Laccase-Mediator System, der bruger en naturlig mediator som et blegemiddel til affarvning af melanin, del 1

Abstrakt: I denne undersøgelse blev et laccase-mediator system (LMS) ved hjælp af en naturlig mediator udviklet som et blegemiddel til melanin affarvning. Syv naturlige mediatorer blev brugt til at erstatte syntetiske mediatorer og med succes overvinde laccases lave redoxpotentiale og begrænsede adgang for melanin til det aktive sted for laccase. Melanin-affarvningsaktiviteten af ​​laccaser fra Trametes versicolor (lacT) og Myceliophthora thermophila (lacM) blev signifikant forbedret ved brug af naturlige mediatorer, herunder acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon, som viste lav cytotoksicitet. Methoxy- og ketongrupperne af naturlige mediatorer spiller en vigtig rolle i melanin-affarvning. Specificitetskonstanterne for lacT og lacM for melanin-affarvning blev forstærket med henholdsvis 247 og 334, når acetosyringon blev brugt som mediator. LMS, der bruger blonder og acetosyringon, kan også affarve melanin, der er til stede i cellulosehydrogelfilmen, som efterligner hudtilstanden. Desuden kunne LMS affarve ikke kun syntetiske eumelaninanaloger fremstillet ved oxidation af tyrosin, men også naturligt melanin produceret af melanomceller.

Ifølge relevante undersøgelser,cistancheer en almindelig urt, der er kendt som "mirakelurten, der forlænger livet". Dens hovedkomponent ercistanoside, som har forskellige effekter som f.eksantioxidant, anti-inflammatorisk, ogfremme af immunfunktionen. Mekanismen mellem cistanche oghudblegningligger i den antioxidante virkning af cistancheglykosider. Melanini menneskelig hud produceres ved oxidation af tyrosin katalyseret aftyrosinase, og oxidationsreaktionen kræver deltagelse af ilt, så de iltfrie radikaler i kroppen bliver en vigtig faktor, der påvirker melaninproduktionen. Cistanche indeholdercistanoside, som er en antioxidant og kan reducere dannelsen af ​​frie radikaler i kroppen, såledeshæmmer melaninproduktionen.

Klik på Rou Cong Rong fordele ved blegning

For mere info:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Introduktion

Laccaser (EC 1.10.3.2, benzendiol: dioxygenoxidoreduktaser) er multikobberproteiner, der katalyserer oxidationen af ​​forskellige phenoliske og ikke-phenoliske forbindelser via en radikal-katalyseret reaktionsmekanisme ved reduktion af molekylært oxygen [1,2]. Laccaser er blevet brugt som biokatalysatorer til bionedbrydningsprocesser, såsom bioremediering af farvestoffer [3,4], lægemidler [5,6], herbicider [7] og delignificering [8-10]. Laccaser er også blevet brugt til at katalysere polymeriseringen af ​​farvestofprækursorer og organiske forbindelser [11]. Især deres attraktive egenskaber, såsom lav substratspecificitet, brugen af ​​oxygen som den endelige elektronacceptor, generering af vand som et biprodukt og ingen efterspørgsel (eller ingen produktion) af peroxider, gør dem interessante i bioteknologiske og miljøfelter [1,11,12].

Fire kobberioner på det aktive sted er involveret i den katalytiske aktivitet af laccase. "Blå" kobber (T1-sted) oxiderer substratet, og den trinukleære kobberklynge (T2/T3) modtager elektronerne fra T1-stedet for at reducere den molekylære oxygen [1,12,13]. Især er redoxpotentialet af T1-stedet Cu betragtes som en vigtig faktor ved bestemmelse af laccasernes katalytiske evne [14]. Laccaser har et relativt lavt redoxpotentiale (0.4–0.8 V) sammenlignet med ligninolytiske peroxidaser (over 1 V) såsom manganperoxidase og ligninperoxidase. Laccaser kan ikke direkte oxidere ikke-phenoliske substrater med et redoxpotentiale over 1,3 V [13,14]. Derfor, for at overvinde begrænsningerne ved laccase, laccase-mediator-systemer (LMS) ved hjælp af små molekylære forbindelser, såsom 2,20 -azinobis(3- ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) (ABTS), { {24}}hydroxybenzotriazol (HOBt), violsyre (VLA), N-hydroxyphthalimid (HPI), N-hydroxyacetanilid (NHA) og TEMPO, der fungerer som redoxmediatorer, er blevet foreslået [15-17].

