Lipaseproduktion af Yarrowia Lipolytica i faststoffermentering ved hjælp af Amazon-frugtbiprodukter og sojabønnemel som substrat Del 1

Abstrakt: Produktionen af ​​flerumættede fedtsyrer fra fiskeolie, som er relateret til forskellige sundhedsmæssige fordele, herunder effekter mod hjerte-kar-sygdomme, antihypertensive, anticancer-, antioxidant-, antidepression-, anti-aldrings- og anti-gigteffekter, kan blandt andet med fordel udføres gennem påføring af lipase. De høje omkostninger forbundet med enzymproduktion kan dog gøre processen umulig at gennemføre, og derfor bør alternative substrater undersøges for at løse disse problemer. Denne forskning havde til formål at producere lipase af Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 i faststofgæring ved hjælp af biprodukter fra fødevareforarbejdningsindustrien (andiroba-oliekage og sojabønnemel) og verificere den potentielle anvendelse i den indledende hydrolyse af fiskeolie til yderligere at producere flerumættede fedtsyrer i en passende proces. En screening blev udført til analyse af kombinationer af andiroba-oliekage og sojabønnemel i forskellige proportioner (henholdsvis 0:1{{20}}0 til 100:0) efter 48 timer af fermenteringsproces. Bagefter blev den faste matrix bestående af sojamel og andirobaoliekage suppleret med sojaolie og Tween 80 for at forbedre lipaseaktiviteten. Det enzymatiske ekstrakt blev karakteriseret ved proteinprofilen ved elektroforese. Til sidst blev det enzymatiske ekstrakt og den fremstillede faste biokatalysator anvendt til at evaluere den potentielle hydrolyse af fiskeolien i en indledende undersøgelse. Maksimal lipolytisk aktivitet (63,7 U·g -1) blev opnået ved anvendelse af andiroba-oliekage og sojabønnemel (50:50) efter 24 timers fermentering. Sojabønneolie 1,5 procent og Tween 80 (0,001 procent) i en emulsion gav en stigning på 1.5-fold (82.52 U·g-1) i enzymaktiviteten. Den elektroforetiske analyse viste et bånd mellem 37 og 40 kDa, der kan være relateret til lipase, og et bånd på 75 kDa, der henviser til underenheden af ​​-conglycinin, der er til stede i sojabønnemel. Efter 48 timer viste den faste biokatalysator en højere grad af hydrolyse (DH) (71,0 procent) end den enzymatiske ekstrakt (61,5 procent). Den faste biokatalysator var stabil under opbevaring ved stuetemperatur i 7 måneder. Produktionen af ​​lipaser ved hjælp af Amazon-frugtbiprodukter og sojaskrå i fast-state-fermentering er levedygtig, såvel som anvendelsen af ​​ekstraktet og den faste biokatalysator i den indledende anvendelse til hydrolyse af fiskeolie for yderligere at producere flerumættede fedtsyrer i et industrielt passende proces.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på spermmembranfunktionen. Cistanche-polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescerende mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og kan opfange reaktive oxygenarter, forhindre frie radikal-induceret kollagennedbrydning og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin fra frie radikaler.

Klik på Cistanche Tubulosa Supplement

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nøgleord: Carapa guianensis Aublet; produktion af lipase; fermentering i fast tilstand; bæredygtighed; Yarrowia lipolytica

1. Introduktion

Amazonas frugter har et højt bioteknologisk potentiale for forskning og anvendelse i forskellige sektorer af økonomien, såsom medicinal- og fødevareindustrien på grund af tilstedeværelsen af ​​makro- og mikronæringsstoffer, herunder proteiner, kulhydrater, fibre, carotenoider, flerumættede fedtsyrer og vitaminer, blandt andre [1].

