Methyljasmonat fremkalder karakteristiske hydrolyserbare tannin-, favonoid- og phyto-oxylipin-responser i granatæbleblade (Punica Granatum L.) Del 1

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt:Methyljasmonat (MeJA) produceret i planter kan mediere deres reaktion på miljøbelastninger. Eksogen anvendelse af MeJA har også vist sig at aktivere signalveje og inducere phytoalexin-akkumulering i mange plantearter. For at forstå, hvordan granatæbleplanter reagerer biokemisk på miljøbelastninger, blev metabolitanalyse udført i granatæbleblade udsat for MeJA-påføring og afslørede unikke ændringer i hydrolyserbare tanniner, flavonoider og Phyto-oxylipiner. Derudover identificerede transkriptom- og realtids-qPCR-analyser af mock- og MeJA-behandlede granatæbleblade differentielt udtrykte metaboliske gener og transkriptionsfaktorer, der potentielt er involveret i kontrollen afhydrolyserbartannin-, flavonoid- og phyto-oxylipin-veje. Molekylær, biokemisk og bioinformatisk karakterisering af den enestelipoxygenasemed vedvarende, MeJA-induceret ekspression viste, at det er i stand til at oxidere flerumættede fedtsyrer, selvom det ikke er placeret i det subcellulære rum, hvor ikke-jasmonat (ikke-JA) Phyto-oxylipiner blev produceret. Disse resultater antydede samlet, at mens den brede undertrykkelse af flavonoider og anthocyaniner er i det mindste delvist kontrolleret på transkriptionsniveau, er den inducerede biosyntese af ikke-JAPhyto-oxylipinerer sandsynligvis ikke reguleret transkriptionelt. Samlet set vil en bedre forståelse af, hvordan granatæbleblade reagerer på miljøbelastninger, ikke kun fremme plantesundhed og produktivitet, men også have en indvirkning på menneskers sundhed, da frugter produceret af granatæbleplanter er en rig kilde til ernæringsmæssige forbindelser.

Nøgleord:Methyljasmonat.Flavonoid·Anthocyanin· Fedtsyre.Phyto-oxylipin· Lipoxygenase

Klik venligst her for at vide mere

Introduktion

Når de såres eller angribes af planteædere og patogener, producerer og udsender planter methyljasmonat (MeJA), som opfattes af ikke-sårede plantevæv og naboplanter for at aktivere forsvarsrespons (Cheong og Choi 2003). Derudover har eksogen anvendelse af MeJA til en plante vist sig at fremkalde signalveje såvel som produktion af patogenese-relaterede proteiner og forsvarskemikalier kendt som phytoalexiner. Fenoliske phytoalexiner, f.eks. flavonoider og anthocyaniner, har udvist øget akkumulering som reaktion på MeJA-behandling i forskellige planter, såsom Arabidopsis thaliana, drue (Vitis vinifera), banan (Musa acuminate), æble (Malus Domestica) og rød hindbær (Rubus idaeus) )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res og Ruiz del Castillo 2014). Biosyntesen af ​​flavonoider og anthocyaniner begynder med dannelsen af ​​naringenin chalcon fra coumaroyl CoA og tre molekyler af malonyl CoA katalyseret af chalcone synthase (CHS) og den efterfølgende isomerisering af naringenin chalcone til naringenin af chalcone isomerase (CHI). Naringenin bruges derefter til at generere kerneflavonoid- og anthocyaninskeletterne, som yderligere modificeres med glycosyl-, methyl-, hydroxyl- og prenylfunktionelle grupper for at give anledning til forskellige strukturer og funktioner (Tian et al. 2008).

Cistanche kan forbedre immuniteten

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 procent lighed) og indeholder ikke et signalpeptid, hvorimod type II LOX'er har en generel lav sekvenslighed (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granatæble (Punica granatum L.) er en specialgartneriafgrøde værdsat for de rigelige phenolforbindelser i dens frugt, såsom flavonoider, anthocyaniner og hydrolyserbare tanniner (HT'er), der er afledt af et mellemprodukt af shikimat-vejen (Ono et al.2016) ). Mange undersøgelser har hidtil fokuseret på granatæblephenolernes rolle i at lindre stress og sygdom hos mennesker (Wu og Tian 2017). Derimod vides der lidt om phenolics og andre fytokemikaliers funktion til at forsvare granatæble mod abiotiske og biotiske faktorer (f.eks. sår, patogener, MeJA-induktion) i blade og frugter. To nylige rapporter evaluerede før-høst MeJA-behandling af efterhøst kvaliteten af ​​granatæble frugter (Koushesh Saba og Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Totalt antal anthocyaniner, flavonoider og phenoler af MeJA-behandlede frugter, men ikke blade, blev analyseret kollektivt ved hjælp af et spektrofotometer. Et af undersøgelserne analyserede også individuelle anthocyaniner ved hjælp af massespektrometri (Garcia-Pastor et al.2020). Det er dog stadig uklart, hvordan granatæbleplantevæv, enten blade eller frugter, reagerer på miljøbelastninger før frugtsættet.

