pi (figur 1a,b).

Affymetrix mikroarray-assay (n=3 uafhængige eksperimenter pr. tilstand). Værtsgener, der viser mindst en 1.6--fold ændring i ekspression og en 95 procents sandsynlighed for at blive udtrykt differentielt (p=0.05), blev overvejet til yderligere analyse. Gener vist med rødt blev opreguleret, gener vist med grønt blev nedreguleret, og gener i gråt viste ingen ændring i ekspression sammenlignet med uinficerede HepG2-celler. (b) Differentielt udtrykte gener mellem mock-inficerede og JUNV-inficerede HepG2-celler ved 48 timer pi. (c) Genontologi Analyse af differentielt udtrykte gener i JUNV-inficerede HepG2-celler ved 48 timer pi. (d) Pathway-overrepræsentationsanalyse af JUNV-inficerede HepG2-celler sammenlignet med falske inficerede celler, der viser de vigtigste signalveje påvirket under infektion. Den røde bjælke fremhæver AHR-vejen. Den stiplede blå linje angiver p=0.05. p-værdier blev bestemt af WebGestalt-software (http://www.webgestalt.org, tilgået den 3. juli 2020).

Der er en tæt sammenhæng mellem værtsgener og immunitet. Værtsgener bestemmer i høj grad udviklingen og funktionen af ​​en persons immunsystem og kan påvirke en persons modstand mod forskellige patogener.

Flere undersøgelser har vist, at visse genmutationer kan føre til ubalancer i immunsystemet. For eksempel kan nogle mennesker lide af sygdomme, hvor immunsystemet overreagerer, hvilket får immunsystemet til at angribe dets kropsvæv, såsom reumatoid, systemisk lupus erythematosus og andre sygdomme. Derudover er resistens over for patogener som bakterier, vira og parasitter også forbundet med genetiske forskelle. Nogle mennesker er født med et mere effektivt immunsystem, der fjerner patogener hurtigere og mere fuldstændigt.

Forskning i forholdet mellem værtsgener og immunitet har givet os en dybere forståelse af kroppens forsvarsmekanismer og har også hjulpet os til bedre at forstå kroppens reaktion på forskellige sygdomme. Dette har stor betydning for forebyggelse og behandling af sygdomme.

Derfor bør vi være opmærksomme på betydningen af ​​genetisk testning og lære og forstå forskellene i menneskelige gener for bedre at beskytte vores immunsystem, styrke vores fysik og opbygge en stærk krop. Fra dette synspunkt er vi nødt til at forbedre vores immunitet. Cistanche kan forbedre immuniteten markant, fordi Cistanche er rig på en række antioxidantstoffer, såsom C-vitamin, C-vitamin, carotenoider osv. Disse ingredienser kan opfange frie radikaler og reducere oxidativt stress. Stimulere og forbedre immunsystemets modstand.

Klik cistanche tubulosa fordele

For yderligere at studere virkningen af ​​JUNV på det cellulære landskab brugte vi WebGestalt-softwaren (http://www.webgestalt.org, tilgået den 3. juli 2020), som anvender Wikipathways-databasen som et opbevaringssted til at udføre en Gene Ontology-analyse ( figur 1c) og for at bestemme, hvilke signalveje, der var differentielt ændret sammenlignet med kontrol (figur 1d).

Med hensyn til genontologianalysen fra de differentielt udtrykte gener blev det konkluderet, at JUNV-infektion påvirker ekspressionen af ​​gener relateret til RNA-metabolisme, værtskinaser og lipidmetabolisme (figur 1c). Det er værd at bemærke, at disse biologiske processer og molekylære funktioner er blevet rapporteret at være målrettet af JUNV under dets replikationscyklus [23].

Endvidere afslørede Pathway Overrepresentation Analysis, at JUNV-infektion beriger AHR-signalvejen ved 48 timer pi (figur 1d) blandt mange andre veje (p < 0.05). Især detekterede vi en øget ekspression af AHR-målgenet CYP1B1, hvilket beviser en øget aktivitet af AHR-vejen.

I løbet af de sidste par år har adskillige undersøgelser afsløret vigtigheden af ​​AHR som et terapeutisk mål under forskellige patologiske scenarier; således er der udviklet en lang række små forbindelser til at modulere dens aktivitet. Vi besluttede at undersøge virkningen af ​​AHR-modulation under in vitro JUNV-infektion.