Disse mediatorer tillader oxidation af voluminøse forbindelser via forskellige oxidationsveje. Laccase-ABTS-systemet oxiderer substrater ved at generere et kationisk ABTS-radikal via en elektronoverførselsmekanisme (ET). LMS'er med HOBt, VLA, HPI eller NHA producerer nitroxylradikaler via hydrogenatomoverførselsmekanismen (HAT) [1,12,17]. Desuden reagerer mediatorer såsom TEMPO og dets analoger via ioniske veje for at generere oxoammoniumioner [1,12,18]. Brugen af ​​disse mediatorer kan oxidere en lang række forbindelser i forskellige applikationer, såsom farvestofnedbrydning [3,4], lægemiddelnedbrydning [5,6] og ligninnedbrydning [8-10]. Ikke desto mindre er anvendelserne af syntetiske mediatorer i industrielle områder blevet begrænset på grund af deres potentielle toksicitet, høje omkostninger og enzyminaktiveringseffekt. For nylig er lignin-afledte phenolmolekyler som naturlige mediatorer (f.eks. syringaldehyd, acetosyringon, vanillin, acetovanillon, methylvanillat, ferulinsyre, sinapinsyre, p-cumarsyre osv.) blevet undersøgt for at erstatte syntetiske mediatorer [1,12] . Fordelene ved naturlige mediatorer er lave omkostninger og lav toksicitet, fordi de er opnået fra naturlige og vedvarende kilder [19].

Melanin er en gruppe naturlige pigmenter produceret ved melanogenese gennem oxidativ polymerisation af tyrosin af melanocytter. Naturlig melanin kan klassificeres i fem kategorier af eumelanin, pheomelanin, alle melanin, pheomelanin og neuromelanin [20]. For nylig er forskellige medicinske og elektrokemiske anvendelser ved hjælp af melanin eller melanin-prækursorer blevet undersøgt [20,21]. Menneskets hudfarve bestemmes for det meste af tilstedeværelsen af ​​melanin. I den kosmetiske industri er den direkte depigmentering af melanin ved hjælp af enzymer blevet foreslået til udvikling af hudblegemidler. Adskillige peroxidaser er blevet undersøgt for at affarve melanin. Woo et al. viste, at syntetisk melanin kan affarves direkte af ligninperoxidase fra P. chrysosporium [22]. Keneko- og Mohorˇciˇc-grupperne rapporterede også den enzymatiske affarvning af melanin med manganperoxidase isoleret fra svampe (Sporotrichum pruinose og Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. rapporterede, at rå enzymblandinger indeholdende manganperoxidase, ligninperoxidase og laccase viste melanin-depigmenteringsaktivitet [25]. Når peroxidaser affarver melanin, kræver de hydrogenperoxid (H2O2) som en cofaktor, der kan irritere huden. For at reducere brugen af ​​H2O2 blev glucoseoxidase eller laccase således indført i enzymkombinationssystemet [26,27]. Laccaser kan affarve melanin uden brug af brintoverilte. Khammuang og Sarnthima rapporterede, at laccase fra Lentinus polycarpous Lév viste melanin-affarvningsaktivitet ved brug af ABTS, vanillin og vanillinsyre som mediatorer [28].

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

2.2. Melanin affarvning af LMS

Den mættede melaninopløsning (1,4 mg/ml) blev fremstillet ved opløsning af 3 mg syntetisk melanin i 1,3 ml 10 mM NaOH. Opløsningen blev centrifugeret ved 85 00 rpm i 5 minutter for at fjerne det uopløste melanin, og supernatanten blev fortyndet med 0.1 M citronsyrephosphatbuffer (pH 3, 4, 5, 5,5, 6 eller 7) og bruges som substratopløsning til LMS. Koncentrationen af ​​melanin i substratopløsningen var 63 µg/ml og spektrofotometrisk bekræftet ved 475 nm. 0,8 ml melaninsubstratopløsning blev blandet med 0,1 ml mediatoropløsning (0-1 mM) i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Melanin-affarvningsreaktionen blev initieret ved at tilsætte 0,1 ml laccaseopløsning (15,8 µg (0,6 U) lacT eller 19,2 µg (1,8 U) lacM) til en blanding af melanin og mediatoren ved 25 ◦C i et rystende vandbad ved 120 rpm. . Efter reaktionen blev reaktionsblandingen centrifugeret, og absorbansen af ​​supernatanten blev målt ved 475 nm. Affarvningsudbyttet (procent) blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

Affarvning ( procent ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetisk undersøgelse af melanin affarvning af LMS

