Forudsigelse af mekanisme og verifikation af Cistanche Deserticola til behandling af inflammatorisk tarmsygdom ⅰ
Nov 15, 2024
ABSTRAKT
OBJEKTIVAt undersøge mekanismen forCistanche Deserticola i behandlingen af inflammatorisk tarmsygdom(IBD).
MetoderDen aktiveKomponenter i C. Deserticolablev screenet baseret på TCMSP og litteraturrapporter. Målene for aktive ingredienser blev opnået via schweizisk målforudsigelsesplatform. Derefter blev sygdomsmålene opnået ved at søge gencards og OMIM -databaser. PPI Network og "Drug-Compound-Disease-Target" -netværk blev konstrueret. Kernekomponenterne og kernemålene blev screenet. GO og KEGG -berigelsesanalyser blev udført, og molekylær docking -verifikation blev udført for kernemål og kernekomponenter. IBD -musemodellen blev etableret og opdelt i modelgruppen, positiv kontrolgruppe (dexamethason, 0. 4 mg/kg) ogC. Deserticolaekstrakt gruppe (1 0 0, 2 0 0, 4 0 0 mg/kg); Blank kontrolgruppe blev sat med 8 mus i hver gruppe. Hver gruppe fik relevant medicin, en gang om dagen, i 7 på hinanden følgende dage. Sygdomsaktivitetsindeks (DAI) score og tyktarmslængde blev beregnet, og den patologiske morfologi af musen af mus blev observeret. Niveauerne af inflammatoriske faktorer [interleukin -6 (IL -6), IL1, IL -10, myeloperoxidase (MPO) blev tumor nekrose faktor- (TNF-)] i kolonvæv og proteinudtryk af kerneproger påvist. Resultater I alt 39 aktive ingredienser og 232 potentielle mål for C. Deserticola i behandlingen af IBD blev opnået. Behandlingen af IBD med C. Deserticola kan være relateret til kernekomponenter, såsom quercetin, Suchilacton, -sitosterol og cistanosid H, og kernemål som TNF, Akt1, STAT3, EGFR og SRC. GO og KEGG -pathway -analyse forudsagde, at de biologiske processer af C. Deserticola i behandlingen af IBD hovedsageligt var relateret til proteinphosphorylering og negativ regulering af apoptose, hovedsageligt involverede PI3K/AKT og EGFR tyrosinkinaseinhibitorresistenssignalering. Resultaterne af molekylær docking viste, at den bindende energi mellem kernekomponenterne og det kernemål for C. Deserticola var mindre end －4,7 kJ/mol. Resultater af dyreeksperiment viste, at efter intervention med C. ørkenericola -ekstrakt steg kropsvægten og tyktarmslængden af mus signifikant (p ＜ 0. 0 5 eller p ＜ 0. 01), mens DAI faldt markant (p ＜ 0,05 eller p ＜ 0,01). Overbelastning og ødemer i kolon slimhinden blev signifikant reduceret, og den patologiske score af kolonvæv blev signifikant reduceret (P ＜ 0,05 eller P ＜ 0,01); niveauerne af IL -6, IL -1, MPO og TNF-, såvel som proteinudtrykket af PI3K, phosphoryleret PI3K (P-PI3K), EGFR, TNF-, STAT3, phosphoryleret STAT3 (P-STAT3), AKT1, PHOSPHORYLATED AKT1 (P-AKT1) og SRC i kolonvæv blev reduceret markant (P ＜ 0,05 eller P ＜ 0,01), mens niveauet af IL -10 blev signifikant forøget i modelgruppen (P ＜ 0,01). Konklusioner C. Deserticola kan lindre IBD ved at regulere SRC/EGFR/PI3K/AKT -signalvejen.
Nøgleord Cistanche Deserticola; Inflammatorisk tarmsygdom; netværk farmakologi; molekylær docking; Eksperimentel verifikation
Ny urtcistanche oralt supplement til forstoppelse
Støttende service af Wecistanche-den største cistanche-eksportør i Kina:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tlf: +86 15292862950
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en generel betegnelse for kronisk, ikke -specifikke, inflammatoriske sygdomme i mave -tarmkanalen, herunder to undertyper: Crohns sygdom og ulcerøs colitis [1]. IBD er en af de almindelige og vanskelige sygdomme i fordøjelsessystemet i mit land og er også fokus, hot spot og vanskeligheder ved grundlæggende forskning og klinisk diagnose og behandling af fordøjelsessystemer. I de sidste 20 år er forekomsten af IBD i mit land steget år for år og forventes at nå 150, 000 i 2025, rangering først i Asien [2].
