Mange undersøgelser har bekræftet, at allergiske sygdomme ikke kun er resultatet af medfødt immunaktivering 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

3. Diskussion

Patogenesen af ​​atopisk dermatitis (AD) er ikke fuldt ud forstået, men sygdommen er medieret af et unormalt immunglobulin E (IgE) immunrespons i hudbarrieredysfunktion. Blandt dem kan mastceller (MC) forårsage IgE-medierede allergiske sygdomme, herunder AD. Når mastceller aktiveres, frigiver de deres membranbundne cytoplasmatiske partikler, hvilket fører til frigivelsen af ​​en række forskellige molekyler. Disse molekyler spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​AD og værtsforsvar [27]. Fordi inhibering af mastcelleaktivering eller degranulering hjælper med at regulere forskellige IgE-medierede overfølsomhedsreaktioner, er mastceller et af de ideelle mål til at udforske anti-allergiske lægemidler. I vores undersøgelse degranuleres mastceller som reaktion på forbindelse 48/80 og calciumionophoren A23187 og anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Vi fandt, at reference effektivt hæmmede mastcellers degranuleringseffekt, hvilket viste dens anti-allergiske reaktion. Desuden blev stigningen i intracellulært calcium og aktivering af MAPK hæmmet ved reference. Desuden blev hudmastcelleinfiltrationen forårsaget af DNCB og kradseadfærden forårsaget af forbindelse 48/80 også reduceret. Derfor har mekanismen for neferins anti-atopisk dermatitis en multiplikatoreffekt på keratinocytter og mastceller.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, men la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogenese de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan og respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, den aumento de calcio intracellulær og aktiveringen af ​​MAPK fueron inhibidos por reference. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. På samme måde, som en mekanisme for dermatitis antiatópica de la neferina, er en effekt af multiplikatoren, der er queratinocitos og mastocitos.

Klik venligst her for at vide mere

Cytoplasmaet af mastceller, der findes i væv, er fyldt med store, tætte partikler af foruddannede inflammatoriske mediatorer[28]. Processen med at frigive disse mediatorer fra de sekretoriske granula i mastceller kaldes degranulering. Da inhibering af mastcelledegranulering kan regulere forskellige IgE-medierede overfølsomhedsreaktioner, er mastceller et af de ideelle mål til at udforske anti-allergiske lægemidler [29,30]. Vores resultater viser, at reference har en meget god effekt på degranuleringen af ​​mastceller uanset brugen af ​​antigen, receptorstimulator eller ionophor. Dette viser, at reference er et potentielt anti-allergimiddel (figur 2).

Alle forudlagrede granulater, nysyntetiserede mediatorer og endda granulat og deres komponenter kan bruges som MC-aktiveringsindikatorer [31]. Derudover er standardmetoden måling af intracellulær Ca4t-koncentration. De fleste af MC-sekretagogerne (f.eks. antigen, forbindelse 48/80), som generelt er blevet brugt i laboratoriet, forårsagede en stigning i den intracellulære Ca2 plus-koncentration. Faktisk kan stigningen i intracellulær Ca2 plus koncentration også udløse MC-degranulering. Normalt induceres stigningen i intracellulær Ca4t ved at aktivere MC med forbindelser, såsom thapsigargin (blokerer specifikt Sarco/endoplasmatisk Ca2 plus ATPase, SERCA) pumper og ionoforer (dvs. ionomycin og A23187) [32,33]. Derfor, i den Ca2t-afhængige MC-aktivering, betragtes måling af Ca2t-tilstrømning også som en metode til at bestemme MC-aktiveringsbetingelser. I MC-forskning er Fura-2 meget brugt til bestemmelse af intracellulær Ca2 plus ændringer. I vores eksperimenter fandt vi, at fluorescensintensiteten af ​​aktiverede mastceller var signifikant undertrykt efter at være blevet behandlet med reference (figur 3). Tidligere rapporter indikerede, at stigningen i intracellulær Ca4t-koncentration var i overensstemmelse med frigivelsen af ​​histamin [34]. Derfor udleder vi, at frigivelsen af ​​histamin også vil blive hæmmet af referencebehandlingen. Yderligere eksperimenter er berettigede for at bekræfte denne hypotese.