2.4. Cytotoksicitet af naturlige mediatorer

B16F10 melanomcellelinjen (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) blev brugt til at bestemme cytotoksiciteten af ​​naturlige mediatorer for LMS. Et neutralt rødt (NR) assay blev udført for at måle mediatorernes cytotoksicitet [29]. NR måler levedygtigheden af ​​levende cellelysosomer. Melanomceller med en koncentration på 3 × 104 celler blev dispenseret i hver brønd i en 96-brøndsplade. Efter 24 timers dyrkning blev cellerne behandlet med naturlige mediatorer (1, 2, 5, 10, 22 og 46 mM). Efter yderligere dyrkning i 2 dage blev cellerne behandlet med 50 µg/ml NR-opløsning opløst i DMEM og inkuberet i 3 timer. Efter fjernelse af supernatanten gennem sugning blev en NR-desorberingsopløsning (1 procent iseddike, 49 procent ethanol og 50 procent destilleret vand) anvendt til farveekstraktion. Efter ekstraktionsprocessen blev ændringen i absorbans målt ved 540 nm.

2.5. Forberedelse og affarvning af melanin/cellulosehydrogelfilmen

For at måle affarvningsaktiviteten af ​​LMS for melanin/cellulosefilmen blev den fremstillede hydrogelfilm skåret i et 1 x 2 cm ark. Hydrogelfilmen blev nedsænket i 4 ml 0.1 M citronsyrephosphatbuffer (pH 5,5); efterfølgende blev 0,5 ml 1 mM acetosyringon og 0,5 ml blondeopløsning (2,5 U) tilsat til bufferen. Affarvningsreaktionen blev udført i et vandbad under omrystning ved 120 pm og 25 ◦C i 3 timer. Efter reaktionen blev filmen vasket med destilleret vand og fastgjort til indersiden af ​​kuvetten for at måle ændringen i spektrene i området 400-800 nm ved anvendelse af et UV/Vis-spektrofotometer. Kontrolreaktioner uden lacM eller mediatorer blev også udført under de samme betingelser. Frigivelsen af ​​melanin fra filmen eller farveændring af melanin/cellulosefilmen blev ikke påvist under reaktionsbetingelserne. Ydermere blev ændringen i farveparametre (L*, a* og b* værdier) af melanin/cellulosefilmen efter affarvningsreaktionen med LMS også registreret ved anvendelse af et kolorimeter (KONICA MI NOLTA, Tokyo, Japan). ∆L (metrisk lyshedsforskel), ∆E (total farveforskel), YI (gulhedsindeks) og WI (hvidhedsindeks) blev opnået ved hjælp af følgende ligninger [30-32]:

2.6. Fremstilling af naturlig melanin

Naturligt melanin blev opnået fra B16F10 melanomceller. Cellerne blev behandlet med alfa-melanocyt-stimulerende hormon for at producere melanin. Efter 4 dages inkubation blev cellerne fanget under anvendelse af trypsin-EDTA og sonikeret i 10 min. Supernatanten blev opnået ved centrifugering ved 8000 rpm i 10 minutter og derefter justeret til pH 1,5 under anvendelse af 6 M HCI. Opløsningen blev kogt ved 100 ◦C i 4 timer for at hydrolysere de resterende proteinfraktioner. Opløsningen indeholdende naturlig melanin blev vasket med acetone, efterfulgt af chloroform og ethanol, og derefter vasket med deioniseret vand for at fjerne rester, såsom celler, mediekomponenter og proteinfraktioner [33,34]. Alle vaskeprocesser blev udført mere end to gange. Endelig blev naturlig melanin opnået ved frysetørring og brugt som et substrat for LMS.

