Mekanistisk indsigt i diosmin-induceret neurobeskyttelse og hukommelsesforbedring i intracerebroventrikulær-quinolinsyre-rottemodel: Genopstandelse af mitokondrielle funktioner og antioxidanter, del 2

2.8. Roman Objekt Genkendelse Opgave (NORT).

Standardprotokol blev fulgt som givet af Kumar og Bansal [23]. NORT er en urentabel og ikke-fjendtlig eksteroceptiv arketype, der anvendes til at vurdere den arbejdende type erindringshukommelse, der udnyttes gennem gnaveres impulsive sonderingsadfærd. Undersøgelsen udføres i et tag-åbent krydsfinerformet kar (80 cm × 42 cm × 62 cm), placeret i et roligt område, oplyst af en 60W LED for at styre ensartet lysstyrke i fartøjet.

Gnavere er en type små pattedyr, der lever på Jorden. De lever ofte i græsarealer, skove og andre steder. De lever et blidt liv og er korte og søde. Sammenlignet med andre organismer har gnavere en stærk fordel i hukommelsen, og mange undersøgelser har vist, at gnaveres hukommelse er langt ud over vores fantasi.

Hjernen hos gnavere er meget fleksible, især når de beskæftiger sig med opgaver relateret til lagring af information. Mange eksperimenter har vist, at gnaveres hukommelse endda kan overstige andre store pattedyrs hukommelse. I eksperimentet forsynede nogle forskere gnavere som mus og hamstere med en masse forskellige steder, genstande, begivenheder og anden information og observerede derefter deres reaktioner og bearbejdning af denne information. Det viste sig, at disse gnavere klarede sig meget godt i hukommelsen og kunne endda huske mange forskellige informationer og scener, endda bedre end de fleste mennesker.

Så hvorfor er gnavere bedre til at huske end andre dyr? Dette er uadskilleligt fra gnaveres livsmiljø. Disse små dyr lever ofte i farlige omgivelser, så de skal lære at tilpasse sig hurtigt og overleve. For at opretholde deres overlevelse og reproduktion skal gnavere forstå ændringer i det omgivende miljø og information såsom andre dyrs og planters aktivitetsbaner. Dette kræver, at de har fremragende observations- og hukommelsesevner, så de bedre kan tilpasse sig levemiljøet.

Derudover kan gnaveres livsstil og adfærdsvaner også hjælpe med at forbedre deres hukommelse. Nogle undersøgelser har vist, at gnavere kan lide at samle og opbevare genstande, hvilket kan fremme deres hukommelse og rumlige opfattelse. Derudover kan gnavere også godt lide at udføre nogle rutinemæssige aktiviteter, såsom at bevæge sig langs en bestemt rute og udføre den samme type opgaver. Denne rutinemæssige adfærd kan også hjælpe dem med at styrke deres hukommelse og vanedannelsesevner.

I den biologiske verden har gnavere en unik hukommelse, og de har stærke observations-, hukommelses- og tilpasningsevner. For os kan gnaveres hukommelse svare til vores indlærings- og hukommelsesevner. Vi kan lære af gnavere, at så længe vi forbliver forsigtige, fortsætter med at lære og akkumulerer i vores studier og liv, kan vi også have de samme fremragende hukommelses- og vanedannelsesevner som gnavere. Dette viser, at vi skal forbedre vores hukommelse, og Cistanche kan forbedre vores hukommelse markant, fordi Cistanche også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer, som er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche deserticola forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelig næring og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på Kend hukommelsesforbedring

Cylinder (hvid), pyramide (rød) og terning (sort)-formede (12 cm høje) trægenstande (i identiske trillinger) var solide og af vægt nok til at gøre dem ubevægelige af gnavere. NORT blev udført på den 16. dag i 3 trin (S): akklimatisering (S1), erhvervelse (S2) og ny objektgenkendelsesundersøgelse (retention) trin (S3). Under S1, tre på hinanden følgende dage, før forsøgene blev udstedt for at opdage den ledige gulvbund af karret (5 minutter) af rotterne. Efter afslutningen af ​​S1 blev det enkelte dyr vænnet til ethvert sæt af faste genstande i indlæringsstadiet (S2).