Andiroba (Carapa guianensis Aublet) er en Amazonian plante, der producerer oliefrø frugter med kommercielt potentiale for olieudvinding med medicinske egenskaber som en smertestillende, anti-ødematogen og anti-inflammatorisk virkning [2,3]. Derudover præsenterer det interessante teknologiske egenskaber for den kosmetiske industri, fordi det er rigt på blødgørende forbindelser, der leveres som input til kosmetiske industrier over hele verden [4]. Andiroba frugten er en kapsel, der vejer mellem 90 og 540 g og er sammensat af 1 til 16 brune frø, der vejer mellem 1 og 70 g. For at opnå olien brydes frøene i små stykker og tørres i ovne, indtil de når 8 procent fugt. Derefter komprimeres de i presser af metallisk uddrivningstype [5], hvilket producerer andirobaolien, der frembyder stor industriel interesse og høj kommerciel værdi, da dette produkt kan overstige 50 dollars pr. liter, afhængigt af dets egenskaber [6].

Den årlige produktion af andiroba er omkring 122,16 tons [7], og olieproduktionen oversteg ikke 30 procent af frugtens vægt [8]. Disse tal betyder, at der årligt produceres cirka 36.648 tons olie og 85.512 tons kage. Biproduktet opnået efter udforskningen af ​​disse frugter kan stadig indeholde lipider (20 procent), aske (4,2 procent), proteiner (7,3 procent) og kulhydrater (17 procent), og på grund af denne sammensætning, dets anvendelse i bioteknologiske processer er interessant [9]. En måde at anvende disse biprodukter på er gennem faststoffermentering (SSF) for at producere højværditilsatte forbindelser såsom enzymer.

Faststoffermentering udføres ved hjælp af en fast matrix i fravær af frit vand, men det faste stof skal have tilstrækkelig fugt til mikrobiel vækst [10]. Brugen af ​​SSF er blevet rapporteret til at producere aromaforbindelser [11], antibiotika [12], organiske syrer [13], biopesticider [14], biooverfladeaktive midler [15], enzymer [16] og andre forbindelser. Enzymproduktion i SSF kræver brug af mikroorganismer såsom svampe og bakterier, der vokser under forhold, der almindeligvis anvendes i SSF. Blandt de mikroorganismer, der anvendes bioteknologisk, skiller gær sig ud, især Yarrowia lipolytica, på grund af dets potentiale til at producere lipaser [10].

Yarrowia lipolytica er en ikke-konventionel gær, der har en maksimal væksttemperatur på 32-34 ◦C og er ude af stand til at overleve under anaerobe forhold. Y. lipolytica er klassificeret som generelt anerkendt som sikker (GRAS) af Food and Drug Administration (FDA), og dette muliggør sikker anvendelse i fødevare- og farmaceutiske processer/produkter [9]. Denne gær er anerkendt for at producere intracellulære, ekstracellulære og cellevægsassocierede lipaser. Yarrowia lipolytica kan producere lipaser ved hjælp af en række kulstofkilder, herunder olier, methylestere og fedtsyrer [17]. De nævnte egenskaber gør Y. lipolytic alsidig til bioteknologiske anvendelser, især i produktionen af ​​lipaser.

Lipaser (triacylglycerol acylhydrolaser EC 3.1.1.3) er enzymer, der katalyserer hydrolysen af ​​triglycerider til frie fedtsyrer og glycerol i nærværelse af vand [18]. Lipaser kan anvendes i mange sektorer, herunder fødevareindustrien, blandt andre. Brugen af ​​lipaser er blevet rapporteret i hydrolyse af mælk, fedt og ostemodning, i modifikationen af ​​smørfedt, i forbedringen af ​​aromaen af ​​drikkevarer og bagværk, i maddressing og i smagsudviklingen af ​​kød og fisk [19]. Derudover er lipaser allerede blevet anvendt til oliehydrolyse til koncentrationen af ​​flerumættede fedtsyrer, der kan bruges i fødevareindustrien som et beriget supplement [20].