Mastceller har væsentligt forskellige funktionelle output.cistanche dosering redditDisse omfatter degranulering, dannelse af arachidonsyreprækursorer, kemotaksi og cytokinproduktion og er alle afhængige af calciumsignalerne til en vis grad, uanset stimulanser [32]Aktiveret MC frigiver cytokiner, som er de vigtigste mediatorer af allergier og inflammatoriske sygdomme [32] 35]. Produktionen af ​​cytokiner af aktiverede mastceller er resultatet af induktionen af ​​cytokin-gentransskription i disse celler. Stimuleringen af ​​mastceller fører til aktivering af NF-kB og AP-1 og produktionen af ​​mange cytokiner [36]. MAPK-kaskadesignalveje spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​cytokiner. Aktiveringen af ​​disse veje gennem PKC's aktivering af PI resulterer i aktivering af forskellige gener, herunder inflammatoriske cytokingener såsom IL-1, IL-6 og TNF [37]. Vores seneste undersøgelser har vist, at reference kan hæmme de cytokiner, der frigives ved aktivering af keratinocytter. Samtidig fandt vi også ud af, at pathway-aktiveringen af ​​MAPK også vil blive hæmmet af referencebehandlingen [18]. I vores nuværende undersøgelse viste vi, at reference også kan reducere ekspressionen af ​​cytokiner gennem inhibering af MAPK-aktivering i mastceller (figur 4 og 5). Aktiveringen af ​​NFkB reduceres også på grund af hæmningen af ​​MAPK-aktivering (figur 6).

Cistanche kan anti-aging

En række undersøgelser har rapporteret, at en række cytokiner hos AD-patienter er forhøjede, hvilket fører til hudbarrieredysfunktion, herunder cytokiner udskilt af keratinocytter og Th2-afledte cytokiner [38,39]. Derudover er det rapporteret, at disse udskilte cytokiner også kan nedregulere ekspressionerne af tight junction (T]) proteiner og terminale differentieringsgener, herunder filaggrin (FLG), loricrin (LOR) og involucrin (IVL) [39,40 ](Pro)filaggrinekspression er nedsat i AD og er omvendt forbundet med MC tryptase og IL-6[41]. IL-1 medierer kronisk inflammation hos mus med en svækket hudbarriere [35]. I en tidligere undersøgelse blev det rapporteret, at udtrykkene af FLG, IVL og LOR blev nedreguleret efter påføring af DNCB på NC/Nga-musens dorsale hud[42,43]. I den foreliggende undersøgelse var udtryk for FLG, IVL og LOR betydeligt reduceret i den dorsale hud i kontrolgruppen, hvilket indikerede, at den epidermale barriere var svækket. Administrationen af ​​reference genvandt signifikant reducerede udtryk af FLG, IVL og LOR efter behandling af DNCB, mens referenceadministration øgede udtryk for IVL og LOR lidt sammenlignet med kontrolgruppen (figur 8). Det er kendt, at forbindelse 48/80 er en effektiv aktivator af hudmastceller. Hudresponsen stimuleret af forbindelse 48/80 kan inducere kradseadfærd ved at frigive histamin fra mastceller [44]. Histamin frigivet fra aktiverede mastceller spiller en vigtig rolle i stigningen i vaskulær permeabilitet forårsaget af forbindelse 48/80. Under menneskelig kløe overvejes også histamin frigivet fra mastceller gennem forskellige stimuli. vist sig at være en vigtig mægler. Derfor er inhibering af degranuleringen af ​​mastceller et vigtigt trin i regulering af histaminfrigivelse under ridseadfærd. I denne undersøgelsesforbindelse forårsagede 48/80 effektiv aktivering af hudmastceller. Imidlertid reducerede forbehandling med reference markant degranuleringsniveauet af mastceller (figur 2).cistanche ekstrakt fordeleDisse resultater indikerer, at referencens anti-ridseadfærdseffekt kan skyldes reduktionen i vaskulær permeabilitet ved at regulere mastcelledegranulering (figur 9).

Det er generelt fastslået, at AD-patienter lider af hudbarrieredysfunktion, hudbetændelse eller begge dele, så det er svært at finde en passende behandlingsmetoder. Derfor anbefales kombinationsbehandling normalt. Vores seneste forskning har vist, at aldrig har immunmodulerende funktion og barriere reparationsevne. Derfor er et vigtigt referencetræk ved AD-behandling i fremtiden vedligeholdelsen af ​​hudens funktion og forbedring af hudens hydrering og barrierereparation. Reference kan også reducere ridseadfærd induceret af allergener og irritanter. Desuden er den atopiske march en fænomenrelateret sygdom, der opstår og udvikler sig trin for trin. Atopisk dermatitis ses ofte i barndommen. Fødevareallergi opstår ofte efter 1-2års alderen. Allergisk rhinitis kan ofte starte før og efter skole. Astmasymptomer opstår på forskellige tidspunkter, men de fleste af dem er efter allergisk rhinitis. Efter barndommen kan atopisk dermatitis og visse fødevareallergier forbedres eller forsvinde. Allergisk rhinitis og astma er ikke lette at helbrede[45,46]. Derfor er de komorbide fænomener i sygdomme. Naturlige produkter inklusive referencer har det terapeutiske potentiale af komorbiditet, og deres effektivitet i relaterede sygdomme er værd at studere i fremtiden.