Tvillinglignende ting blev placeret i 2 vilkårligt udvalgte modsatrettede vinkler af karret (9 cm til 11 cm mellemrum fra sidevoldene). Separat blev en gnaver placeret i midten af ​​karret vendt modsat de to faste genstande og fik lov til at opdage de to lignende genstande i 5 minutter. At føre snuden i nærheden af ​​genstanden i en afstand på mindre end eller lig med 2-3 cm eller fysisk kontakt med genstanden med mundkurven blev antaget som efterforskningsmæssig adfærd.

Efter S2 blev gnaveren anbragt i et hjemmebur, der var sporet af en intertrial reces (ITR) på 60 minutter.

Enhver enkelt fast genstand, der blev tilbudt i S2, blev byttet ud med en anden soliditem, og gnaverne blev præsenteret igen for tvillingemnerne, dvs. en kopi af den kendte genstand og den forskellige genstand. mindske sandsynlige fordomme fremkaldt af en forkærlighed for visse indstillinger eller genstande. .e beholder og faste genstande blev omhyggeligt aftørret (ethylalkohol 15% og tør klud) efter hver undersøgelse for at dæmme op for de lugtende tegn. .e tidsforbrug at opdage hvert element i S2 og S3 blev dokumenteret ved hjælp af et stopur. .e varighed brugt på at undersøge de to matchende elementer i S2 (I1 � Ii1 + Ii2) og varigheden brugt på at undersøge de to forskellige elementer, dvs. kendte og forskellige, i S3 (I2 � Ii3 + Ib) blev optaget. Variansen i varigheden brugt på at undersøge det forskellige emne og varigheden af ​​undersøgelsen af ​​det kendte emne (Ib–Ii3 � DI) afslører bevarelsen af ​​den kollektive hukommelse.

DI (diskrimineringsindeks)/S3 varighed(er) af at undersøge både det kendte og det nye emne (ændret DI) forbedrer partialiteterne ved afvigelser i den fuldstændige undersøgelse og angiver hang til forskellige emner i modsætning til kendte {DI � (Ib–Ii3 )/(Ii3 + Ib)}. Rekollektiv hukommelse blev vurderet ved at kvantificere gnaveres færdigheder for at udskille de velkendte/novelitter i S3 og blev angivet som DI (ændret for den samlede undersøgelsesperiode i S3) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). .e standardprotokol blev fulgt, som givet af Kumar og Bansal [25]. MWM bedømmer den rumlige hukommelse ved at svømme forsøg, hvor gnaveren finder en flugtvej til et skjult podium.

En sortfarvet cirkulær tank (2 m diameter, 0,6 m højde) havde vand (25 ± 1 grad) fyldt til en dybde på 0,3 m. .is akvatiske reservoir blev adskilt med uret i 4 lignende områder (R1, R2, R3 og R4) ved hjælp af to nylonfibre, fastgjort vinkelret på tankens øvre omkreds.

En dais (10,5 cm x 10,5 cm) blev placeret under vandet (1 cm under vandet) i reservoirområdet R4. .e plet af podiet forblev intakt gennem hele erhvervelsesperioden. Hver eneste rotte blev præsenteret for fire serielle erhvervelsesrunder (5 minutter ITR) hver dag. .e gnaver blev forsigtigt sluppet ud i det akvatiske reservoir, der vendte mod tankvæggen, hvor stedet varierede med hvert enkelt forsøg fra R1-R4, R2-R1, R3-R2 og R{{ 13}}R3 på henholdsvis dag 1 til 4, og det var tilladt 120 sekunder at detektere undervandspodiet. .e gnavere fortsatte med at hvile på podiet i 20 sekunder.