Adskillige undersøgelser har rapporteret brugen af ​​affald og biprodukter i produktionen af ​​lipase, blandt dem sojabønneskaller, vandmelonskræller, bomuldsfrømel, sojaskrå og andirobaoliekage [9,21-26]. Kombinationen af ​​andirobaoliekage og sojaskrå i forskellige proportioner til lipaseproduktion af Yarrowia lipolytica er dog endnu ikke blevet rapporteret. Denne forskning havde til formål at producere Yarrowia lipolytica lipase ved faststoffermentering (SSF) ved hjælp af biprodukter fra fødevareforarbejdningsindustrien (andiroba-oliekage og sojabønnemel) til at anvende i hydrolyse af fiskeolie for yderligere at producere flerumættede fedtsyrer.

2. Resultater og diskussion

Den strategi, der blev vedtaget for at producere lipase af Yarrowia lipolytica i SSF ved anvendelse af kombinationen af ​​andiroba-oliekage og sojabønnemel i forskellige proportioner, var baseret på rutediagrammet vist i figur 1.

2.1. Agro-industriel biproduktkarakterisering

Den fysisk-kemiske sammensætning af andirobaoliekage er vist i tabel 1. Andirobaoliekagen udgjorde 13,7 procent af proteiner, 26,9 procent af etherekstrakt, 0,4 procent af kulhydrater og 45,6 procent af uopløselige fibre. På den anden side udgjorde sojaskrå 48,3 procent af proteiner, 2,4 procent af etherekstrakt, 14,0 procent af kulhydrater og 18,0 procent af uopløselige fibre. Hvert næringsstof, der er til stede i kagen, har en rolle i mikrobiel metabolisme. Nitrogenindholdet er essentielt for syntesen af ​​proteiner, nukleotider og sekundære metabolitter for vækst og metabolisme af mikroorganismer samt for biosyntese af enzymer [25]. Det resterende olieindhold (etherekstrakt), der er til stede i andiroba-oliekagen, fungerer som en kulstofkilde, der deltager i dannelsen af ​​biomasse og produktionen af ​​energi til udførelsen af ​​cellulær funktion [26]. Derudover er olien til stede i andiroba-kagen et hydrofobt substrat og kan fungere som en inducer i produktionen af ​​lipase, som rapporteret af Brígida et al. [17]. Til at begynde med hydrolyserer lipase bundet til mikroorganismecellen lipidet, der er til stede i mediet, og initierer cellevækst. Undervejs i processen falder substrattilgængeligheden, så organismen udskiller ekstracellulære lipaser [27].

Asken kvantificeret i andiroba-oliekage (4,5 procent) og sojaskrå (6,3 procent) repræsenterer indholdet af flere mineraler og kan bruges i mikroorganismens metabolisme; dog kan nogle mineraler såsom natrium- og manganioner hæmme Yarrowia lipolytica vækst [17], og derfor er det nødvendigt at evaluere biprodukterne korrekt.

Kulhydrater og fiberindhold i råvarer kan bruges i mikrobiel ernæring i begrænset omfang, da Yarrowia lipolytica ikke producerer amylaser eller cellulaser og hemicellulaser [28,29], hvilket gør det vanskeligt at nedbryde disse polysaccharider og frigive kulstofrige forbindelser til bruges i gærstofskiftet. Det foreslås således, at gærvæksten hovedsageligt skyldes tilstedeværelsen af ​​de hydrofobe substrater i kagen.

Porøsitetsværdierne for andiroba-oliekagen og sojaskrået er vist i tabel 1. Ifølge tabel 1 var porøsiteten af ​​andiroba-kagen og sojaskrået 0.425 og 0.412 m3 luft m−3 seng hhv. Højere porøsitetsværdier er forbundet med forbedret masse- og varmeoverførsel under fermentering, hvilket fører til forbedret enzymproduktion. Derudover er porøsitet en vigtig parameter for at forstå mediets fugtighed: høje fugtværdier kan være forbundet med lave porøsitetsværdier, og dette påvirker beluftningen af ​​mediet og dermed produktionen af ​​lipase [22].