For at begynde at dissekere interaktioner mellem granatæbleplanter og miljøfaktorer undersøgte vi granatæblebladenes metaboliske respons på eksogen MeJA-applikation ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) og væskekromatografi-elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS) . Unikke ændringer i HT'er, flavonoider og anthocyaniner samt ændringer i lipider, fedtsyrer og Phyto-oxylipiner blev observeret i granatæbleblade behandlet med MeJA. Sammenlignende transkriptomanalyse, valideret ved real-time qPCR-analyse, afslørede, at strukturelle og/eller regulatoriske gener involveret i HT-, flavonoid-, anthocyanin- og Phyto-oxylipin-metabolisme blev differentielt udtrykt i mock- og MeJA-behandlede granatæbleblade. Det eneste LOX-gen, der udviste en vedvarende opreguleret ekspression i MeJA-behandlede blade, blev udsat for yderligere molekylær, biokemisk og fylogenetisk karakterisering.

Materialer og metoder

Kemikalier

-glucogallin- og pentagalloylglucose-standarderne blev købt fra Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, Kina). Kemikalier anvendt i LOX-analysen blev opnået fra følgende leverandører: 3-(dimethylamino)benzoesyre (DMAB)(Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Kina), linolsyre(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),3-methyl-2-benzothiazolinon(MBTH) og hæmoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kina).

Plantematerialer

Granatæblefrugter og -frø (cv. Wonderful) blev generøst leveret af Panzhihua Academy of Agricultural and Forest Sciences og identificeret af Dr. Binjie Ge i Shanghai Chenshan Botanical Garden. Et voucher-eksemplar (nr. CSHO173966) blev deponeret i herbariet i Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai, Kina. Granatæblefrøplanter blev dyrket i et temperaturkontrolleret vækstrum i 6 uger ved 25 grader og 16 timer lyst/8 timer mørkt. MeJA-koncentrationen til sprøjtepåføring på plantevæv varierer angiveligt fra 100 til 250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al. 2017). Forskellige koncentrationer af MeJA blev oprindeligt påført granatæbleblade, hvoraf 200μM MeJA førte til et mærkbart metabolisk respons i den foreløbige analyse og blev brugt til metabolit- og genekspressionsanalyser beskrevet i denne undersøgelse. Forud for MeJA-behandlingen blev halvdelen af ​​granatæbleplanterne flyttet til et andet vækstrum med lignende forhold. Mens planterne i det ene vækstrum blev sprøjtet med 200 μM MeJA, blev planter i det andet vækstrum sprøjtet med vand (dvs. falsk kontrol). Ved 2-t,3-t,6- t,12-t,24-t, 30-t,36-t,48-t og72-t efter behandlingen, går fra 3 til 5 mock- eller MeJA-behandlede planter blev samlet, som udgør en biologisk replikat. Tre biologiske replikater blev indsamlet til mock- og MeJA-behandlingseksperimenterne; hvert biologisk replikat blev opdelt i alikvoter til metabolitprofilering og genekspressionsanalyser.

Metabolitprofileringsanalyse

Granatæbleblade blev lyofiliseret, vejet og malet til et fint pulver under anvendelse af zirconia-perler i en perlepisker (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Tyskland) i 90'erne ved 30 Hz. Til HPLC-analyse blev bladprøven ekstraheret i 70 procent methanol i 60 minutter under sonikering og centrifugeret ved 13,000 rpm i 10 minutter. Supernatanten blev overført til et HPLC-hætteglas, hvoraf 30 μL blev injiceret på en omvendt fase HPLC (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og analyseret som tidligere beskrevet (Wil-son et al.2019). Metabolitter blev påvist ved UV-absorption ved 254 nm, 280 nm, 320 nm og 360 nm. Standardkalibreringskurver for -glucogallin og pentagalloylglucose blev konstrueret; de blev brugt til at konvertere de områder af toppe, der matcher retentionstiderne og absorptionsspektrene for -glucogallin og pentagalloylglucose til de respektive koncentrationer.

