Metaanalyse af NAD(P)(H)-kvantificeringsresultater udviser variation på tværs af pattedyrsvæv Ⅱ

Effekten af præmortem versus post-mortem vævsopsamling på NAD(P)(H)-niveauer.

Vi forudsagde, at der kan være en observerbar forskel i NAD(P)(H) redoxtilstand, der er afhængig af vævshøstprocedurer. For at besvare dette spørgsmål undersøgte vi effekten af præ-versus post-mortem vævsopsamlingsprocedurer på NAD(P)(H) redoxstatus. Til denne analyse sammenlignede vi værdier fra rottelevervæv givet det større antal undersøgelser, der definerer deres offerprotokol. Når de blev afsløret, anførte alle de gennemgåede undersøgelser, at vævsprøverne blev holdt kolde og straks ekstraheret på is eller frosset ved -80 grader før NAD(P)(H)-målinger. Denne analyse bestemte, at der ikke var nogen signifikant forskel i NAD plus koncentrationer i rottelever (fig. 6a) mellem væv ekstraheret før eller efter eutanasi. Imidlertid er de rapporterede NADH-niveauer i rottelever signifikant højere i post-mortem prøver (fig. 6b). Ingen forskelle i totale NAD(H)-niveauer (fig. 6c) blev observeret, men NAD plus/NADH-forholdet var lavere i væv indsamlet efter eutanasi (fig. 6d), hvilket er i overensstemmelse med variationen observeret i NADH-niveauer. NADP plus, NADPH og NADP plus/NADPH-forholdet resulterer i rottelever grupperet efter vævshøsttidspunkt er vist i Supplerende Fig. 9; det utilstrækkelige antal obduktionsprøver tillader os imidlertid ikke at fortolke virkningen af vævshøsttidspunkt på NADP(H)-niveauer. I muselever var der ingen forskel mellem præ- og post-mortem NAD plus niveauer, dog var antallet af rapporterende undersøgelser begrænsende (fig. 6e). IngenNADH,NADP plus, ellerNADPHpost mortem data imuselevervar tilgængelig til sammenligning.

Flavonoid (2)

Klik her for at få Hebrs Cistanche

Diskussion

Mange nyere undersøgelser har vist, at NAD(P)(H)-regulering er afgørende for cellulær homeostase og redoxstatus. Data opnået fra gnavere har ført til undersøgelser, der undersøgte NAD plus-niveauer i humant blod som en mindre invasiv indikator for NAD plus-niveauer i hele kroppen. Nylige kliniske undersøgelser viste, at NAD plus-niveauer blev reduceret i sygdomstilstande23,47 og forhøjede efter NAD plus boostningsstrategier23,44,48,49. Vi udførte en meta-analyse af alle undersøgelser offentliggjort mellem 1946 og 20. juni 2021, der indeholdt kvantitative data for NAD(P)(H)-niveauer i pattedyrarter med særligt fokus på mus, rotter og mennesker, da de repræsenterer de fleste undersøgt arter inden for det biomedicinske område. Denne analyse blev delvist udført for at bestemme det gennemsnitlige standardniveau for NAD(P)(H)-koncentrationer i normalt pattedyrvæv givet den velkendte varians i disse mål på tværs af undersøgelser. Vi håber, at disse data kan bruges til at stimulere standardiserede protokoller inden for NAD plus forskning og til at fremme brugen af NAD(P)(H) niveauer og redoxforhold som pålidelige biomarkører for sygdoms- og behandlingsregimer.

På trods af betydelig variation i mål på tværs af gnavervæv viste denne metaanalyse lignende gennemsnitlige NAD plus niveauer på tværs af væv med nogle undtagelser. Det er interessant, at museskeletmuskulatur udviste lavere median NAD plus-niveauer (fig. 2a) end andre stærkt metaboliske væv (dvs. lever, nyre, hjerte og hjerne). Dette kan indikere forskellige NAD(H) redoxstatusser i skeletmuskulaturen eller kan pege på større problemer med metabolitekstraktion i fibrøst væv. Imidlertid kunne disse observationer ikke verificeres hos mennesker på grund af mangel på prøvet væv ud over blod og muskler.

Flavonoid-1

Der er mange potentielle faktorer, der kan påvirke nøjagtigheden af fysiologiske NAD(P)(H)-målinger i vævsprøver. Når de blev rapporteret, beskrev alle undersøgelser, at væv blev høstet og direkte nedsænket i flydende nitrogen eller holdt på is før frysning eller behandling for at bevare de varmefølsomme fraktioner (NAD plus og NADP plus). Effekten af pH på de forskellige NAD(P)(H)-fraktioner, såsom den syrelabile natur af de reducerede NAD(P)H-former, har ført til brugen af pH-neutrale ekstraktionsopløsningsmidler i størstedelen af undersøgelserne . Men i betragtning af den hurtige indbyrdes omdannelse af de reducerede og oxiderede metabolitter og virkningen af anoxi på NAD(H)50-53, er det også vigtigt at sikre hurtig ekstraktion af vævsmetabolitter og de passende procedurer til at slukke cellulær NAD(P)(H) )-redox/forbrugsenzymer, såsom gennem deproteinisering. På denne måde indikerer vores analyse af præ-versus post-mortem vævsopsamling, at post-mortem analyse favoriserer reduktionen af NAD plus. Reduktionen af vævs-NAD plus er tidligere beskrevet in vivo i hjernen, hjertet og leveren hos rotter, der er udsat for en længerevarende 2.5-h hypoxisk atmosfære54, et miljø, der kan være delvist rekapituleret af længere perioder med post- ofre vævsopsamling før snapfrysning. Dette kan indikere, at ekstraktion af væv under bedøvelse eller prioritering af den øjeblikkelige høst af væv, der er beregnet til at blive brugt til metabolitanalyse efter aflivning, bør ske for at opnå repræsentative NAD(P)(H)-målinger.

Der er også potentiale for, at forskellige kvantificeringsmetoder, som hver har forskellige begrænsninger, kan bidrage til den overordnede intra-undersøgelsesvariabilitet af NAD(P)(H)-målinger. I de sidste to årtier var de mest anvendte metoder enzymcyklusanalyser, LC-MS og HPLC. Hver af disse metoder er påvirket af metabolitekstraktionsteknikker, kvantificeringsparametre og implementering af korrekt kvalitetskontrol. Ved at bruge LC-MS, Lu et al. har vist, at interkonverteringen mellem reducerede og oxiderede former af NAD(P)(H)-metabolitter sker med forskellige hastigheder i forskellige ekstraktionsbuffere eller opløsningsmidler med acetonitril:methanol:vand med 0.1 M myresyreblanding, hvilket giver højeste gendannelse med færrest interkonverteringer31. Men ved brug af LC–MS kan denne interkonvertering overvåges mellem individuelle prøver af en undersøgelse ved at spike med interne kontroller såsom NAD(P)(H)-isotoper, hvilket er en fordel ved LC–MS-teknikken i forhold til HPLC og enzym cykling assays31,33,55. Ikke desto mindre, selv med velkontrollerede LC-MS-teknikker, kan forskellige faktorer interferere med det målte signal, herunder matrixeffekter og variationer i ioniseringseffektivitet. For eksempel bruger nogle undersøgelser 13C-mærkede gærekstrakter som interne standarder i LC-MS-baseret metabolomik. Men tilsætning af den ekstraherede prøvemetabolitmatrix med en 13C-mærket gærekstraktmetabolitmatrix kan have forskellige konsekvenser, såsom ionundertrykkelse, hvilket reducerer signalet fra mærkede og/eller umærkede metabolitter og kan føre til fejl i den absolutte kvantificering, hvis ikke opdaget ved en grundig kvalitetsvurdering56. Selvom LC-MS-teknikker teoretisk giver mulighed for måling af flere NAD(P)(H)-metabolitter i et eksperiment, er der stadig begrænsninger, da optimale fortyndinger skal køres, hvis metabolitterne af interesse har store forskelle i koncentrationer. På trods af deres fordele i forhold til de simplere enzymcyklusassays pålægger kompleksiteten af LC-MS-metoder således nødvendigheden af grundig optimering. For nylig er der udviklet nye analytiske metoder, såsom NAD plus biosensorer og billedbaseret massespektrometri, men der er stadig utilstrækkelige kvantitative data genereret fra disse teknikker til at inkludere i en meta-analyse. Selvom en undersøgelse inkluderet i vores meta-analyse brugte en papirbaseret bioluminescerende biosensor til at måle NAD plus-niveauer i muselever og andre prøvetyper57. Denne undersøgelse blev inkluderet i gruppen med bioluminescerende assays på grund af den lignende detektionsmetode (fig. 1a).

Flavonoid

Til formålet med denne analyse blev data fra 677 undersøgelser udelukket. Dette omfattede undersøgelser, der gav relative NAD(P)(H)-resultater (51 procent ) snarere end kvantitative, samt undersøgelser, hvor NAD(P)(H) koncentrerer sigvar ikke normaliseret tilvævsvægt, proteinindhold, ellerblodvolumen(13 procent). 36 procent af de udelukkede undersøgelser blev udført på ikke-egnede prøver (f.eks. ikke-pattedyrspersoner, celle- eller vævskulturer). Ud over de udelukkede undersøgelser omfatter væsentlige begrænsninger i denne metaanalyse variationen af eller mangelen på rapporteret information relateret til præanalytiske procedurer (før- eller post-mortem ekstraktion eller ekstraktionsbufferinformation) og/eller de analytiske metoder sammen med med alder, køn, genetisk baggrund, kost og fodringsstatus ved ofring for gnavere.

Selvom vores metaanalyse fremhæver variabiliteten mellem undersøgelser og nødvendigheden af at standardisere NAD(P) (H) kvantitative målinger, vurderer eller diskuterer vores analyse ikkevaliditeten af de sammenlignende resultaterinden for en individuel undersøgelse. I betragtning af implikationerne af flere NAD(P)(H)-metabolitter, der fungerer som biomarkører forsundhed hos mennesker, standardiseringen eller grundig undersøgelsesoptimering af præanalytiske oganalytiske procedurervil give mulighed forbedre sammenligninger af resultater på tværs af undersøgelser. Dette bliver endnu mere afgørende med en stigningantal kliniske undersøgelser, der tester effekten af lægemidler eller kosttilskud, der bruges til at ændre vævets NAD(P)(H)-niveauer tilforbedre sundheden hos mennesker.

Flavonoid (11)

Metoder

Litteratursøgning. "Epub Ahead of Print", "I proces & andre ikke-indekserede citater", "Versions", "PubMed-Not-MEDLINE", "Daglig opdatering", "Ugentlig opdatering af frontsegment", "Tilbage flyder fra 1946 til start foransegment"-citater mellem 1946 og 20. juni 2021 i MEDLINE ALL (Ovid)-databasen blev søgt oggennemgået for artikler, der indeholder kvantitative data for NAD(P)(H)-metabolitniveauer i pattedyrvæv som udeforet i bilag S1. Søgestrategien gav 3377 artikler. En yderligere blod-fokuseret søgning varudført ved hjælp af samme database og gav 1513 artikler (bilag S2).

Screeningsmetode. Abstrakter og titler, der rapporterer NAD(P)(H)-metabolitkvantificering i pattedyrsvæv og -blod, gennemgik fuldtekstscreening. Alle abstrakte anmeldelser blev verificeret med en anden anmeldelseog eventuelle konflikter blev løst. Efter den abstrakte screening blev 643 publikationer udvalgt til fuldtekstgennemgang forden vævsfokuserede søgning og 272 for den blodfokuserede søgning (Supplerende Fig. 10). Undersøgelser, der kun førsendte relative NAD(P)(H)-metabolitdata blev udelukket under fuldtekstscreeningen, med undtagelse afundersøgelser, der rapporterer NADplus/NADH-forhold. Resultater afledt udelukkende af tssues, celler, isolerede organeller vedligeholdti medier eller fra blodeluent fra perfusion blev udelukket. Denne fuldtekstgennemgang førte til udelukkelsen af 667(457 plus 210) artikler, primært på grund af manglen på NAD-metabolitdata (50,5 procent), data afledt af ikke-egnedeprøver (36,3 procent) eller data præsenteret som relative/vilkårlige enheder (13,2 procent). Endelig blev 241 artikler inkluderet iden kvalitative meta-analyse og 205 i den kvantitative meta-analyse (Supplerende Fig. 10). Selvom voresindledende søgning inkluderede undersøgelser publiceret fra 1946 til 20. juni 2021. Som nævnt ovenfor var den ældste undersøgelse medkvantitative NAD(P)(H)-data, der opfyldte vores acceptkriterier, blev offentliggjort i 1961

Dataudtræk.

Numeriske data for NAD(P)(H)-metabolitter blev enten opnået direkte fra artiklerne eller ekstraheret fra artikelfigurer ved hjælp af en semi-automatisk dataekstraktionssoftware (WebPlotDigitizer58). Derudover, hvor det er relevant, blev vævsprøvetagningstidspunkterne i forhold til aflivning og/eller vævs-/blodprøvetagningsmetoder (dvs. bedøvelses- og/eller eutanasimetode, vævshåndtering og opbevaringstemperatur) registreret. For dyremodeller blev arten, karakteristika (f.eks. stamme, genotype, alder og vægt) og miljøforhold (f.eks. søvncyklus, diættype, fodringsfrekvens og fødetilstand i forhold til vævsprøvetagning) registreret. For alle undersøgelser blev behandlinger (f.eks. farmakologiske behandlinger, operationer, bestråling, tumorinduktion og andre procedurer anvendt på forsøgspersonerne) og alle undersøgelsesgruppeoplysninger (f.eks. behandlings- eller sygdomsgrupper og tilsvarende kontroller) ekstraheret. Endelig metoden til NAD(P)(H) kvantificeringsmetode (f.eks. enzymatiske assays, massespektrometri-baserede, HPLC, NMR, bioluminescens) og publikationsspecifikationer (dvs. publikationstitel, referencekode [DOI, Medline UI, PMID] eller hyperlink og udgivelsesår) blev noteret (Supplerende materiale 2).

Dataanalyse. Før analyse blev alle koncentrationer omdannet til nmol/g væv eller nmol/g proteiner for vævsprøver eller nmol/ml for blodfraktioner. På grund af det lave antal resultater normaliseret til proteinindhold, viser vi kun resultater normaliseret til vævsvægt og blodvolumen. Statistisk analyse blev udført med GraphPad Prism version 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, Californien, USA,DatatilgængelighedAlle data udtrukket og analyseret i løbet af denne undersøgelse er inkluderet i denne publicerede artikel og dens supplerendeinformation fles.Modtaget: 29. april 2022; Accepteret: 7. februar 2023

Referencer

1. Menzies, KJ, Zhang, H., Katsyuba, E. & Auwerx, J. Proteinacetylering i metabolisme-metabolitter og cofaktorer. Nat. Rev. Endocrinol. 12, 43 (2016).

2. Chambon, P., Weill, JD, Doly, J., Strosser, MT & Mandel, P. Om dannelsen af en ny adenylforbindelse ved hjælp af enzymatiske ekstrakter af leverkerner. Biochem. Biofys. Res. Commun. 25, 638-643 (1966).

3. Hassa, PO, Haenni, SS, Elser, M. & Hottiger, MO Nuklear ADP-ribosyleringsreaktioner i pattedyrsceller: Hvor er vi i dag, og hvor skal vi hen?. Microbiol. Mol. Biol. R 70, 789-829 (2006).

4. Takasawa, S., Nata, K., Yonekura, H. & Okamoto, H. Cyklisk ADP-ribose i insulinsekretion fra pancreas beta-celler. Science 259, 370-373 (1993).

5. Wolf, IMA et al. Frontløbere af T-celleaktivering: Indledende, lokaliserede Ca2 plus-signaler medieret af NAADP og type 1 ryanodinreceptoren. Sci. Signal. 8, ra102 (2015).

6. Malavasi, F. et al. Udvikling og funktion af ADP Ribosyl cyclase/CD38 genfamilien i fysiologi og patologi. Physiol. Rev. 88, 841-886 (2008).

7. Gasser, A., Bruhn, S. & Guse, AH Anden budbringerfunktion af nikotinsyre-adenindinukleotidphosphat afsløret ved en forbedret enzymatisk cyklusanalyse*. J. Biol. Chem. 281, 16906-16913 (2006).

8. Kulkarni, CA & Brookes, PS Cellulær kompartmentering og redox/non-redox-funktionerne i NAD plus. Antioxid. Redox Signal.31, 623–642 (2019).

9. Xiao, W., Wang, R.-S., Handy, DE & Loscalzo, J. NAD(H) og NADP(H) redoxpar og cellulær energimetabolisme. Antioxid. Redox signal. 28, 251-272 (2018).

10. Love, NR et al. NAD-kinase kontrollerer animalsk NADP-biosyntese og moduleres via evolutionært divergerende calmodulin-afhængige mekanismer. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 1386-1391 (2015).

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950

Bioaktive fytokemikalier af citrus reticulata frø - et eksempel på affaldsprodukt rig på sund hudfremmende midler del 2

Metaanalyse af NAD(P)(H)-kvantificeringsresultater udviser variation på tværs af pattedyrsvæv