2.2. Lipase Produktion af SSF

Anvendelsen af ​​biprodukter til lipaseproduktion ved faststoffermentering og produktion af stabile faste biokatalysatorer giver mulighed for påføring af enzymet direkte i reaktionsmediet, hvilket reducerer omkostninger forbundet med enzymekstraktion og oprensning til efterfølgende påføring. Desuden giver brugen af ​​biprodukter næringsstoffer til mikrobiel vækst og udvikling, fungerer som fysisk støtte for mikroorganismen og reducerer dyrkningsmedieomkostningerne til processen. Desuden giver faststofgæring mulighed for at bruge rester og agroindustrielle biprodukter, hvilket er et alternativ til at reducere de miljøproblemer, der er forbundet med uhensigtsmæssig affaldsbortskaffelse [30].

Efter karakterisering blev biprodukterne brugt som et fast matrixsubstrat i produktionen af ​​lipase under anvendelse af SSF, der blev overvåget for lipolytiske og proteolytiske aktiviteter, fugt og pH under fermenteringsprocessen. Figur 2 viser de målte responsvariable profiler over 48 timers fermentering under anvendelse af Y. lipolytica og kombinationen af ​​andiroba-oliekage og sojabønnemel i forskellige proportioner som substrater.

Med hensyn til brugen af ​​substraterne individuelt blev den maksimale lipolytiske aktivitet på 4,36 U·g −1 fundet for sojaskrå (0:100; figur 2A) og 13,48 U·g −1 for andiroba oliekage (100:0; figur 2B), efter henholdsvis 12 og 24 timer. Efter at have nået punktet med størst lipaseaktivitet blev der observeret en reduktion i dens værdier, hvilket kan være relateret til stigningen i proteaseaktivitet. Dette enzym har en affinitet til proteinstrukturer og kan på grund af dette virke til at nedbryde lipasestrukturen, hvilket reducerer dens aktivitet [24,31,32].

Andiroba kage og sojabønnemel brugt i forskellige proportioner af (25:75), (50:50) og (75:25) producerede de maksimale værdier af lipaseaktivitet på 57,21 U·g -1 efter 12 timer (Figur 2C), 63,70 U·g −1 (Figur 2D) og 40,13 U·g −1 (Figur 2E) efter henholdsvis 24 timers fermentering, hvilket indikerer, at blandingen af ​​matricerne kan forbedre lipaseaktiviteten. Forbedringen i enzymatisk aktivitet efter en kombination af andirobaoliekage og sojaskrå kan forklares ved at observere de fysisk-kemiske sammensætninger af begge råvarer, som vist i tabel 1. Sojabønnemel har et højt proteinindhold, mens andirobaoliekage har et højere olieindhold . Blandingen af ​​andiroba-oliekage og sojaskrå til lipaseproduktion viste sig således at være mere interessant end at bruge hver enkelt separat, og dette favoriserer ikke-afhængigheden af ​​et enkelt substrat samt brugen af ​​mere end ét biprodukt.

Den initiale pH af matricerne er sur på grund af tilstedeværelsen af ​​frie fedtsyrer til stede i den olieholdige matrix, og denne tilstand favoriserer Yarrowia lipolytica-vækst, da denne gær har brug for et let surt medium for god vækst [33], hvilket undgår et medium buffertrin. Der er også en gradvis stigning i pH langs processen i matricerne i området fra 6,39 til 7,32 (Figur 2A), 5,69 til 6,82 (Figur 2C), 5,64 til 7,68 (Figur 2D) og 5,21 til 6,03 (Figur 2E). I matrixen, der kun indeholdt andiroba-oliekage, blev der observeret et gradvist fald i pH (4,8 til 4,26, figur 2B) på grund af olierestindholdet i det faste medium, da olien initialt hydrolyseres af lipase og ikke forbruges af gæren i de første timer, hvorved en let sur pH-værdi opretholdes.

Med hensyn til fugtindholdet blev der ikke observeret variationer gennem fermenteringen, hvilket viser, at inkubationssystemet med mættet fugt og matricerne var effektive til at holde på fugten. Et fermenteringsmedium, der er i stand til at opretholde et optimalt fugtindhold, er essentielt for lipaseproduktion af Yarrowia lipolytica [24], da denne parameter kan påvirke beluftningen af ​​systemet. Ydermere kræves det ideelle fugtindhold for at tilvejebringe det nødvendige vand til mikroorganismens metabolisme og for at opløse næringsstofferne. Når fugtindholdet er over det ideelle, kan der forekomme en dårlig diffusion af ilt i systemet, hvilket er uden for det ideelle område for mikroorganismen [34].