Til LC-ESI-MS/MS-analyse blev den homogeniserede bladprøve (100 mg) ekstraheret i 1 ml 70 procent methanol ved 4 grader Covernight. Den følgende dag blev den methanoliske ekstrakt centrifugeret ved 10°C. ,000×g i 10 minutter, og supernatanten blev ført gennem en CNWBOND Carbon-GCB SPE-patron (ANPEL, Shanghai, Kina) og et 0.22-μm sprøjtefilter (ANPEL) før metabolitanalyse.

Ekstraktet (2 μL) blev analyseret ved hjælp af LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og en omvendt fase C1s-søjle (ACQUITY UPLC HSS T3,1,8 m, 2,1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA). Metabolitter blev elueret under anvendelse af opløsningsmidler(A)vand indeholdende 0,04 procent eddikesyre ,og(B)acetonitril indeholdende 0,04 procent eddikesyre ved en gradient på 0-11 min,95-5 procent A;11-12 min,5 procent A;12-12,1 min. ,5-95 procent A;12.1-15min,95 procent A. Strømningshastigheden blev holdt på 0,4 ml min.-1. Lineær ionfælde (LIT) og triple quadrupole (QQQ)MS-scanninger blev erhvervet i positiv- og negativ-ion-tilstande. Turbosprayionkilden blev drevet ved 500 grader C med en ioniseringsspænding på 5500 V. Ionkildegassen I, gas I og gardingas blev indstillet til henholdsvis 55 psi, 60 psi og 25 psi. Kollisionsgassen (nitrogen) blev indstillet til 5 psi. Til MRM-analysen blev declusteringspotentiale (DP) og kollisionsenergi (CE) optimeret for hver precursor-produktionovergang.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 blev betragtet som væsentligt ændret.

Transkriptomanalyse

Total RNA blev ekstraheret fra granatæbleblade under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og kvantificeret ved hjælp af Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Integriteten af ​​RNA-prøverne blev verificeret gennem adskillelse på en agarosegel (ingen synlig nedbrydning) og bestemmelse af OD20/28o-forholdet (mellem 1,8 og 2,2) ved hjælp af Nanodrop2000. Berigelse af mRNA fra totalt RNA blev udført under anvendelse af oligo (dT) magnetiske perler (Invitrogen). mRNA-Seq biblioteker blev konstrueret under anvendelse af Truseq RNA bibliotekets forberedelseskit (Illumina, San Diego, CA, USA). Transkriptomanalyse blev udført på Illumina HiSeq4000, og 55-60 millioner af 150-bp parrede ende-læsninger (PE150) blev opnået for hvert prøvebibliotek.

De rå sekvensdata blev behandlet ved at fjerne adaptersekvenserne samt korte(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, og justeret P-værdi<>

qPCR-analyse i realtid

Total RNA blev ekstraheret fra mock- og MeJA-behandlede granatæbleblade under anvendelse af RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, Kina). Omvendt transkription (RT) blev udført under anvendelse af total RNA og PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). Kvantitativ PCR(qPCR) blev udført ved anvendelse af TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus)kittet ( Takara) og et StepOnePlus Real-Time PCR-system (Ther-moFisher Scientific). Smeltekurveanalyse blev udført og viste et enkelt amplifikationsprodukt for hvert primerpar. Til RT-qPCR-analysen blev tre biologiske replikater og hver med tre tekniske replikater undersøgt for mock- og MeJA-behandlede prøver. Genekspression blev analyseret ved hjælp af den sammenlignende C,(△AC)-metode (Livak og Schmittgen 2001), og signifikansniveauer blev bestemt ved hjælp af en tosidet Student's t-test. Primersekvenserne for real-time qPCR-analysen og amplifikationseffektiviteten af ​​primerparrene er vist i tabel S1.