3.2. Farmakologisk modulering af AHR påvirker viral replikation

For at belyse den rolle, som AHR spiller i JUNV-infektioner, besluttede vi at teste virkningerne af kendte AHR-ligander CH223191 (antagonist) og kynurenin (agonist) på in vitro-infektioner med to forskellige JUNV-svækkede stammer: IV4454 og Candid#1. Behandlinger og infektioner blev udført ved hjælp af Huh-7- og Vero-celler. Da denne sidste cellelinje ikke kan udtrykke og udskille interferon type I (IFN-I), gør det det muligt at bestemme betydningen af ​​IFN-I-ekspression i det potentielle AHR-medierede vært-virus-samspil.

For det første blev cytotoksiciteten af ​​forskellige koncentrationer af både CH223291 og kynurenin evalueret via MTT-assay (figur 2a, b) og optisk mikroskopi observationer (figur 2c, d).

Med hensyn til CH223191 blev et fald i cellelevedygtigheden og morfologiske ændringer forbundet med cytotoksiske virkninger kun påvist ved koncentrationer på 80 µM (figur 2a, c). På den anden side inducerede kynurenin ikke cytotoksiske virkninger ved nogen testet koncentration (figur 2b,d).

For at undersøge effekten af ​​AHR farmakologisk modulering under JUNV-infektion blev cellekulturer behandlet med vehikel (DMSO), CH223191 eller kynurenin og derefter inficeret med JUNV i 48 timer for at bestemme viralt udbytte. Kort fortalt blev Vero- og Huh-7-celler vehikelbehandlet eller behandlet med forskellige koncentrationer af det lille molekyle CH223191 (2,5, 5 µM, 10 µM og 20 µM) eller kynurenin (5 µM, 10 µM, 20 µM og 40 µM) før og efter JUNV-infektion med IV4454 og Candid#1 ved en MOI på 0,5. Efter 48 timer blev supernatanterne høstet og brugt til at inficere Vero-celler til PFU-assayet (figur 3).

AHR-blokaden reducerede markant viral partikelproduktion på en dosis-respons måde, selv med den laveste koncentration af CH223191 testet. Det er vigtigt, at dette resultat ikke kun blev observeret under anvendelse af begge JUNV-svækkede stammer, men også i begge inficerede cellelinjer (Vero og Huh7). CH223191-behandlingen af ​​JUNV-inficerede Vero- og Huh-7-celler reducerede antallet af virale plaques med henholdsvis 93 procent og 97 procent (figur 3a,b). Disse resultater tyder stærkt på, at AHR-signalvejen er en vigtig cellulær faktor under JUNV-infektion (figur 3a,b). På den anden side ændrede kynurenin-administrationen før og efter JUNV-podning ikke signifikant den opnåede virale titer sammenlignet med viral kontrol (figur 3c, d).

Alt i alt viste resultaterne for første gang, at AHR er en vigtig cellulær faktor under JUNV in vitro-infektion, hvilket antyder en pro-viral rolle ved at lette den virale replikationscyklus.

3.3. AHR-modulation har en indflydelse på JUNV-proteinekspression

For yderligere at studere virkningerne af AHR-modulation på JUNV-infektion udførte vi et indirekte immunfluorescensassay. JUNV NP-proteinet er det mest udbredte strukturelle og funktionelle protein inden for Arenaviridae-familien. NP blev således valgt som et interessant farvningsmål i betragtning af, at kun få undersøgelser rapporterede NP-ekspressionsmønsteret for forskellige JUNV-svækkede stammer. Vores første skridt var at bestemme NP-fordelingen af ​​begge JUNV-stammer i vores cellulære modeller for at sammenligne de forskellige cellelinjers permissivitet og den virale spredning af begge svækkede stammer i disse cellekulturer (figur 4).

NP-lokaliseringen var udelukkende cytoplasmisk og udviste et homogent, stort punkteret akkumuleringsmønster, ens for begge stammer i Vero- og Huh-7-cellelinjer (figur 4).

Dernæst evaluerede vi ved immunfluorescens virkningen af ​​den farmakologiske modulering af AHR på NP-ekspression i JUNV-inficerede cellekulturer.

Kort fortalt blev celler podet over glasdækglas, forbehandlet med enten vehikel (DMSOCH223191 (10 uM) eller kynurenin (40 uM), og derefter spot-inficeret eller JUNV-inficeret i 48 timer. Bagefter blev celler fikseret og behandlet gennem en immunfluorescens assay (figur 5).