En manglende opdagelse af platformen inden for 120 sekunder indikerede den manuelle placering af rotten på platformen, og derefter fik de 20 sekunder på platformen. Escape latency time (ELT) er varigheden/varighederne af opdagelse af den skjulte dais i det akvatiske reservoir. Spatial læring var præget af dag ét vs. dag fire ELT.

I sondeforsøget (5. dag) undersøgte gnaverne reservoiret i 120 sekunder, men blev frataget podiet. Den gennemsnitlige varighed brugt i hele reservoiret (4 regioner) blev registreret. .e gennemsnitlige varighed brugt i R4 (TSTQ: tid brugt i målkvadrant) sondering for det skjulte podium blev anset som et indeks for referencehukommelse. .komparativ indstilling af tanken i forhold til de emner i laboratoriet, der fungerer som visuelle tegn, og efterforskerens position forblev uforstyrret [26].

2.10. Estimering af biokemiske parametre. Efter at have afsluttet adfærdsundersøgelserne blev hele hjernen af ​​teraterne samlet og placeret på pulveriserede isterninger, efterfulgt af badning med frysende steriliseret saltvand (isotonisk 308 mOsmol/l NaCl) for at fjerne rester og blod.

Homogenisering af hele hjernen blev øjeblikkeligt udført i en fryseseparationsbuffer (pH 7,4) med sammensætningen 215 mM D-mannitol, 20 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl )piperazin-1-yl]ethansulfonsyre, 1 mM 1,2-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethoxy]ethan, 75 mM saccharose og 0,1 % BSA. Homogenatet blev centrifugeret ved 4 grader under anvendelse af 13000 x g kraft i 5 minutter. .e pellet blev afvist, og supernatanten blev adskilt i to portioner og blev gencentrifugeret (4 grader) ved 13000 x g kraft i 5 minutter. Den rå mitokondrielle pellet blev separeret og igen centrifugeret i en separationsbuffer med 1,2-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethoxy]ethan ved 12.500 x g i 11 minutter (4 grader). Den således opnåede halvfaste aflejring omfattende ikke-kontaminerede mitokondrier blev resuspenderet i en separationsbuffer (pH 7,4) indeholdende 75 mM saccharose, 20 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1- yl]ethansulfonsyre og 215 mM D-mannitol [27].

Senere blev mitokondrialfraktionen af ​​helhjernehomogenatet brugt til at bestemme de biokemiske markører ved hjælp af standardmetoder.

2.11. Estimering af mitokondriekompleks

2.11.1. NADH: Ubiquinon Oxidoreductase-aktivitet.

.erate af kompleks I (NADH dehydrogenase) aktivitet blev kvantificeret (nmol NADH oxideret/minut/mg protein) ved at følge teknikken ifølge King og Howard [28]. .eoxidativ generering af NAD+ fra NADH er ledsaget af cytochrom c-reduktion. .e assayblanding bestod af cytochrom c (10,5 mM), 6 mM -nicotinamidadeninedinucleotid (DPNH) opløst under anvendelse af 2 mM diglycinbuffer og diglycinbuffer (0,2 M, pH 8,5).

En opløselig mitokondriel fraktion blev inkorporeret i assaysammenkogningen for at udløse reaktionen. .e variation i optisk densitet (OD) ved λmax � 550 nm blev fulgt i 120 sekunder.2.11.2. Succinat: Ubiquinon Oxidoreductase Activity..e hastigheden af ​​succinat dehydrogenase (kompleks II) aktivitet blev kvantificeret (nmol succinat oxideret/minut/mg protein) ved at følge Kings teknik [29].