Ekspression og oprensning af rekombinante proteiner og enzymassays

Den åbne læseramme for Pgr025417 (der koder for en formodet LOX) blev syntetiseret til optimal kodonanvendelse i E. coli (Genewiz, Suzhou, Kina) og klonet i pET28a. Det rekombinante plasmid blev transformeret til E. coli BL21 (DE3) celler. En 5-mL Luria Bertani (LB)-kultur med 50ug mL-Ikanamycin blev startet fra en enkelt koloni og inkuberet natten over under omrystning ved 37C. Kulturen natten over blev anvendt til at inokulere et 100-mL LB-medium med 50 ug mL-'kanamycin og fik lov til at vokse til en OD600 på 0,5. Isopropyl- -D-thiogalactosid(IPTG) blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 0,1 mM til induktion af proteinekspression. Efter inkubation med omrystning ved 16 grader i 18 timer blev cellerne høstet ved centrifugering. Cellepelleterne blev resuspenderet i lysisbufferen (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 10 mM imidazol) og homogeniseret under anvendelse af en celleforstyrrelse (Constant Systems Ltd, Northants, UK). His-mærkede proteiner blev oprenset vha. Ni-NTA-perler (ThermoFisher Scientific) med vaskebufferen (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 25 mM imidazol) og elueringsbufferen (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 500 mM imidazol). De oprensede proteiner blev separeret på en 10% SDS-PAGE gel til visualisering af proteinrenhed. Koncentrationen af ​​de oprensede proteiner blev bestemt ved anvendelse af Bradford-assayet (Bradford 1976).

Til LOX-assayet blev linolsyre brugt som substrat i en to-trins, kolorimetrisk metode med små modifikationer (Anthon og Barrett 2008). 500-μL reaktionsblandingen, inklusive 50 mM Na-phosphat, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM linolsyre og forskellige mængder af oprensede rekombinante proteiner (1,5 mg mL-), blev inkuberet ved 25 grader i 10 min. En anden opløsning (500 μL) indeholdende 0,2 mM MBTH og 0,1 mg mL-'hæmoglobin blev tilsat til reaktionsblandingen, som blev inkuberet i yderligere 5 min. Reaktionen blev afsluttet ved at tilsætte 500 μL 1 procent (vægt/volumen) natriumlaurylsulfat. Lysabsorption ved 598 nm blev bestemt.

Subcellulær lokalisering og fylogenetiske analyser

En søgning i det kommenterede granatæblegenom (Qin et al. 2017) identificerede 1 l formodede fuldlængde LOX'er (786 aa til 970 aa), inklusive Pgr025413,Pgr020032,Pgr025418,Pgr0254018,Pgr0254017,P8254019,P82gr P125417, P810419, P82gr, P825417, P825419, sekvens i fuld længde i GenBank XP_031395793),Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 og PgrO13780. Subcellulær lokalisering og spaltningssteder for signalpeptider for granatæble-LOX'erne blev forudsagt ved hjælp af TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

TF-bindingssted analyse

For at forudsige bindingsstederne for TF'er blev 1000 bp opstrøms for ATG-startkodonet for målgenerne opnået fra GenBank og søgt mod Eucalyptus Grandis TF'erne i PlantRegMap (version 5) (Tian et al. 2020). Tærskelværdien for binding webstedsidentifikation blev sat til P Mindre end eller lig med le-4.

Statistisk analyse

Statistisk analyse for metabolitkvantificerings-, transkriptom- og realtids-qPCR-data er beskrevet i de respektive afsnit.

Resultater

MeJA modulerer cellesignalering og metaboliske veje i granatæbleblade

For at forstå granatæblets transskriptionelle respons i hele genomet på MeJA-fremkaldelse, transkriptomer af granatæbleblade ved 2-h,6-h,24-h og 72-h efter MeJA eller mock behandling (hver med tre biologiske replikater) blev analyseret (fig. S1). Cirka 55 millioner rå sekvenslæsninger (2 × 150 bp parret ende) blev opnået for hvert transkriptom med GC-indhold omkring 52 procent og Q30-værdier varierende fra 91,6 til 95 procent (tabel S2). For alle transkriptomer blev mere end 96 procent af de rensede sekvensaflæsninger kortlagt til referencegranatæblegenomet (Qin et al.2017) (tabel S3). Et flertal af de samlede transkripter var mindre end 1000 bp (34,3 procent ),1000 bp— 2000 bp (32,9 procent) eller 2000 bp—3000 bp (18,1 procent) (tabel S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, justeret P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

Shikimate- og HT-pathway-gener og HT-metabolitter blev induceret i MeJA-behandlet granatæbleblad Som afsløret i transkriptom- og KEGG-pathway-berigelsesanalysen viste tre shikimate biosyntetiske pathway-gener opreguleret ekspression i MeJA-behandlede blade i forhold til falske kontroller ved {{3 }}h, herunder 3-deoxy-D-arabinose-heptulosonat-7-phosphatsyntase (DAHPS), 3-dehydrogenatsyntase(DHS) og den bifunktionelle 3-dehydrogenatdehydratase/ shikimatdehydrogenase (DHQ/SDH; forkortet SDH)(fig. S1b og la). Især tre isoformer af granatæble-SDH'er blev identificeret og viste differentiel ekspression i transkriptomanalysen, Pgr020271, Pgr019030 og Pgr019029,