4. Materialer og metoder

4.1. Basofile rotte-leukæmiceller

Rottebasofile leukæmiceller (RBL-2H3) var en gave fra TLHwang, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan. RBL-2H3-celler er mucosale mastceller, der bruges til at studere antigen- eller calciumionophor-induceret degranulering, intracellulær Ca4t og signaltransduktion [29]. Cellerne blev dyrket i EMEM indeholdende 10 procent FBS, med penicillin og streptomycin ved 37 grader, 5 procent CO2. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) og føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2.MTT-assay

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT)-assay bruges til at måle den metaboliske aktivitet af celler. RBL-2H3-celler blev podet i en 24-brøndkulturplade ved 5 × 10 plus/brønd. Efter 24 timers lægemiddelbehandling blev 30 μL MTI pr. brønd tilsat og anbragt ved en 37 graders celleinkubator i 2-4 timer, derefter blev lilla formazankrystaller opløst med DMSO. En ELISA-læser blev brugt til at måle absorbansintensiteten ved en bølgelængde på 550 nm som en cellelevedygtighedstest.

4.3. Måling af intracellulært Ca2 plus niveau

[Ca2t] Jeg blev målt med fura-2 som beskrevet tidligere[47].RBL-2H3-celler blev resuspenderet i IMDM indeholdende 5 uM Fura 2-AM og 1,2 mM CaClz ved 37 grader for 30 min. Efter Fura{11}}-ladning blev keratinocytter pelleteret og resuspenderet i frisk DMEM. En alikvot (2 ml) blev overført til en omrørt kuvette indeholdende 1,2 mM CaClz.Fura-2-Ca-fluorescens blev analyseret ved excitationsbølgelængderne på 340 og 380 nm (emissionsbølgelængde, 505 nm) i en Perkin{19 LS{19 LS }} spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Data blev registreret med 5s intervaller[47].

4.4. Kvantitativ polymerkædereaktion (qPCR)

RBL{{0}}H3-celler blev plantet i en 3,5 cm kulturskål. Efter at cellerne voksede til 90 procent fulde, blev cellerne dyrket i statisk tilstand i 24 timer. Efter at cellerne var blevet forbehandlet med reference i 20 minutter, blev de stimuleret med TNF-a/IFN-y i henholdsvis 1 eller 24 timer. Cellerne blev skrabet af, centrifugeret (16,000×g,10 min,4 grader), og supernatanten blev ekstraheret. RNA blev oprenset under anvendelse af et totalt RNA-isoleringskit (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). I henhold til driftsproceduren for script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD) blev reagenser tilsat i rækkefølge og drevet i henhold til de angivne betingelser for at konvertere RNA til cDNA. Ydermere blev PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) anvendt. I alt 7,5 µl ddH20, 2 µl cDNA, 0,25 µL af fremadgående og reverse primere og 10 µl SYBR GREEN blev tilsat og blandet ensartet. Primersekvenserne er vist i tabel 1 og 2. Derefter blev RNA kvantificeret ved hjælp af ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System.

4.5. Western Blot Assay

Western blotting bruges til at analysere ændringerne af forskellige proteiner i celler. RBL{{0}}H3-celler blev podet i en 3,5 cm kulturskål. Efter at cellerne voksede til 90 procent fulde og var udsultet i 24 timer, blev de forbehandlet med reference i 20 minutter og derefter stimuleret med TNF-a eller IFN-y i henholdsvis 30 minutter eller 1 time. Efter skrabning blev de pulveriseret ved ultralyd og centrifugeret (13.200 rpm, 10 min, 4 grader). Efter centrifugering blev supernatanten taget, og proteinet blev kvantificeret med et Pierce protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Det blev elektroforeret på 10 procent SDS-polyacrylamidgel og derefter elektroporeret med PVDF-membran. Efter at overførslen var fuldført, blev PVDF-membranen anbragt i TBS-T (Tris-pufret saltvand/0,05 procent tween 20) opløsning indeholdende 5 procent skummetmælkspulver og rystet i 1 time for at undgå uspecifik binding. Derefter blev TBS-T brugt til at vaske 3 gange, 10 minutter hver gang. Derefter blev primære antistoffer (1:1000 fortynding) tilsat og placeret ved 4 grader natten over og blev derefter vasket 3 gange med TBS-T hvert 10. minut. Efter tilsætning af sekundære antistoffer (fortyndet 1:1000) i 1 time blev PVDF-membranen vasket 3 gange med TBS-T i 10 minutter hver gang. Til sidst blev fremkalderen tilsat, og membranen blev anbragt i et kemisk luminescensekstraktionssystem (BIOSTEP Celvin") til optagelse.