Ravsyreoxidation udløses af en falsk elektronmodtager, kaliumcyanoferrat (K3Fe(CN)6). .e assayblanding bestående af ravsyre (0,63 M), 1 % BSA, K3Fe(CN)6 (0.036 M) og Na+-K+ [PO4]2- buffer (0,23 M, pH 7,6). En opløselig mitokondriel fraktion blev inkorporeret i assaysammenkogningen for at udløse reaktionen. .e variation i OD vedλmax � 420 nm blev fulgt i 120 sekunder.

2.12. Bestemmelse af biomarkører for oxidativ stress2.12.1. iobarbitursyrereaktive stoffer (TBARS). For at evaluere TBARS (nmol pr. mg protein) [30], analysekombinationen (afsluttende mængde ~4 ml) omfattende 0.10 ml homogeniseret hjerne, 1,51 ml 4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidin (0,8 %), 200 µl SLS (8,18 %), 1,49 ml iseddikesyre (21 %, pH 3,51) og 0,71 ml deioniseret vand blev udsat for vandbad opvarmning ved 96 grader i 60 minutter.

En butylalkohol/azabenzen i forholdet 15:1 (5,1 ml) blev suppleret i analysesammensætning, der blev centrifugeret ved 4, 000 x gpower (10 minutter), og supernatanten blev isoleret. Med et twin-beam UV1700 spektrofotometer (Shimadzu, Japan), kromofor malondialdehyd-4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidin OD blev vurderet ved en bølgelængde (λmax � 532 nm) og ε.� 105/M/cm (molær ekstinktionskoefficient) blev anvendt til at beregne 4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidinaddukter.

2.12.2. Reducerede niveauer af glutathion (Lc-Glutamyl-L-Cysteinyl-glycin). Ellmans [31] procedure blev implementeret for at vurdere indholdet af L-glutathion (GSH). .e testsammensætningsomfattende homogenat (1,1 ml) og 1 ml 4 % 2-hydroxy-5-sulfobenzoesyre (5-SSA) blev centrifugeret (4 grader) i 11 minutter ved 2.500 × g effekt .

Senere 2,8 ml Na+-K+[PO4]2- buffer (51,2 mM, pH 7,77) og {{10}},21 ml 3-carboxy{{13 }}nitrophenyldisulfid (0,12 mM, pH 7,89) blev blandet med den ovenfor adskilte supernatant (0,12 ml). Tripeptid (µmolGSH pr. mg protein) blev kvantificeret med twin-beam UV1700 spektrofotometer (λmax � 412 nm). påføring � 1,36 × 104/M/cm.

2.12.3. Glutathionperoxidaseaktivitet. .e-aktiviteten af ​​glutathionperoxidase (GPx) (EC 1.11.1.9) blev vurderet ved at implementere teknikken ifølge Mohandas et al. [32]. .analyseblanding bestående af 100 µl 10% homogenat, 100 µl natriumazid (1,11 mM), 100 µl EDTA (1,13 mM), 40 µl glutathion-disulfidreduktase (GSR, 1 IE/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0,28 mM), 40 µl Lc-glutamyl-L-cysteinyl-glycin (1,2 mM), 100 µl coenzym II reduceret tetranatriumsalt (0,22 mM) ) og 0,12 M 1,49 ml Na+-K+ [PO4]2-buffer (pH 7,4) i en hel mængde på 2000 µl. .e tab af coenzym II-reduceret tetranatrium ved λmax � 340 nm blev dokumenteret ved en temperatur på 25 grader.

GPx-hastigheden blev beregnet som nmol NADPH oxideret/minut/mg protein under anvendelse af ε� på 6,22 × 103/M/cm.

2.12.4. Superoxiddismutaseaktivitet. .e hastigheden af ​​SOD (EC1.15.1.1) virkning (enheder pr. mg protein) blev overvejet ved proceduren ifølge Kakkar et al. [33]. .e reaktionsblanding involverede 0,3 ml homogenat, 100 µl 5-methylphenaziniummethylsulfat (197 μM) og 1,3 ml natriumdiphosphat under anvendelse af 200 µl -nicotinamidadenindinukleotid (DPNH)(7)80 μM standset 60 sekunder senere under anvendelse af 1 ml glacialCH3COOH i denne blanding.