For at bestemme, om ændringer i mængden af ​​shikimat- og HT-biosyntetiske gentranskripter kan påvirke niveauet af metabolitter afledt af disse veje, blev phenoliske metabolitter ekstraheret fra blade høstet ved 24-h, 30-h. 36-h,48-h og 72-t efter MeJA eller falsk applikation og analyseret ved HPLC(fig.2). Det skal bemærkes, at disse tidspunkter blev valgt for at tage højde for den nødvendige tid til proteinsyntese og metabolitproduktion og -akkumulering efter de observerede ekspressionsændringer af shikimat- og HT-biosyntetiske gener ved 6-h. Retentionstiderne og absorptionsspektrene for to metabolitter elueret efter 4,57 min (top 1) og 24,98 min (top 2) matchede dem for HT pathway-mellemprodukterne -glucogallin og Penta-legeringer-glucose, henholdsvis (fig. la og 2a). Begge toppe viste signifikante ændringer i integrerede topområder på flere tidspunkter (fig. 2b). Specifikt steg top 1 i MeJA-behandlede blade i forhold til falske kontroller ved 30-h, 36-h og 48-h(fig.2b). Interessant nok faldt top 2 i MeJA-behandlede blade oprindeligt ved 24-h, men steg efterfølgende ved 30-h og 36-h, før de vendte tilbage til et niveau svarende til falske kontroller ved 48- h og 72-h (fig. 2b).

Reduktion af de fleste flavonoider og anthocyaniner samt øgede methylerede flavoner og flavonoler var tydelig i MeJA-behandlede granatæbleblade

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tabel S5 og S6). For de differentielt akkumulerede metabolitter var der en generel berigelse af metabolitter involveret i plantesekundær/specialiseret metabolisme (67 af 102), især phenolforbindelser (63 af 102) (tabel S6).

Blandt phenoler var en samlet reduktion i en bred vifte af flavonoider og anthocyaniner (42 af de 73 nedsatte forbindelser) tydelig i MeJA-behandlede blade (Fig. 3; Tabel S6). Spændende nok blev tre mono- eller di-O-methylerede flavoner og flavonoler, inklusive di-O-methylquercetin, chrysoberyl O-hexosyl-O-hexosid og sælgende 5-O-hexosid, øget i MeJA-behandlede blade (Fig. 3; Tabel S6). Adskillige mellemprodukter af flavonoid- og anthocyanin-vejene, herunder luteolin, chrysoberyl, dihydrokaempferol, dihydroquercetin, dihydromyricetin, epicatechin, delphinidin og pelargonidin, var påviselige, men viste ikke signifikante ændringer i MeJA-behandlede blade (Fig.3); Hydroxycin-namoyl-derivater, isoflavoner og coumariner var blandt andre phenoler, der viste reduceret akkumulering ved MeJA-induktion (tabel S6). I modsætning hertil var to phenolsyrer, 2,3-dihydroxybenzoesyre og protocatechuic acid (3,4-dihydroxybenzoic acid) og en coumarin, 6-methylcumarin, øget i MeJA-behandlede blade (Tabel S6).

I overensstemmelse med de stort set reducerede flavonoider og anthocyaniner i MeJA-behandlede granatæbleblade, transskriptionerne af to nøgleenzymer til flavonoid- og anthocyaninbiosyntese. CHS(Pgr005566) og CHI (Pgr025966) blev signifikant reduceret ved 6-t og 24-t efter MeJA-påføring ifølge transkriptomanalysen (fig. 4). Realtids qPCR-analyse blev udført for at undersøge CHS- og CHI-udtryk med yderligere tidspunkter, herunder 2-h, 3-h, 6-h,12-t,{{ 11}}h,48-h og 72-h (fig.4). CHS-transkriptioner faldt i MeJA-behandlede blade ved 3-h og forblev betydeligt lavere end dem i mock kontroller indtil 72-t, med det største fald ved 12-t. I modsætning hertil var reduktionen i CHI-ekspression kun signifikant ved 24-t, 48-t og 72-t efter MeJA-behandling (fig. 4).

Denne artikel er uddraget fra Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9