Nogle undersøgelser har rapporteret brugen af ​​biprodukter som substrater ved fermentering i fast tilstand. I disse undersøgelser er der dog en inkorporering af rene kulstof- og/eller nitrogenkilder såsom glucose, gærekstrakt, pepton og urinstof [35-37] i mængder, der kan øge procesomkostningerne. Den ideelle matrix skal præsentere nogle karakteristika for anvendelsen, som omfatter at fungere som en støtte, tilvejebringe de nødvendige næringsstoffer til mikroorganismens vækst og udskillelsen af ​​det bioteknologiske produkt af interesse. At finde alle disse egenskaber i et biprodukt kan være besværligt, hvilket gør det vanskeligt at finde et passende system til en fermenteringsproces; søgningen efter nye råvarer og deres kombination skal derfor være kontinuerlig [16].

Således blev forholdet 50:50 mellem andiroba-kage og sojaskrå valgt til yderligere test. Valget af denne betingelse er forbundet med valorisering af uudforsket affald fra Amazonas-regionen.

2.3. Fermentation Matrix Supplement

I den anden del af dette arbejde blev andiroba-oliekage og sojaskrå i forholdet 50:50 suppleret med 1,5 procent sojaolie, som vist i figur 3. Supplementet blev udført for at verificere, om tilgængeligheden af en lettere assimileret kulstofkilde (sojabønneolie) forbedret lipaseproduktion omkring det resterende olieindhold til stede i andiroba-oliekagen. Den maksimale lipaseaktivitet på 56,32 U·g-1 blev opnået efter 28 timers fermentering, og proteaseaktiviteten varierede fra 2,71 til 7,60 U·g-1. pH-værdien varierede fra 5,63 til 7,63, og fugten forblev uden større udsving i hele perioden (53 til 58 procent). Som tidligere præsenteret var den lipolytiske aktivitet opnået efter tilskud lavere end værdien fundet uden tilskud. Matrixtilskud til lipaseproduktion blev undersøgt af Farias et al. [38] og Souza et al. [24]. Forfatterne fandt en lipaseaktivitet på 139 U·g −1 og 93,9 U·g −1 ved hjælp af henholdsvis slam og sojaolie. Men når Souza et al. [24] udførte fermentering ved kun at bruge sojabønnemel (uden tilskud), fandt forfatterne 9,4 ± 0,3 U·g -1 lipaseaktivitet efter 10 timers fermentering, hvilket viser, at tilskud øgede lipaseaktiviteten i den undersøgte fermenteringsmatrix.

En anden komponent, der almindeligvis rapporteres til medium tilskud, er Tween 80. Dette rapporteres konstant i litteraturen, da denne komponent kan øge lipaseaktiviteten, når den anvendes i neddykket fermentering [39], men der er ingen rapporter, der bruger Tween 80 i faststoffermentering. Tween 80 kan øge ekstracellulær lipaseproduktion under fermenteringsprocessen på grund af substratets emulgeringskapacitet og derfor forbedre substrattilgængeligheden for mikroorganismen samt ændre cellepermeabiliteten [40]. Der blev således udført en undersøgelse, der kombinerede sojabønneolie 1,5 (procent vægt/volumen) og Tween 80 0.001 procent (vægt/volumen) i en emulsion for at supplere fermenteringsfastmediet, som vist i figur 4.

Om tilskuddet med Tween 80 blev det verificeret, at efter 14 timers fermentering var den lipolytiske aktivitet 57,6 U·g -1. Den samme værdi blev tidligere kun opnået med sojaolietilskud efter 28 timers fermentering, hvilket forlænger gæringsprocessen og påvirker levedygtigheden. Den maksimale lipolytiske aktivitet efter 20 timers fermentering var 82,52 U·g −1, en 1.46- fold stigning i forhold til lipaseproduktion ved brug af sojaolie alene og en 8-h reduktion i tidsprocessen.