Den genererede kromogenmængde blev beregnet ved at notere farvestyrken ved λmax� 56{{10}} nm.2.12.5. Catalase aktivitet. For at vurdere hastigheden af ​​katalase (EC1.11.1.6) virkning, OD-afvigelsen (λmax � 240 nm) af den analyserede blanding (3,0 ml) omfattende 50 µl undersøgelsesprøve, 1,22 ml H2O2 (0,03 M) i Na+-K+ [PO4]2--buffer (pH7,91, 0,06 M) og 1,63 ml 0,06 M Na+-K+ [PO4]{{33} } buffer (pH 7,1) blev registreret. Katalaseaktivitet (µmol H2O2 faldt pr. minut pr. mg hjerneprotein) blev beregnet ved at anvende ε � 43,6/M/cm [34].

2.12.6. Hele nitritniveau. .e teknik af Sastry et al.[35] blev implementeret til at evaluere hele hjernenitrit (μmolper mg hjerneprotein). I reagensglas, der omfatter 100 µl-undersøgelsesprøve, blev 145 mg amalgam af kobber-cadmium, 500 µl H2CO3-buffer (pH 8,89), 0,44 M 100 µl NaOH og 119,8 mM 400 µl Z0nSO4-effekt centrifugeret ved 500 µl Z00 µl. i 10 minutter, og den overflødige øvre væske (supernatant) blev isoleret.

Griess kemikalie (50 µl) var inkluderet i 100 µl af den overflødige væske. Efter 60 minutters inkubation blev OD (λmax � 548 nm bølgelængde) noteret ved anvendelse af et twin-beam UV1700 spektrofotometer (Shimadzu). En typisk kurve af salpetersyrlig natrium (0,02-0,2 mM) blev designet, og hele nitrittet blev sammenlignet.

2.12.7. Bestemmelse af totalproteiner. .e overordnede proteinniveau (mg/ml homogenat) blev beregnet ved hjælp af atypisk krumningsgraf for bovint serumalbumin med opløsningsstyrken i området fra 0,3 til 3,8 mg/ml. .e undersøgelseskombination blev organiseret med 250 µl homogenat, 5,1 ml Lowry's reagens, Na+-K+ [PO4]2--buffer (900 µl) og 1,1 N 500 µl FCR. .e uoverensstemmelse i OD blev observeret ved λmax � 650 nm [36].

2.13. Hjernesektioner Histopatologi. Ved hjælp af en tyngdekraftfodret diffusionsopsætning blev rotter intrakardialt (via venstre ventrikel) diffuseret med 10% neutral bufret formaldehyd (10% NBF) opløsning og bedøvet akut. Hippocampus og corticalsektorerne nedsænkes i et fikseringsmiddel (10:1 fiksativ: vævsproportion), nemlig 10% NBF i en uge (4 grader), ledsaget af 0,04% natriumazid (pH 7,4).

Ethylalkohol (70%) blev anvendt som en pakningsopløsning til faste vævsdele holdt ved 4 grader. En mikrotomskærer (rotationstype) blev anvendt til at erhverve tynde portioner (8,0 μm), som derefter blev tonet med farvestof hæmatoxylin og eosin (H&E). .slides blev gjort permanente ved hjælp af DPX-harpiks, som senere blev dækglasset og inspiceret gennem et optisk mikroskop (kikkert) ved x40 forstørrelser.

2.14. Statistisk Analyse. En dygtig forsøgsleder blindede forskellige lægemiddelregimer givet til dyrekohorter undersøgte og evaluerede dataene. Outliers var ikke pragmatiske (Grubbs test) i dataene, og Kolmogorov-Smirnov-testen og Levenes test bekræftede henholdsvis normalfordelingen af ​​variable og varianshomogenitet (HOV p > 0.05, Levenes test).