Det antages generelt, at genetisk modtagelighed, miljøfaktorer, immundysfunktion, ændringer i tarmflora og nedsat tarmslimhindebarrierefunktion er de vigtigste årsager til forekomsten og udviklingen af IBD [3]. Den kliniske behandling af IBD er hovedsageligt baseret på lægemiddelterapi, hovedsageligt inklusive aminosalicylsyre, antibiotika, kortikosteroider og immunsuppressiva [4]. Ovenstående lægemidler er imidlertid tilbøjelige til at forårsage flere bivirkninger, og patienter vil udvikle tolerance efter langvarig brug og er tilbøjelige til tilbagefald efter at have stoppet lægemidlet [5].
Som en traditionel overlegen ressource i mit land har kinesisk medicin fordelene ved klar effektivitet, lav tilbagefaldshastighed og få bivirkninger i behandlingen af kroniske sygdomme. Cistanche Deserticola, også kendt som "ørkenens ginseng", stammer fra de tørrede kødfulde stængler med skællende blade af Cistanche Deserticola Yc Ma eller Cistanche Tubulosa
(Schenk) Wight, en plante fra Orobanchaceae -familien. Det er en unik og fordelagtig medicinsk ressource i Xinjiang. Den indeholder hovedsageligt aktive ingredienser, såsom phenylethanoid glycosider og terpener. Det har virkningerne af at tonere nyren og styrke Yang, fugte tarmen og lindre forstoppelse og er vidt brugt til behandling af tarmsygdomme [6-7]. Phenylethanoid glycosider er indikatorkomponenterne til identifikation og indholdsbestemmelse af Cistanche Deserticola som specificeret i 2020 -udgaven af den kinesiske farmakopé (del I)
Cistanche til inflammatorisk tarm
(hovedsageligt echinacosid og verbascosid) [8]. Undersøgelser har vist, at echinacosid kan forbedre colitis hos mus ved at fremme tarmepitelcelleproliferation og hæmme celle -apoptose [9]; verbascosid kan bremse progressionen af colitis hos rotter som en fri radikal scavenger [10]; De samlede glycosider af Cistanche Deserticola kan forhindre og behandle IBD ved at hæmme ekspressionen af inflammatoriske faktorer [11]. Der er dog ingen undersøgelser på, hvilke kemiske komponenter i Cistanche Deserticola spiller en terapeutisk rolle i IBD, gennem hvilken mål og signalveje.
Med henblik herpå har denne undersøgelse til hensigt at forudsige den potentielle virkningsmekanisme for Cistanche Deserticola til behandling af IBD gennem netværksfarmakologi kombineret med molekylær docking -teknologi og til at verificere de forudsagte resultater ved farmakodynamik for systematisk at afklare molekylær mekanisme af cistanche ørkener i behandlingen af IBD, således at give et teoretisk grundlag for dens undervisning og aktivitet.
1 materialer
1.1 Eksperimentelle dyr
Dyrene, der blev anvendt i denne undersøgelse, var mandlige SPF-kvalitet C57BL/6 mus, i alt 48, købt fra Animal Experiment Center på Xinjiang Medical University, der vejer 18-20 g, med et eksperimentelt dyreproduktionslicensantallet af SCXK (nyt) 2023-0004 og et eksperimentel dyreforbrugslicensnummer til SyXk (nyt) {2023-0001. Musene blev holdt i et miljø med en temperatur på (22 ± 2) grad, en relativ fugtighed på 50%-70%og en 12- H -cyklusbelysning. Denne undersøgelse overholder strengt dyrevelfærd og etiske krav i det eksperimentelle dyreetiske udvalg ved Xinjiang Medical University (godkendelsesnummer 20210301-177).