4.6.Dinitrochlorbenzen(2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB)Induceret atopisk dermatitis-lignende hudbetændelse hos mus

Først blev musene opdelt i fire grupper: kontrolgruppe, DNCB-gruppe (negativ gruppe), reference (3 mg/kg og 10 mg/kg) med DNCB-gruppe og dexamethason (0,2 mg/kg) med DNCB gruppe (positiv gruppe). Dexamethason er et kortikosteroidhormon, der kan reducere hævelse og allergiske reaktioner. I dette in vivo-eksperiment blev både reference og dexamethason opløst i DMSO, mens DNCB blev opløst i 75 procent ethanol ved ultralydshock. Førstnævnte blev givet ved intraperitoneal injektion, og for sidstnævnte blev der påført 100 µl på baghuden og 20 µl på højre øre. Tre dage før forsøget blev musene bedøvet, og baghåret blev fjernet, og en lille målemagnet (SCT-MAG-TF) blev indlejret på bagsiden af ​​musens bagerste fødder.cistanche genghis khanEfter at have hvilet i tre dage blev det bekræftet, at musene var i god fysisk tilstand, og huden på det dorsale depilationsområde var normal, og forsøget blev startet. Under eksperimentet blev der taget fotografier for at registrere ændringerne i hudens udseende. Den første fase ({{0}} dage) var perioden med allergisk atopisk dermatitis. Efter måling af de grundlæggende værdier for mus i DNCB-gruppen, referencegruppen (3 og 10 mg/kg) og DNCB-eksperimentgruppen og dexamethason 0,2 mg/kg og DNCB-eksperimentgruppen blev 1 procent DNCB jævnt påført på ryghuden og højre øre. På den femte dag blev lægemiddelreferencen og dexamethason injiceret intraperitonealt. Den anden fase (dag 5 til dag 14) var re-induktion af atopisk dermatitis.cistanche levetid forlængelseI de 3 forsøgsgrupper blev0,5 procent DNCB jævnt smurt på ryggens hud og højre øre på musene. Dagen efter blev hudens fysiologiske værdier og billeder taget og registreret. Efter at musene var blevet aflivet med for meget kuldioxid (CO2) på den 15. dag, blev det dorsale hudvæv fjernet til efterfølgende eksperimentel analyse.

4.7. Forbindelse 48/80-Induceret ridseadfærd i BALB/c-mus

Hårene på huden på bagsiden af ​​musen blev klippet, og 20 μL af forbindelse 48/80 opløsning blev injiceret intrakutant. Kontrolmusene fik i stedet saltvandsinjektioner. Umiddelbart efter injektionen blev dyret anbragt i et observationsbur (diameter 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japan), og musens skrabeadfærd blev automatisk og objektivt detekteret og evalueret. Ridseadfærden blev målt i 60 min. MicroAct bruger følgende analyseparametre til at detektere bølger svarende til musenes kontinuerlige skrabeadfærd: tærskelværdi,0,05 V; hændelsesgab, 0,05 s; minimumsvarighed,0,25 s; maksimal frekvens,30 Hz; minimumsfrekvens, 5Hz. 4.8.Statistisk analyse

Sigma-Plot-software (Version 10.0) blev brugt til den statistiske analyse.cistanche nzData er udtrykt som middelværdi ± SEM, med(*) og(#) som noter. Den statistiske signifikans af dataene blev analyseret ved uparrede, to-halede Student t-tests.p værdier mindre end 0.05 og 0,01 blev betragtet som signifikante.

5. Konklusioner

I denne undersøgelse fastslog vi, at reference effektivt hæmmer degranuleringen af ​​mastceller og reducerer ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, som kan reducere atopisk dermatitis-lignende symptomer, genoprette hudbarrieren og reducere hudridsninger. Vi har yderligere bevist, at reference ikke kun kan virke på hudens keratinocytter, men også påvirke aktiveringen af ​​mastceller. Det har mere potentiale for anvendelse ved allergiske og inflammatoriske hudsygdomme.

Denne artikel er uddraget fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms