Mekanistisk undersøgelse af Cistanche-baseret Xian Fang Huo Ming-drik til behandling af kronisk prostatitis: Integreret netværksfarmakologi og eksperimentel validering rettet mod PI3K/Akt/NF-κB-vejen
Oct 27, 2025
2. Metoder
2.1 Netværksfarmakologi og molekylær dockinganalyse
2.1.1 Identifikation af aktive komponenter og sygdomsmål
Ved hjælp af TCMSP-databasen blev aktive forbindelser i den Cistanche-baserede Xian Fang Huo Ming-drik (XFHY) screenet med ADME-kriterier: oral biotilgængelighed (OB) større end eller lig med 30 % og lægemiddellignende (DL) større end eller lig med 0,18. Potentielle mål for disse forbindelser blev identificeret ved hjælp af SwissTargetPrediction (sandsynlighed større end eller lig med 0,1). Et "urte-forbindelse-mål"-netværk blev konstrueret ved hjælp af Cytoscape 3.9.1, og de fem bedste forbindelser blev identificeret baseret på grad af centralitet. Samtidig blev CP/CPPS-relaterede sygdomsmål indsamlet fra GeneCards, OMIM og DisGeNET ved hjælp af nøgleord som "kronisk prostatitis" og "prostatitis."
Cistanche-ekstrakttilskud til prostata- og nyresundhed PhGs75% Ech 30% Act 12%
2.1.2 Identifikation af krydsmål
Skæringspunktet mellem XFHY-forbindelsesmål og CP/CPPS-sygdomsmål blev bestemt ved hjælp af Venny 2.1-software til at generere et Venn-diagram, der identificerer vigtige potentielle terapeutiske mål.
2.1.3 PPI-netværkskonstruktion
Skæringsmål blev importeret til STRING-databasen (art: Homo sapiens; interaktionsscore > 0,9). Det resulterende protein-protein interaktion (PPI) netværk blev importeret til Cytoscape, og kernemål blev identificeret ved hjælp af CytoHubba baseret på netværkstopologiparametre såsom grad, mellemhed og nærhed.
2.1.4 Opbygning af netværket "Herb–Compound–Target–Pathway"
Ved hjælp af Cytoscape 3.9.1 blev en netværksmodel bygget til at visualisere forholdet mellem XFHY, dets aktive forbindelser, mål og signalveje. Netværksparametre blev analyseret for at bestemme nøgleknuder.
2.1.5 GO og KEGG berigelsesanalyse
Skæringsmål blev uploadet til DAVID-databasen for Gene Ontology (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway-berigelsesanalyse (P < 0,05). Resultaterne blev visualiseret via bioinformatikværktøjer.
2.1.6 Molekylær docking
De fem bedste forbindelser (f.eks. quercetin, kaempferol) blev brugt som ligander, og de ti bedste kernemål fra PPI-netværket som receptorer. Proteinstrukturer blev opnået fra Protein Data Bank (PDB), forbehandlet ved hjælp af AutoDockTools 1.5.6 (inklusive dehydrering, hydrogenering og ladningstilsætning) og konverteret til PDBQT-format. Ligandstrukturer i MOL2-format blev opnået fra TCMSP og på lignende måde konverteret. Molekylær docking blev udført ved hjælp af AutoDock, og bindingsaffiniteter blev visualiseret ved hjælp af GraphPad Prism 8.
2.2 Dyreforsøg
2.2.1 Modeletablering
En kemisk induktionsmetode blev brugt til at modellere CP/CPPS. Rotter blev bedøvet med 3% pentobarbitalnatrium (50 mg/kg). Et midtlinjesnit blev lavet i den nedre del af maven, og 80 μL 3% λ-carrageenan blev injiceret i hver lateral lap af prostata (i alt 160 μL). Sham-opererede rotter modtog saltvandsinjektioner. Postoperativ behandling inkluderede topisk antibiotikaanvendelse. På dag 7 blev modelleringssucces bekræftet via grov og histologisk undersøgelse af prostata (ødem, overbelastning, epiteldegeneration og inflammatorisk infiltration).
2.2.2 Gruppering og behandling
Halvfjerds SD-hanrotter blev tilfældigt opdelt i syv grupper (n=10):
Normal kontrol
Sham operation
Model kontrol
Lav-, mellem- og højdosis XFHY-grupper
Tamsulosin gruppe
Doserne blev beregnet baseret på human ækvivalent dosis (7,29 g/kg/dag). XFHY blev administreret via oral sondeernæring ved 0,3645 g/ml (lav) og 1,458 g/ml (høj). Tamsulosin blev indgivet ved 0,0018 mg/kg. Alle behandlinger varede 28 dage, startende 8 dage efter modellering.
2.2.3 Histopatologisk evaluering
Venstre prostatalapper blev fikseret i 4% paraformaldehyd, indlejret i paraffin, sektioneret og farvet med hæmatoxylin-eosin. Histologiske ændringer blev evalueret under lysmikroskopi.