1.2 Hovedlægemidler og reagenser
Cistanche -ekstrakt (CE; renhed større end eller lig med 85%, echinacosid større end eller lig med 40%, verbascosid større end eller lig med 16%; batchnummer 20230103) blev købt fra Xinjiang HetianDichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd.;
Wecistanche hovedkvarter Hetian Dicheng Cistanche Base
Wecistanche hovedkvarter Hetian Dicheng Cistanche Base
Wecistanche Hovedkvarter Hetian Dicheng Cistanche Extract
Støttende service af Wecistanche
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tlf: +86 15292862950
Dextran sulfatnatrium (DSS, relativ molekylvægt 36, 000-50, 000, batchnummer C16013701) blev købt fra Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; Fækalt okkult blodkvalitativ detektionssæt (batchnummer ML1095013) blev købt fra Shanghai Elisa Biotechnology Co., Ltd.; Dexamethason -referencestof (renhed større end eller lig med 98%, batchnummer 54231207002) blev købt fra Beijing Solebaugh Technology Co., Ltd.; tumor necrosis factor- (TNF- ), interleukin 6 (interleukin-6, IL-6), IL-10, IL-1 , myeloperoxidase (MPO) enzyme-linked immunosorbent assay kits (batch numbers 88-7324, 88-7064, 88-7105, 88-7013, Emmpo) blev købt fra Invitrogen, USA; Kanin TNF-, proteinkinase B1 (AKT1), phosphoryleret Akt1 (P-Akt1), signaltransduktion og aktivator af transkription 3 (STAT3), phosphoryleret STAT3 (P-STAT3), epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), ikke-receptor tyrosinkinase (SRC), phosphohoidid 3 kinase (phosphoinositid 3- kinase (PI3K), phosphoryleret PI3K (P-PI3K) og peberrodsperoxidase-mærket ged anti-kanin immunoglobulin G sekundære antistoffer (LOT-numre GB1188, GB11689, GB150002, GB111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111117 GB150001, GB115662, GB112343, GB112544, henholdsvis GB11525 og GB23303) blev købt fra Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LTD.
1.3 Hovedinstrumenter
De vigtigste instrumenter, der blev anvendt i denne undersøgelse, inkluderer Multiskan Go fuld bølgelængde mikropladelæser (Thermo Fisher Scientific, USA), RM2016 Pathology Slicer (Leica Instruments, Shanghai), Gel.Doc.xr Gel Electrophoresis Imaging Analysis System og Mini Trans-Blot Protein Blotting Instrument (Bio-Rad, USA).
2 metoder
2.1 Netværk Farmakologianalyse
2.1.1 Forudsigelse af aktive ingredienser og mål
The active ingredients of Cistanche deserticola were screened using the TCMSP platform (http://lsp.nwu.edu.cn/) (with oral availability ≥30% and drug-like properties ≥0.18 as screening conditions) [12], and the active ingredients of Cistanche deserticola with anti-IBD effects reported in the literature were supplemented. The Swiss Target Prediction platform was used to search for the active ingredient targets of Cistanche deserticola (probability parameter>0), og efter fjernelse af duplikater blev de aktive ingrediensmål af Cistanche Deserticola opnået. Ved anvendelse af "inflammatorisk tarmsygdom" som søgeudtryk blev sygdomsmål indsamlet fra GeneCards -databasen (http://www.genecards.org/) og OMIM -databasen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM), og potentielle mål blev opnået efter deletering af duplikater.
2.1.2 Venn Diagram-tegning og "Drug-ingredient-target-sygdom" Interaktiv netværkskonstruktion
Venny 2.1 online -analyseværktøjet blev brugt til at krydse de aktive ingrediensmål af Cistanche Deserticola med potentielle mål for at opnå de potentielle mål for Cistanche Deserticola til behandling af IBD. Cytoscape 3.9.1-software blev brugt til at konstruere et netværksdiagram på flere niveauer af "lægemiddel-ingredient-sygdom-mål" og udføre topologisk analyse. De øverste 4 komponenter med den højeste gradværdi blev valgt som kernekomponenterne i Cistanche Deserticola til behandling af IBD.
2.1.3 Protein-proteininteraktionsnetværkstegning
The potential targets of Cistanche deserticola for the treatment of IBD were imported into the STRING database (http://string-db.org/), the species was limited to "Homo sapiens", the interaction score was limited to >0. 4, protein-proteininteraktionen (PPI) -netværket blev trukket, og graden af hvert mål blev beregnet. Målene med de øverste 5 graders værdier blev taget som kernemål.