CH223191-administrationen reducerede bemærkelsesværdigt antallet af NP-positive celler i begge cellekulturer og for begge JUNV-stammer (figur 5). Disse observationer korrelerer med tidligere resultater vist i figur 3a,b. AHR-blokaden reducerede ikke kun procentdelen af ​​JUNV-inficerede celler, men også størrelsen af ​​virale foci. Vero-cellekulturer forbehandlet med CH223191 og inficeret med enten IV4454 eller Candid#1 viste henholdsvis en 57,14 procent (SD ± 7,98) og 41,17 procent (SD ± 9,05) reduktion i focistørrelse. Derudover viste Huh-7-cellekulturer, der var forbehandlet med antagonisten og inficeret med enten IV4454 eller Candid#1, en reduktion på henholdsvis 28,57 procent (SD ± 8,70) og 12,50 procent (SD ± 9,30) i focistørrelse. På den anden side blev det observeret, at behandlingen med kynurenin ikke ændrede procentdelen af ​​NP-positive celler (figur 5) eller foci-størrelse (ikke vist) sammenlignet med ikke-behandlede inficerede celler.

Desuden viste en mere detaljeret mikroskopisk inspektion, at virale foci var større i inficerede Vero-cellekulturer sammenlignet med Huh-7-inficerede cellekulturer. Vi observerede, at gennemsnittet af JUNV-inficerede Vero-celler pr. foci bestod af 35 celler, mens gennemsnittet af JUNV-inficerede Huh-7-celler pr. foci bestod af 6 celler. Denne forventede observation er i overensstemmelse med det begrænsede virale miljø, som IFN-kompetente celler påførte JUNV multiplikation [24].

3.4. AHR-undertrykkelse reducerer JUNV-virusniveauer

Til sidst, for at evaluere, om en AHR-blokade påvirker JUNV RNA-niveauerne, blev Vero- og Huh-7-celler behandlet med enten vehikel, CH223191 (10 µM) eller kynurenin (40 µM), og blev derefter mock- eller JUNV-inficeret for 48 timer. Bagefter blev cellemonolagene høstet og behandlet til RT-qPCR for at overvåge ahr-, cyp1a1- og np RNA-niveauer (figur 6).

Det blev observeret, at CH223191-behandlede og JUNV-inficerede celler udviste en tendens til lavere ahr-mRNA-niveauer sammenlignet med vehikelbehandlede-JUNV-inficerede prøver (figur 6a,b). Omvendt viste administrationen af ​​kynurenin en tendens til en forbedring af ahr-mRNA-niveauerne i JUNV-inficerede celler sammenlignet med vehikelbehandlede JUNV-inficerede prøver (figur 6a,b). I overensstemmelse med disse resultater viste behandling med CH223191 en tendens til en reduktion i cyp1a1-mRNA-niveauer i Huh-7-celler, mens behandling med kynurenin viste modsatte virkninger (figur 6c). Med hensyn til JUNV RNA-niveauet blev det observeret, at behandlingen med AHR-antagonisten CH223191 reducerede virale RNA-niveauer i inficerede celler sammenlignet med vehikelbehandlede-JUNV-inficerede prøver, mens kynurenin-behandlede og JUNV-inficerede celler havde en tendens til en stigning af virusset RNA-niveauer (figur 6d, e).

I dette arbejde viste vi for første gang, at in vitro JUNV-infektion inducerer aktiveringen af ​​AHR-signalvejen i leverafledte cellekulturer. Mikroarray-analysedata viste, at AHR-signalvejen er overudtrykt i JUNV-inficerede cellekulturer ved 48 timer pi.

Adskillige undersøgelser rapporterede, at AHR-aktivering kan have en række forskellige effekter på cellefysiologi, hvilket påvirker spredning og immune medfødte responser [6,25]. Faktisk er AHR-aktivering i det sidste årti blevet beskrevet som at have IFN-modulerende aktivitetsudøvende virkninger på cytokinsekretion [26,27]. Det er vigtigt, at AHR-opreguleringssignalering kan reducere IFN-I antivirale immunresponser [28]. Med hensyn til dette evaluerede vi virkningen af ​​AHR-signalvejsmodulationen på ikke-kompetente og kompetente IFN-cellekulturer, såsom Vero- og Huh-7-cellemodeller, ved hjælp af små kommercielle AHR-antagonist- og agonistmolekyler under in vitro JUNV-infektion med to forskellige svækkede stammer.