Ellers i tilfælde af ulige varians (HOV p < {{0}}.05, Levenes test), Welchs ANOVA (p < 0.05, F′-statistik) og Games-Howell post hoc-tests kan anvendes. .e middelværdier af normalfordelte variable blev undersøgt og relateret ved envejs- eller gentagne målinger af to-vejs variansanalyse (ANOVA). I tilfælde af ANOVA er resultaterne signifikante (p < 0,05) i F-statistik, flere sammenligningstest, nemlig Tukey's HSD (ærlig signifikant forskel) eller Bonferroni, blev anvendt. Statistisk signifikans blev vurderet til p < 0,05, og resultaterne blev angivet som middel-± standardfejl af middelværdi (SEM).

3. Resultater

3.1. Resultater af DSM på kropsmasse (g), diæt og vandindtagelse af rotter administreret QA-ICV. Kropsvægt, foder og vandindtagelse blev analyseret ugentligt, startende fra dag 1. En signifikant reduktion (p < 0.001) i kropsmasse (g), foder- og vandindtag på dag 7, 14 og 21 var pragmatisk hos rotter, der blev udsat for QA-ICV-injektion på dag 1, sammenlignet med tosham-modparter (Figur 2).

DSM (100 mg/kg)-dosering forårsagede en signifikant stigning i kropsvægten (dag 7p < 0.05, dag 14 p < {{14} }.01, dag 21 p < {{20}}.001), foder (dag 7p < 0,05, dag 14 p < 0,01, dag 21 p < 0,001) og vandindtag (dag 7 p < 0,01, dag 14 p < 0,05) hos rotter mod QA-ICV.

DSM (50 mg/kg) svækkede også signifikant QA-ICV-udløst fald i kropsvægten (dag 21 p < 0.05) og foderindtagelse (dag 7 p < 0.{{20}}1) af rotter i forhold til rotter, der har alene QA-ICV-injektioner. QA-ICV- og DNP-behandlede rotter afslørede en signifikant eskalering i kropsmasse (g) (dag 7p < 0.05, dag 14 p < 0.001, dag 21 p. < 0,001), foder (dag 7p < 0,001, dag 14 p < 0,01, dag 21 p < 0,001) og vandindtag (dag 7, 14, 21 p < 0,01) i forhold til rotter, der forblev udsat for ensom QA-ICV.

3.2. Effekt af DSM på bevægelse, motorisk koordination og rotters gang mod QA-ICV. I denne undersøgelse blev dyrs lokomotoriske aktiviteter ikke påvirket af QA-ICV eller lægemiddelbehandlinger.

QA-gruppen viste ingen signifikant ændring i tematal pr. 5 minutter i aktofometerapparatet i sammenligning med den falske gruppe (figur 3(a)). Rotarod og fodaftryksanalyse blev brugt til at evaluere den sensoriske motoriske ydeevne og gang hos rotter.

Resultaterne viste, at QA-ICV signifikant hæmmede (p < {1}}.001) motorisk koordination (Figur 3(b)) og gang (Figur 3(c)) hos rotter, afspejlet af faldende latens til at falde fra den roterende aksel og skridtlængden af ​​rotter i fodaftryksanalyse i sammenligning med tosham-modstykker.

QA + DSM50 og QA + DSM100-gruppen viste en bemærkelsesværdig stigning i den faldende latenstid (p < 0.05, p < 0.01) og skridtlængde (p < 0,05, p < 0,001) i forhold til QA-gruppen.

DNP-behandling svækkede QA-ICV signifikant og udløste et fald i latens til at falde (p < 0.001) og skridtlængde (p < 0,001) sammenlignet med rotter, der blev givet QA-ICV alene. Ydermere viste DSM (100 mg/kg) behandling en signifikant forbedring (p < 0,01) ingenit i forhold til DSM (50 mg/kg) hos rotter udsat for QA-ICV.

For more information:1950477648nn@gmail.com