Makrofagaktivering ved saccharider med lav molekylvægt fra Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

[Abstract]

At undersøge immunaktiveringseffekten og mekanismen for saccharider med lav molekylvægt fraCistanche deserticola(LMSC) om peritoneale makrofager med mus, RAW264. 7 celler. The RAW264. 7 celler blev opdelt i den normale kontrolgruppe, LPS-positiv kontrolgruppe og LMSC-behandlingsgrupper. The RAW264. 7 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af LMSC fra 3. 91 til 62. 5 g· L - 1. Det neutrale røde assay blev anvendt til at detektere makrofagernes fagocytiske aktivitet. INGEN frigivelse blev detekteret ved hjælp af NO kit, og makrofagaktiveringsrelaterede proteinekspressionsniveauer (TNF-α, IL-6, IKKβ, p-IKKβ, IκBα, p-IκBα, NF-κB og p-NF-κB) blev detekteret af Western blot. Resultaterne viste, at LMSC havde en aktiveringseffekt på makrofager; det kan øge frigivelsen af NO betydeligt i RAW264. 7 celler og fremme ekspressionen af cytokiner TNF-α og IL-6. Desuden øgede LMSC signifikant fosforyleringen af IKKβ, IκBα og NF-κB p65. Desuden forbedrede mannitols en af hovedbestanddelene i LMSC signifikant makrofagernes fagocytiske aktivitet. Disse resultater viste, at LMSC kunne aktivere makrofager ved at opregulere NF-κB-signalvejen, og mannitol kan være en af de vigtigste aktive komponenter i LMSC.

[Nøgleord] Saccharider med lav molekylvægt; Cistanche deserticola; immun aktivering; makrofag; inflammatorisk faktor; NF-κB

Cistanche deserticola Y. C. Maer en plante, der tilhører slægtenCistanche deserticolaY. C. Ma. Dens kødfulde stamme kan bruges som medicin. Det har funktionerne til nærende nyre yang, nærende essens og blod og fugtgivende tarmene. Det er kendt som "ørken ginseng". De kemiske komponenter i Cistanche indbefatter phenylethanoidglycosider, iridoidglycosider, sukkerarter, lignaner og mange andre typer. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Cistanche har mange biologiske aktiviteter såsom neurobeskyttelse, antitumor, immunregulering, antiinflammatorisk og antioxidant [1]. Undersøgelser har vist, at afkogningen af Cistanche og polysaccharider kan forbedre makrofagernes fagocytiske evne og sekretionsfunktion betydeligt [2-3]. Der er dog ingen rapport om aktivitetsforskningen af dets lavmolekylære kulhydrater. Derfor anvendte denne undersøgelse in vitro-kultursystemet i RAW264. 7 peritoneale makrofager med mus for at undersøge den immunmodulerende aktivitet og relaterede mekanismer af Cistanche kulhydrater med lav molekylvægt. Denne forskning kan give mere eksperimentelle beviser for en omfattende forståelse afCistanches immunmodulerende virkningi fremtiden for yderligere at vejlede den kliniske anvendelse.

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

1. Materialer

RAW264. 7 celler blev købt fra Cell Center i det kinesiske akademi for medicinsk videnskab; føtalt kvægserum (FBS) blev købt hos PAN Biotech, Tyskland; antibiotika og DMEM-medium blev købt fra Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolysaccharid fra Escherichia coli O55: B5 (LPS) blev købt fra Sigma Company, USA. Et nitrogenoxid (NO) kit blev købt fra Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering. ECL kemiluminescenssæt blev købt hos Thermo Fisher, USA; antistof blev købt fra Cell Signaling Technology, USA; Cistanche cistanche total glycosider, cistanche lavmolekylære sukkerarter og cistanche polysaccharider blev selvfremstillet af vores forskningsgruppe. Massefraktionen af cistanche total glycosider var 78,76%. Massefraktionen af lavmolekylære sukkerarter afCistanche deserticolaer 58. 00% og massefraktionen afCistanche deserticolapolysaccharider er 65. 24%. Tanon-5200Multi gel imaging split system blev købt fra Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Sunrise-Basic mikropladelæser blev købt hos TECAN-firmaet.