2.1.4 Funktion og vejberigelse analyse af potentielle mål
The potential targets of Cistanche deserticola for the treatment of IBD were imported into the DAVID database (https://david.ncifcrf.gov) for gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis, and visualized using the Micro-Science Information Online Platform (https://www.bioinformatics.com.cn/). Berigelsesgraden blev målt ved antallet af mål og -lgp -værdi af de tilsvarende veje beriget; De top 10 poster i GO -analyse blev valgt til at tegne en søjlediagram, og de top 20 veje i KEGG -analysen blev valgt til at tegne en boble -graf.
2.1.5 Molekylær docking
Autodock VINA -software blev anvendt til at udføre molekylær docking -verifikation på de screenede kernemål (TNF, AKT1, STAT3, EGFR og SRC) og kernekomponenter (Quercetin, Sucinolone, -sitosterol og Cistancheside H). Jo lavere bindingsfri energi er, jo højere er affiniteten af kernekomponenten til binding til receptorproteinet [13].
2.2 Verifikation af dyreforsøg
2.2.1 Modellering, gruppering og lægemiddeladministration
48 male C57BL/6 mice (6-7 weeks old) were divided into blank control group, model group, positive control group (dexamethasone, 0.4 mg/kg, the dose was calculated according to the clinical equivalent dose) and CE low, medium and high dose groups (100, 200, 400 mg/kg, the dose was set I henhold til reference [14]) i henhold til kropsvægt efter 1 uges adaptiv fodring med 8 mus i hver gruppe. Musene i den tomme kontrolgruppe spiste og drak vand normalt hver dag, mens musene i Model Group og Drug Administration Group drak 3% DSS -opløsning frit hver dag til modellering og spiste frit. På samme tid som modellering blev musene i hver CE -dosisgruppe forsynet med den tilsvarende dosis af CE (opløst i destilleret vand før brug), musene i den positive kontrolgruppe blev intraperitonealt injiceret med dexamethason og musene i den tomme kontrolgruppe og modelgruppe gavaged med sterilt vand ved 0,01 ml/g hver dag, og en dag, for 7 puteive. Under eksperimentet døde en mus i hver af modelgruppen, positiv kontrolgruppe og CE lav dosisgruppe. Efter den sidste administration blev musene fastet i 12 timer. Efter anæstesi blev øjenkuglerne fjernet for at opsamle blod og kolonvæv til senere brug.
2.2.2 Beregning af sygdomsaktivitetsindeks og påvisning af tyktarmslængde
Under eksperimentet blev musens vægt og fæces registreret hver dag. Vægttab, fækale egenskaber og blod i afføringen af hver gruppe af mus blev evalueret i henhold til scoringskriterierne [15], og sygdomsaktivitetsindekset (DAI) blev beregnet. DAI=(vægttabsscore + fækal karakteristika score + fækalt okkult blod eller kolon blødning score) / 3. efter eksperimentet blev længden af musekolonen målt og fotograferet.
2.2.3 Observation af kolonvævspatologi
En del af musens kolonvæv blev fikseret med 4% polyformaldehyd, indlejret i paraffin, snittet og farvet med hæmatoxylin-eosin (HE). Den patologiske morfologi af musens kolonvæv blev observeret under et mikroskop, og den patologiske score blev beregnet i henhold til graden af kryptcelletab og inflammatorisk celleinfiltration [16].
2.2.4 Påvisning af inflammatoriske faktorniveauer i kolonvæv
En del af musvævet hos mus blev homogeniseret på is, og homogenatet blev centrifugeret ved 3 500 r/min i 15 minutter ved 4 grader. Supernatanten blev opsamlet, og niveauerne af IL -10, IL -6, IL -1, TNF- og MPO i serum blev detekteret af mikropladerlæser i henhold til instruktionerne fra kittet.
2.2.5 Påvisning af kernemålproteinekspression i kolonvæv
En passende mængde kolonvæv på 3 mus blev taget fra hver gruppe. Proteinekspressionen af de screenede kerneemål baseret på netværksfarmakologi blev verificeret af Western blot. Den grå værdi af proteinbånd blev analyseret ved Image J -software. -Actin blev anvendt som en intern henvisning til beregning af ekspressionsniveauet for hvert protein.
2.3 Statistiske metoder
SPSS 22. 0 Software blev anvendt til statistisk analyse af dataene. De kvantitative data blev udtrykt som x ± S, og sammenligningen mellem flere grupper blev udført ved envejs variansanalyse, og sammenligningen mellem to grupper blev udført ved LSD-T-test. Testniveauet =0. 05.