3. Resultater og diskussioner

3.1. Effekten af ​​mediatorer på melanin affarvning af LMS

Virkningen af ​​forskellige mediatorer på melanin-affarvningsreaktionen med LMS blev undersøgt ved anvendelse af to laccaser fra T. versicolor (lacT) og M. thermophila (lacM) (figur 1).Når lacT blev anvendt uden en mediator til melanin-affarvning, var affarvningsudbyttet kun 1 procent efter 5 timers reaktion. Når HOBt blev brugt som en mediator for lacT, blev affarvningsudbyttet en smule forøget til 2 procent efter 5 timers reaktion. Brugen af ​​forskellige syntetiske mediatorer, såsom HOBt, ABTS, VLA og TEMPO, i den laccase-katalyserede oxidation af phenoliske eller ikke-phenoliske forbindelser øgede reaktionshastighederne signifikant [10,15]. Når adgangen af ​​målforbindelser til det aktive sted af laccase er begrænset af deres steriske hindring, kan mediatorradikaler dannet af laccase effektivt oxidere målforbindelserne ved hjælp af elektronoverførsels- eller hydrogenatomoverførselsmekanismen [12]. HOBt er en af ​​de mest almindeligt anvendte syntetiske mediatorer i LMS på grund af dets høje redoxpotentiale (1,1 V) [6]. HOBt er dog ikke en god kosmetisk ingrediens på grund af dens potentielle celletoksicitet og evne til at inaktivere laccase. Således valgte vi syv naturlige mediatorer, acetosyringon, syringaldehyd, p-cumarsyre, vanillin, vanillinsyre, vanillylalkohol og acetovanillon, til melanin-affarvningsreaktionen ved LMS. Interessant nok fungerer alle de naturlige mediatorer som mere effektive mediatorer end HOBt for melaninaffarvning ved mangel. Når acetosyringon, syringaldehyd og p-cumarsyre blev brugt, var affarvningsudbyttet henholdsvis 28 procent, 22 procent og 18 procent efter 5 timers reaktion. Disse resultater viser anvendeligheden af ​​naturlige mediatorer til melanin-affarvningsreaktionen ved LMS. Mediatorerne i LMS oxideres til mediatorradikaler af laccase, og mediatorradikaler inducerer oxidation og affarvning af melanin. Når mangel blev anvendt uden en mediator til melanin-affarvning i en tilstrækkelig reaktionstid, som kunne nå ligevægtstilstanden, var affarvningsudbyttet 7 procent efter 24 timers reaktion. De naturlige mediatorer, undtagen vanillinsyre, fungerer som mere effektive mediatorer end HOBt for melanin-affarvning med lacT efter 24 timers reaktion. Affarvningsudbyttet efter 24 timers reaktion under anvendelse af vanillinsyre som mediator var lavere end efter 5 timers reaktion. Dette kan være forårsaget af den lave stabilitet af den oxiderede radikalform af vanillinsyre. Når acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon blev brugt, var affarvningsudbyttet henholdsvis 34 procent, 30 procent og 31 procent efter en 24 timers reaktion. p-cumarsyre var mere effektiv til at øge den indledende reaktionshastighed end acetovanillon, mens acetovanillon inducerede et højere affarvningsudbytte ved ligevægtstilstanden end p-cumarsyre.

Virkningen af ​​mediatoren på affarvningsreaktionen ved LMS under anvendelse af lacM var også meget lig den, der blev opnået ved LMS under anvendelse af lacT. Når blonder blev brugt uden en mediator til melanin-affarvning, var affarvningsudbyttet kun 2 procent efter 5 timers reaktion. HOBt som mediator for lacM øgede ikke affarvningsudbyttet under 5 timers reaktionen. Alle de naturlige mediatorer, undtagen p-cumarsyre og vanillin, virkede som effektive mediatorer af melanin-affarvning med lacM. Når acetosyringon og syringaldehyd blev anvendt, var affarvningsudbytterne henholdsvis 25 procent og 22 procent efter 5 timers reaktion. p-cumarsyre og vanillin blev brugt som effektive mediatorer for hver, men de kunne ikke effektivt øge affarvningshastigheden i LMS ved brug af blonder. Dette kan være forårsaget af den lavere substratspecificitet af lacM for p-cumarsyre og vanillin. Affarvningsudbytterne efter 24 timers reaktion af lacM med p-cumarsyre og vanillin svarede til dem, der blev opnået med lacT. Dette indikerer, at de oxiderede former af p-cumarsyre og vanillin effektivt kan affarve melanin, selvom deres oxidationshastighed med lacM var meget lavere end med lacT. Når lacM uden en mediator blev anvendt til melanin-affarvning i en tilstrækkelig reaktionstid, var affarvningsudbyttet 5 procent efter 24 timers reaktion. De naturlige mediatorer, undtagen vanillinsyre, fungerer også som mere effektive mediatorer end HOBt til melaninaffarvning med lacM efter 24 timers reaktion. Når acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon blev brugt som mediatorer for lacM, var affarvningsudbyttet henholdsvis 34 procent, 28 procent og 31 procent efter 24 timers reaktion. Når vanillinsyre blev brugt som mediator for både lacT og lacM, viste den det laveste affarvningsudbytte. Dette kan være forårsaget af den lave stabilitet af den oxiderede radikalform af vanillinsyre. Khammuang og Sarnthima rapporterede, at vanillin og vanillinsyre kunne bruges som mediatorer til melanin affarvning ved hjælp af laccase fra Lentinus polycarpous [28]. Imidlertid viste de meget lavere affarvningsaktivitet for melanin end acetosyringon, når de blev brugt som mediatorer for lacT og blonder.