2. Fremgangsmåde

2. 1 Neutral rød metode til måling af makrofagernes fagocytiske aktivitet

Tag musens peritoneale makrofager i den logaritmiske vækstfase, efter trypsinisering, tæl cellerne, juster antallet af celler til 5 × 104 celler / ml, og inokuler dem i en 96-brønds cellekulturplade, 100 μL / brønd, ved 37 ° C Dyrket under 5% CO2-betingelser, efter at cellerne klæber til væggen, kasser kultursupernatanten, tilsæt DMEM-medium (10% FBS + 1% P / S), LPS (1 mg· L - 1) og Cistanche cistanche henholdsvis Total glycosider,Cistanchesamlede polysaccharider og Cistanche cistanche sukkerarter med lav molekylvægt (3,91 ~ 62,5 g· L -1, henholdsvis filtreret med en filtermembran før administration) blev dyrket. Efter dyrkning i 48 timer tilsættes 100 μL 0,075% neutral rød fysiologisk saltopløsning til hver brønd, fortsætter med at dyrke i 4 timer, aspireres supernatanten, vaskes 3 gange med PBS, tilsættes cellelysat (iseddikesyre-ethanol 1:1) 100 μL, anbringes ved 4 °C i 2 timer og måles absorbansen (A540 nm), efter at cellerne er lyseret.

2. 2 Påvisning af INGEN frigivelsesmængde i cellesupernatant

Inokuler RAW264. 7 celler i en 48-brønds plade (1 × 105 celler / ml, 500 μL / brønd), aspirere cellekulturmediet efter inkubation natten over, tilsæt DMEM-medium (10% FBS + 1% P / S), 500 μL hver af LPS (1 mg · L-1) og Cistanche cistanche total glycosider, totale polysaccharider og lavmolekylære sukkerarter (3,91 ~ 62,5 g · L -1, henholdsvis). Efter 24 timers induktionskultur blev supernatanten indsamlet. Bestem koncentrationen af NO i cellesupernatanten i hver gruppe med NO-sættet, følg instruktionerne, og registrer til sidst absorbansen (A570 nm) med en mikropladelæser

2. 3. Vestlig blot

Inokuler RAW264. 7 celler i en 6-brønds plade, aspirere cellekulturmediet efter inkubation natten over, tilsæt DMEM-medium (10% FBS + 1% P / S), LPS (1 mg · L - 1), ogCistanchesamlede polysaccharider og lavmolekylære sukkerarter (3,91 ~ 62,5 g· L -1) var hver 2 ml, og supernatanten blev kasseret efter 24 timers induktionskultur. Cellerne blev vasket to gange med PBS og kasseret. Efter trypsinisering pipetterer cellerne ned. Centrifugering, fjern supernatanten, tilsæt 100 μL NP40 Lysis Buffer, og lys på is i 40 min. Efter centrifugering blev supernatanten taget, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-metoden, og proteinkoncentrationen af hver histon blev justeret jævnt. Tag den samme mængde proteinprøver og adskil dem på 12% SDS-PAGE under konstant tryk. Brug derefter Bio-Rad-overførselselektroforesetanken til at overføre membranen med en konstant strøm på 350 mA i 1 time, og overfør proteinet til PVDF-membranen (forbehandling af PVDF-membranen: blød i methanol og ligevægt med overførselsbufferen). Efter blokering med 5% skummetmælk (konfigureret med TBST indeholdende 0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur blev membranen vasket 3 gange med TBST, og membranen blev inkuberet i proteinets primære antistoffortyndingsstof ved 4 ° C natten over. Membranen blev vasket 3 gange med TBST hver anden dag, og det tilsvarende fortyndingsmiddel blev tilsat for at inkubere i 1 time. Membranen blev vasket 3 gange med TBST, og strimlerne blev udviklet med en ECL kemiluminescensudvikler.