Lange gæringstider øger omkostningerne ved processen, så søgningen efter en ideel binomial mikroorganisme - et medium, der producerer lipase på kortere tid (høj produktivitet), og som bruger biprodukter som matricer, er interessant. Adskillige undersøgelser i litteraturen har rapporteret produktionen af ​​lipase via SSF for at opnå passende betingelser og gøre det muligt at opnå lipaser. Brugen af ​​forskellige råmaterialer inklusive sojaskrå, raps, vandmelonskræller og palmekerneoliekage blev observeret med aktiviteter fra 9 til 127 U·g -1[9,22,24].

Sales, Castro, Ribeiro og Coelho [22] undersøgte lipaseproduktion af Y. lipolytica i faststoffermentering ved hjælp af sojaskrå suppleret med vandmelonskal (5 procent) opnåede en forbedring i lipaseaktivitet med 31 procent, en værdi svarende til 75,22 U ·g −1. Souza et al. [41] producerede lipase fra Y. lipolytica ved faststoffermentering til anvendelse i syntesen af ​​kommercielle estere med værdi for fødevareindustrien, og resultaterne viste, at den bedste fermenteringsbetingelse til at fremstille biokatalysatoren var at bruge sojaskrå og sojaolie ( 3 procent vægt/vægt). Enzymet fremstillet under disse betingelser gjorde det muligt at omdanne op til 92,9 for at syntetisere de anvendelige estere med høj værditilvækst anvendt i fødevareindustrien.

Ud over de høje enzymatiske aktiviteter opnået i dette arbejde, kan vi fremhæve de yderligere fordele: (i) muligheden for at bruge biprodukter med lav udnyttelse, med bæredygtighedsappel for Amazonas-regionen; (ii) muligheden for en kombination af forskellige biprodukter, som muliggør ernæringsmæssig komplementering til mikrobiel metabolisme; (iii) reduktionen i presset på komponenter, der allerede er udbredt i bioprocesindustrien, såsom sojaskrå; (iv) økonomisk værdiansættelse af biproduktproducerende regioner; (v) udvidelse af substratmulighederne til produktion af lipaser og (vi) en reduktion i driftsomkostningerne, blandt andre fordele.

2.4. SDS-SIDE

Det rå enzymekstrakt opnået efter fermentering under anvendelse af en matrix sammensat af andirobaoliekage og sojabønnemel (50:50) uden tilskud blev analyseret i SDS-PAGE. Den elektroforetiske analyse viste proteinbåndene indeholdt i det enzymatiske ekstrakt, som vist i figur 5.

Bane 1 henviser til standardproteinmarkører, og bane 2 er prøven opnået fra kombinationen af ​​andiroba-oliekage og sojabønnemel i den bedre undersøgte andel (50:50). Det er muligt at visualisere et bånd omkring 37-40 kDa i det rå enzymekstrakt, der kan være relateret til lipase og/eller esterase produceret af Yarrowia lipolytica, som observeret af Souza et al. [41], som også kan være den vigtigste ekstracellulære lipase af Y. lipolytica (Lip2), som blev produceret bredt i alle vores undersøgelser. Desuden er det rapporteret, at selv for enzymer, der hovedsageligt er forbundet med cellevæggen (Lip7 og Lip8) af Y. lipolytica, er den samme molekylmasse blevet observeret (37-41 kDa) [42].

Derudover, ifølge resultater, der tidligere er offentliggjort af vores forskningsgruppe, var de samme bånd præsenteret her relateret til esterase- og lipaseaktivitet fra zymogrammet afsløret af -naphthylacetat som substratet [41], hvilket gjorde det muligt for os at korrelere dem. Båndene på 75 kDa refererer til underenheden af ​​-conglycinin til stede i sojabønnemel som fundet af Sales et al. [22] og Cheng et al. [43] i sojaskråets gæring.

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】