Disse resultater indikerer, at naturlige mediatorer er mere effektive til melanin-affarvning med LMS end HOBt. HOBt er blevet betragtet som en effektiv syntetisk mediator for laccase på grund af dets høje redoxpotentiale og den katalytiske rolle af N OH-gruppen af ​​HOBt [5]. Effektiviteten af ​​mediatorer til at oxidere målsubstrater er meget afhængig af evnen til at danne stabile radikaler såvel som den steriske hindring forårsaget af voluminøse alkylsubstituenter snarere end mediatorernes redoxpotentiale [19,35]. Den lave stabilitet af det oxiderede mellemprodukt af HOBt er blevet bestemt gennem cyklisk voltammetri [6]. Derfor kan det lave affarvningsudbytte ved LMS ved anvendelse af HOBt være forårsaget af den lave stabilitet af HOBt under reaktionsbetingelserne for laccase. Selvom redoxpotentialet for syringaldehyd var lavere end for HOBt, viste syringaldehyd relativt højere stabilitet end HOBt [6].

Som vist i figur 2 har de naturlige mediatorer, der anvendes i dette arbejde, forskellige substituenter (f.eks. hydroxyl, methoxy, carboxyl, keton eller aldehyd) i forskellige positioner på benzenringen [12,19]. Mediatorer med to methoxygrupper (acetosyringon og syringaldehyd) viste højere affarvningsrater end dem med en methoxygruppe. Affarvningshastigheden opnået med p-cumarsyre uden methoxygruppe var afhængig af typen af ​​laccase. p-cumarsyren med lacT viste en højere affarvningshastighed end dem med en methoxygruppe, mens p-cumarsyren med lacM viste den laveste affarvningshastighed i 5 timers reaktionen. Fillat et al. viste også lignende resultater for affarvning af flexografiske blæk ved svampelaccaser med naturlige mediatorer [36]. De phenoliske naturlige mediatorer (acetosyringon, methylsprøjte og syringaldehyd) med to methoxysubstituenter i ringen blev oxideret af laccase hurtigere end p-cumarsyre uden methoxygruppe. Dette indikerer, at methoxygrupper spiller en vigtigere rolle som elektrondonorer end dobbeltbindingen af ​​den laterale kæde af p-cumarsyre. Når mediatorerne med én methoxygruppe blev sammenlignet, steg affarvningsudbyttet i følgende rækkefølge: acetovanillon > vanillin > vanillylalkohol > vanillinsyre. Acetovanillon, som har en ketongruppe, viste en højere affarvningshastighed og udbytte end mediatorerne med aldehyd-, hydroxyl- og carboxylgrupper. Acetosyringon med en ketongruppe viste også en højere affarvningshastighed og udbytte end syringaldehyd med en aldehydgruppe.

I de følgende eksperimenter blev acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon, som viste høj melanin-affarvningsevne, udvalgt som mediatorer for LMS til at affarve melanin. Effekten af ​​mediatoren på affarvningsreaktionen ved LMS blev undersøgt over tid (figur S1). Affarvningsreaktionen ved anvendelse af lacT med acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon resulterede i henholdsvis 21 procent, 18 procent og 1 procent affarvningsudbytter efter 1 times reaktion. Affarvningsreaktionen ved anvendelse af lacM med acetosyringon og syringaldehyd resulterede i henholdsvis 19 procent og 18 procent affarvningsudbytter efter 1 times reaktion. Begge laccaser viste lignende reaktionsprofiler, når den samme mediator blev anvendt. Acetosyringon og syringaldehyd øgede signifikant affarvningshastigheden under den indledende reaktion. Disse resultater viser, at acetosyringon og syringaldehyd indeholdende dimethoxygrupper var mere effektive til at øge den initiale affarvningshastighed ved LMS end acetovanillon indeholdende en methoxygruppe. Fillat et al. rapporterede også, at methoxygrupperne i ringstrukturerne af mediatorer fungerer som acceleratorer for oxidation af substrater [36]. På den anden side svarede affarvningsudbyttet efter 24 timers reaktion med acetovanillon til det med syringaldehyd, selvom acetovanillon forbedrede reaktionshastigheden moderat.

For flere oplysninger: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501