Gennem forskellige tilgange blev det bekræftet, at AHR negativ modulering via farmakologisk hæmning med CH223191 havde antiviral aktivitet mod JUNV. Efter AHR-blokaden blev JUNV in vitro-infektion fundet hæmmet. Et vigtigt fald i viral proteinekspression blev observeret i JUNV-inficerede cellekulturer behandlet med AHR-antagonisten. Desuden mindskede AHR-blokaden den ekstracellulære infektiøse virale partikelproduktion af både svækkede IV4454- og Candid#1-stammer af JUNV studeret i dette arbejde. Desuden blev der observeret en tendens til et fald i virale RNA-niveauer i CH223191-behandlede celler. Interessant nok blev disse fund observeret i både Huh-7- og Vero-cellelinjer og viste en tilsvarende størrelse, hvilket tyder på, at den pro-virale AHR-rolle under JUNV-infektion kan være uafhængig af IFN-I-signalvejen. Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere observationer i andre virale modeller [13]. Flere undersøgelser vil være nødvendige for at belyse, hvilket trin i JUNV-replikationscyklussen, der er påvirket af AHR-blokaden.

Undersøgelser, der viser AHR-aktivering af menneskeskabte ligander, har fået særlig interesse på grund af den voksende bevidsthed, der involverer ukorrekt miljøudnyttelse og dets samspil med viral infektions sværhedsgrad [2]. Bemærk, habitatområdet dækket af JUNV vektorgnavere omfatter et stort territorium; dog påvirker husholdningsfolie på nuværende tidspunkt kun en begrænset og afgrænset region, hvor der hovedsageligt udføres landdistriktsaktiviteter [29]. Desuden er landbrugsarbejdere den største befolkning, der risikerer at lide alvorlige manifestationer under AHF-sygdommen. Vores nuværende arbejde tyder på, at gnaver/menneskelig eksponering for AHR-agonister kan have en indflydelse på resultatet af JUNV-infektion.

Selvom der i de sidste årtier har været dedikeret en intensiv indsats til antiviral forskning mod arenavirus [30], er der i øjeblikket ingen specifik antiviral kemoterapi tilgængelig til behandling af AHF og humane sygdomme forårsaget af andre patogene medlemmer af Arenaviridae. Især er Lassa-virussen (LASV) agenten for Lassa-feber (LF), som repræsenterer en alvorlig menneskelig trussel i regioner i Vestafrika med en meget høj dødelighed [31]. På nuværende tidspunkt er den eneste alternative behandling mod LF off-label brugen af ​​guanosin-analogen ribavirin, som kun har vist sig at være delvist effektiv hos LF-patienter, hvis administrationen påbegyndes inden for 6 dage efter symptomdebut [32,33]. Endvidere kan ribavirin inducere uønskede bivirkninger, hvilket begrænser anbefalingen af ​​dets administration kun til patienter med høj risiko. Så er der en reel efterspørgsel efter nye effektive antivirale midler til behandling af arenavirus hæmoragiske feber. AHR repræsenterer et nyt værtsmål, der skal overvejes. Faktisk er der adskillige igangværende kliniske forsøg, der involverer AHR-hæmmere (BAY2416964, IK-175 og HP163) i behandlingen af ​​forskellige kræftformer. Ikke desto mindre er disse forsøg i de tidlige stadier, og ingen fokuserer på det antivirale potentiale af AHR farmakologisk målretning. Det er bemærkelsesværdigt, at lægemidler rettet mod cellefaktorer, der kræves i virusmultiplikationscyklussen, har genvundet interessen for antiviral udvikling, givet chancen for at opnå en bredspektret inhibitor, der påvirker et værtsmål, der er fælles for flere humane patogener [34,35], en funktion forbundet med AHR.

Som konklusion fremhæver de kombinerede resultater af denne undersøgelse relevansen af ​​AHR-signalvejmodulering som et potentielt terapeutisk mål mod JUNV. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at implementere AHR-målrettede terapier for at overvinde vigtige udfordringer, såsom levering af AHR-ligander til de ønskede væv og celler for at minimere mulige off-target AHR-modulationseffekter.

Forfatterbidrag:

Konceptualisering, CCG; metodologi, MAP, AEADL og ABM; software, FG; validering, MAP og FG; formel analyse, MAP og MFT; undersøgelse, MAP og MFT; ressourcer, EBD og CCG; datakuration, FG; skrivning – originalt udkast til forberedelse, MAP og MFT; skrivning – gennemgang og redigering, EBD og CCG; tilsyn, CCG; projektadministration, CCG; funding acquisition, EBD og CCG Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering:

Dette arbejde blev finansieret af Universidad de Buenos Aires (UBA) (bevillingsnummer 20020170100363BA) og Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (bevillingsnummer PIP11220170100171CO). EBD og CCG er medlemmer af forskerkarrieren fra CONICET; MFT, AEADL og ABM er stipendiater fra CONICET. MAP er en fellow fra UBA.

Udtalelse fra det institutionelle revisionsudvalg:

Ikke anvendelig.

Erklæring om informeret samtykke:

Ikke anvendelig.