2. 4 Analyse af data

Dataene udtrykkes som x ± s, og betydningen af forskellen testes ved hjælp af GraphPad Prism 6 statistisk software til envejsanalyse af varians. Tag P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Resultater

3. 1. Virkninger af Cistanche cistanche sukkerarter med lav molekylvægt, totale glycosider og totale polysaccharider på den fagocytiske aktivitet af RAW264. 7 celler

Forskningen i de kemiske komponenter i Cistanche viser, atCistancheindeholder hovedsageligtphenylethanoid glycosider, iridoid glycosider og kulhydrater. I dette eksperiment vælges de samlede glycosider af cistanche (herunder phenethylalkoholglycosider og iridoidglycosider), lavmolekylære sukkerarter og sukkerarter. De tre aktive steder med totale polysaccharider blev undersøgt for deres virkninger på aktiveringen af RAW264. 7 celler. Både Cistanche cistanche polysaccharid og cistanche sukker med lav molekylvægt kan øge den fagocytiske aktivitet af RAW264 betydeligt. 7 celler, men den fagocytiske aktivitet af den samlede glycosidadministrationsgruppe ændres ikke signifikant. Derudover forbedrede det positive kontrollægemiddel LPS også signifikant den fagocytiske aktivitet af RAW264. 7 celler, som vist i figur 1. Ovenstående resultater tyder på, at de lavmolekylære sukkerarter og polysaccharider i Cistanche kan have den virkning, at RAW264 aktiveres. 7 celler.

3. 2. Virkningen af Cistanche total glycosider, lavmolekylære sukkerarter og totale polysaccharider på indholdet af nitrogenoxid (NO) i cellesupernatant

For yderligere at undersøge aktiveringseffekten af de tre aktive lokaliteter i Cistanche på RAW264. 7 celler, indholdet af NO i cellesupernatanterne stimuleret af forskellige lægemidler blev bestemt. Resultaterne viste, at frigivelsen af NO i LPS-gruppen var signifikant højere end i den tomme kontrolgruppe (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchehavde ingen signifikant effekt. Ovenstående resultater indikerer, at både polysaccharider og lavmolekylære sukkerarter i Cistanche kan fremme frigivelsen af NO fra RAW264. 7 celler. Blandt dem er effekten af lavmolekylære sukkerarter af Cistanche særlig signifikant, som vist i figur 2.

3. 3. Virkningen af Cistanche cistanche lavmolekylært sukker på ekspressionen af TNF-α og IL-6-protein i RAW264. 7 celler

TNF-α er en vigtig inflammatorisk mediator, der vises i aktiveringsprocessen af RAW264. 7 celler, som kan fremme syntesen og frigivelsen af andre cytokiner (såsom IL-6). Resultaterne viste, at ekspressionen af TNF-α og IL-6 blev signifikant forøget, efter at Cistanche cistanches lavmolekylære sukker blev stimuleret, hvilket tyder på, at Cistanches lavmolekylære sukker kan fremme ekspressionen af TNF-α og IL-6 i RAW264. 7 celler, hvorved celleimmunitet Phagocytose aktiveres, se figur 3.

3. 4. Den regulatoriske virkning af Cistanche cistanche sukker med lav molekylvægt på IKKβ /IκBα/NF-κB-signalvejen

For at undersøge den potentielle mekanisme for Cistanche cistanche sukker med lav molekylvægt ved aktivering af RAW264. 7 celler, forfatterne undersøgte dens regulatoriske virkninger på IKKβ / IκBα / NF-κB klassisk signalvej. Cistanche cistanche sukker med lav molekylvægt kan øge fosforyleringen af NF-κB og fosforyleringen af dets opstrøms nøglesignalproteiner IKKβ og IκBα betydeligt og reducere ekspressionen af det samlede IκBα-protein, hvilket indikerer, at det har en aktiverende virkning på IKKβ/IκBα/NF-κB-signalvejen. Det positive kontrollægemiddel LPS har også en lignende regulerende virkning. Sammenfattende kan Cistanches lavmolekylære sukkerarter aktivere IKΒ/IκBα/NF-κB-signalvejen og derved forårsage syntese og frigivelse af cytokiner såsom TNF-α og IL-6 og til sidst forårsage immunaktivering af RAW264. 7 celler, se figur 4.

3. 5. Screening af aktive ingredienser med makrofagaktiverende virkning i Cistanche sukkerarter med lav molekylvægt

Vores laboratorium har analyseret de lavmolekylære sukkerarter, der er indeholdt iCistanchei det tidlige stadium og fandt ud af, at det hovedsageligt indeholder mannitol (16,53%), saccharose (8,34%), fructose (25,38%) og glucose (7, 75%) og andre ingredienser. Så forfatteren brugte den neutrale røde metode til at screene aktiveringseffekten af ovenstående komponenter på makrofager. Mannitol kan signifikant øge makrofagernes fagocytiske aktivitet på en dosisafhængig måde, mens virkningerne af andre komponenter ikke er signifikante. Dette tyder på, at mannitol kan være en af de vigtigste aktive komponenter i de lavmolekylære sukkerarter af Cistanche cistanche for at aktivere makrofager, som vist i figur 5.