2.2.4 ELISA for inflammatoriske markører
Blod opsamlet via abdominal aorta blev centrifugeret, og serumniveauer af TNF-, IL-1 og COX-2 blev målt ved hjælp af ELISA-sæt i henhold til producentens instruktioner.
2.2.5 qRT-PCR til genekspression
Total RNA blev ekstraheret fra prostatavæv og revers-transkriberet til cDNA. Real-time PCR blev udført under anvendelse af specifikke primere for PI3K, Akt og NF-KB p65. GAPDH blev brugt som en intern kontrol. Relativ ekspression blev beregnet ved hjælp af 2^-ΔΔCt-metoden.
2.2.6 Western blot til proteinekspression
Protein blev ekstraheret fra frosset prostatavæv under anvendelse af RIPA-buffer. Efter kvantificering blev proteiner separeret ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner og probet med primære antistoffer mod PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt (Ser473/Thr308), NF-KB p65 og p-NF-KB p65. HRP-konjugerede sekundære antistoffer og ECL-detektion blev anvendt. Båndintensiteter blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ.
2.2.7 Statistisk analyse
Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Data were analyzed using GraphPad Prism 8 and expressed as mean ± standard deviation. One-way ANOVA followed by LSD or Dunnett's test was used for multiple group comparisons. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
3. Resultater
3.1 Netværksfarmakologi og molekylær docking
Sammensat-mål skæringspunkt:912 sammensatte mål og 2.197 sygdomsmål gav 374 overlappende mål.
Topforbindelser identificeret:Quercetin, kaempferol, pelargonidin, naringenin og byakangelicol - alle med kendte antiinflammatoriske og antioxidante virkninger.
PPI-analyse:Nøglemål inkluderede TP53, AKT1, EGFR, TNF, IL6, STAT3, BCL2, CASP3, CCND1 og NFKB1.
GO og KEGG berigelse:Berigede veje inkluderede PI3K/Akt, MAPK, RAS og inflammationsrelaterede biologiske processer.
Molekylær docking:Stærke bindingsaffiniteter blev observeret mellem kernemål og hovedforbindelser (bindingsenergi mindre end eller lig med -5,0 kcal/mol), hvilket tyder på høj bioaktivitet.
3.2 Eksperimentel validering
3.2.1 HE-farvning
Modelgrupperotter viste kirtelepiteldegeneration, stromalt ødem og omfattende inflammatorisk infiltration. XFHY-behandlede grupper udviste reduceret inflammation, især i mellem- og højdosisgrupper.
3.2.2 Niveauer af inflammatoriske markører
Sammenlignet med modelgruppen reducerede XFHY signifikant serum-TNF-, IL-1- og COX-2-niveauer (P < 0,01), hvilket indikerer anti-inflammatorisk effekt.
3.2.3 Genekspression (qPCR)
XFHY reducerede signifikant mRNA-niveauer af PI3K, Akt og NF-KB p65 på en dosisafhængig måde. Lav-dosis reduceret kun Akt og p65; mellem- og højdosisgrupper viste bredere suppression.
3.2.4 Proteinekspression (Western Blot)
Fosforyleringsniveauer af PI3K, Akt (Ser473, Thr308) og NF-KB p65 var signifikant forhøjet i modelgruppen og reduceret i XFHY-behandlede rotter, især ved mellemstore og høje doser.
4. Diskussion
Med udgangspunkt i klinisk erfaring bekræfter denne undersøgelse detCistanche-baseret XFHYhar en bemærkelsesværdig antiinflammatorisk effekt på CP/CPPS. Netværksfarmakologi identificerede især vigtige aktive forbindelserquercetin, med dokumenterede antiinflammatoriske og antioxidante egenskaber. PPI-analyse fremhævede mål som f.eksTNF, IL6, ogAKT1, som er centrale for betændelse ved prostatitis.
KEGG-analysen foreslog inddragelse afPI3K/Akt/NF-KBsignalvej bredt anerkendt inden for inflammation og immunregulering. XFHY kan udøve terapeutiske virkninger ved at hæmme denne vej og dermed reducere pro-inflammatorisk cytokinekspression.
Ydermere ser den dobbelte phosphorylering af Akt (Ser473 og Thr308) ud til at være kritisk for NF-KB-aktivering. XFHY hæmmede phosphorylering på begge steder, hvilket tyder på hæmning af NF-KB-signalering gennem opstrøms Akt-undertrykkelse.
Konklusion
XFHY kan lindre CP/CPPS ved at blokere PI3K/Akt/NF-KB-vejen, hvilket reducerer ekspression afIL-1, TNF-, ogCOX-2og dæmpende inflammatoriske reaktioner i prostatavæv. Pathwayens involvering, især phosphoryleringen af Akt ved Ser473 og Thr308, giver en potentiel mekanistisk forklaring på XFHY's effektivitet. Yderligere forskning er berettiget for at bekræfte, om PI3K/Akt/NF-KB er den definitive vej, gennem hvilken XFHY udøver sin terapeutiske virkning.
Interessekonflikt:
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Sig til, hvis du vil have engrafisk abstrakt, oversigtstabel, ellerPowerPoint-præsentationbaseret på denne undersøgelse!