Erklæring om datatilgængelighed:

De data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter rimelig anmodning.

Anerkendelser:

Vi takker alle medlemmer af de involverede laboratorier for nyttige råd og diskussioner.

Interessekonflikt:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansierne havde ingen rolle i udformningen af ​​undersøgelsen; i indsamling, analyser eller fortolkning af data; i skrivningen af ​​manuskriptet; eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.

Referencer

1. Hoved, JL; Lawrence, BP Aryl-carbonhydridreceptoren er en modulator af antiviral immunitet. Biochem. Pharmacol. 2009, 77, 642-653. [PubMed]

2. Torti, MF; Giovannoni, F.; Quintana, FJ; García, CC Aryl-carbonhydridreceptoren som en modulator af antiviral immunitet. Foran. Immunol. 2021, 12, 624293. [PubMed]

3. Shinde, R.; McGaha, TL Aryl-carbonhydridreceptoren: Forbinder immunitet til mikromiljøet. Trends Immunol. 2018, 39, 1005-1020. [PubMed]

4. Stockinger, B.; Hirota, K.; Duarte, J.; Veldhoen, M. Ydre påvirkninger på immunsystemet via aktivering af arylcarbonhydridreceptoren. Semin. Immunol. 2011, 23, 99-105.

5. Rothhammer, V.; Borucki, DM; Tjon, EC; Takenaka, MC; Chao, CC; Ardura-Fabregat, A.; de Lima, KA; Gutiérrez-Vázquez, C.; Hewson, P.; Staszewski, O.; et al. Mikroglial kontrol af astrocytter som svar på mikrobielle metabolitter. Nature 2018, 557, 724–728. [CrossRef]

6. Quintana, FJ; Basso, AS; Iglesias, AH; Korn, T.; Farez, MF; Bettelli, E.; Caccamo, M.; Oukka, M.; Weiner, HL Kontrol af Treg- og TH17-celledifferentiering af Aryl-carbonhydridreceptoren. Nature 2008, 453, 65–71. [CrossRef]

7. Marshall, NB; Kerkvliet, NI Dioxin og immunregulering: fremvoksende rolle for arylcarbonhydridreceptor i genereringen af ​​regulatoriske T-celler. Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1183, 25-37.

8. Vogel, CFA; Khan, EM; Leung, PSC; Gershwin, ME; Chang, WLW; Wu, D.; Haarmann-Stemmann, T.; Hoffmann, A.; Denison, MS Krydstale mellem Aryl-carbonhydridreceptor og inflammatorisk respons: En rolle for nuklear faktor-KB. J. Biol. Chem. 2014, 289, 1866-1875. [CrossRef]

9. Bankoti, J.; Rase, B.; Simones, T.; Shepherd, DM Funktionelle og fænotypiske virkninger af AhR-aktivering i inflammatoriske dendritiske celler. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010, 246, 18-28. [CrossRef]

10. Vogel, CFA; Goth, SR; Dong, B.; Pessah, IN; Matsumura, F. Aryl-carbonhydridreceptorsignalering medierer ekspression af indolamin 2,3-dioxygenase. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2008, 375, 331-335. [CrossRef]

11. Jin, GB; Moore, AJ; Hoved, JL; Neumiller, JJ; Lawrence, BP Aryl-carbonhydridreceptoraktivering reducerer dendritiske cellefunktion under influenzavirusinfektion. Toxicol. Sci. 2010, 116, 514-522. [CrossRef]

12. Giovannoni, F.; Bosch, I.; Polonio, CM; Torti, MF; Wheeler, MA; Li, Z.; Romorini, L.; Rodriguez Varela, MS; Rothhammer, V.; Barroso, A.; et al. AHR er en Zika-virus-værtsfaktor og et kandidatmål for antiviral terapi. Nat. Neurosci. 2020, 23, 939-951. [CrossRef]

13. Giovannoni, F.; Li, Z.; Remes-Lenicov, F.; Dávola, ME; Elizalde, M.; Paletta, A.; Ashkar, AA; Mossman, KL; Dugour, AV; Figueroa, JM; et al. AHR-signalering er induceret af infektion med coronavirus. Nat. Commun. 2021, 12, 5148. [CrossRef]

14. Buchmeier, MJ; de La Torre, JC; Peters, CJ Arenaviridae: Vira og deres replikation. In Fields Virology, 4. udg.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, USA, 2013; s. 1283–1303.

15. Enria, DA; Briggiler, AM; Sánchez, Z. Behandling af argentinsk hæmoragisk feber. Antivir. Res. 2008, 78, 132-139. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com