4. Drøftelse

Cistanche cistanche, en parasitisk plante af Lydanaceae-familien, er rapporteret at have immunmodulerende virkninger, så den bør indeholde immunmodulerende stoffer. I dette eksperiment screenede forfatteren den fagocytiske aktivitet af musens peritoneale makrofager på forskellige rensede dele afCistancheog fandt ud af, at de lavmolekylære sukkerarter og polysaccharider i Cistanche har effekten af makrofagaktivering, men de samlede glycosider af Cistanche er ikke indlysende. Samtidig fandt forfatteren, at sukkerarter med lav molekylvægt kan aktivere makrofager ved lavere koncentrationer, så forfatterne valgteCistanchesukkerarter med lav molekylvægt som fokus for efterfølgende forskning.

Ved at undersøge effekten af lavmolekylært cistanchesukker på ekspressionen af cytokinerne TNF-α og IL-6 fandt forfatterne, at lavmolekylært cistanchesukker signifikant øgede ekspressionen af TNF-α og IL-6, hvilket yderligere beviste, at lavmolekylært cistanchesukker har en effekt på mus. Peritoneale makrofager har en aktiverende virkning. Så forfatteren undersøgte yderligere sin potentielle virkningsmekanisme. Har forskning

Det er vist, at bakteriel lipopolysaccharid (LPS) kan inducere aktivering af musemakrofager og museglialceller gennem signalveje som JAK2 / STAT3, NF-κB, p38 / ERK og MAPK [4-8]. NF-κB-stien anerkendes som en klassisk vej, så signalproteinerne på denne vej blev testet i dette eksperiment. Resultaterne viste, at Cistanches lavmolekylære sukkerarter kan øge fosforyleringen af NF-κB og fosforyleringen af de vigtigste opstrøms signalproteiner IKKβ og IκBα betydeligt, hvilket tyder på, at de lavmolekylære sukkerarter afCistanchekan aktivere musens peritoneale giganter gennem IKKβ/IκBα/NF-κB-signalvejen. Fagceller frigiver inflammatoriske cytokiner og spiller derefter en rolle i aktivering af cellulær immunitet.

I laboratoriets tidlige fase er den kemiske sammensætning af det lavmolekylære sukkerekstrakt afCistanche deserticolablev systematisk analyseret. Det konstateres, at sukkerarter med lav molekylvægt hovedsageligt indeholder monomerer såsom mannitol, saccharose, fructose og glucose. Yderligere forskning viste, at mannitol kan forbedre makrofagernes fagocytiske aktivitet betydeligt. Derfor spekuleres det i, at mannitol kan være en nøglekomponent i sukkerarter med lav molekylvægt, der aktiverer en cellulær immunfunktion.

Sammenfattende anvendte denne undersøgelse makrofagen i Vitro-kultursystemet og fandt ud af, at de lavmolekylære sukkerarter afCistanchehar en signifikant aktiverende effekt på makrofager og kan aktivere musens peritoneale makrofager gennem NF-κB-signalvejen og derefter spille en rolle. Mannitol i lavmolekylære sukkerarter kan spille en vigtig rolle i aktiveringen af makrofagernes fagocytiske aktivitet.

Referencer

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Dyrkningsteknikker af ørkenen Cistanche og dens vært Tamarix [M]. Beijing: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. En forskningsoversigt over de farmakologiske virkninger afCistanche deserticolapolysaccharid [J]. Mad og stoffer, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Makrofagaktivering af Cistanche Polysaccharid [J]. Kinesisk farmakologisk bulletin, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Den biologiske aktivitet og mekanisme af bakteriel lipopolysaccharid [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS gennem p38 /MAPK-stien og NF-κB-aktivering inducerer ekspressionen af HIF-1α i RAW264. 7 celler [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. JAK2 / STAT3 signalvej er involveret i lipo poly Sukkerinduceret aktivering af microglia [J]. Journal of the Third Military Medical University, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Mulbascum glycosider hæmmer lipopolysaccharid-induceret inflammation af BV-2 microglia og dens mekanisme [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41(13): 2506.