dkSprog
Hjem / Viden / Indhold

Viden

Kuwanon T og Sanggenon A isoleret fra Morus Alba udøver antiinflammatoriske virkninger ved at regulere NF-KB og HO -1/Nrf2 signalveje i BV2 og RAW264.7 celler

Mar 30, 2022

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Vi har tidligere undersøgt methanolekstrakten af ​​Morus alba bark og karakteriseret 11 forbindelser fra ekstraktet: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) og norartocarpanon (11). Heri undersøgte vianti-inflammatoriskvirkninger af disse forbindelser på mikrogliaceller (BV2) og makrofager (RAW264.7). Blandt dem hæmmede 3 og 4 markant den lipopolysaccharid(LPS)-inducerede produktion af nitrogenoxid i disse celler, hvilket tyder på de antiinflammatoriske egenskaber af disse to forbindelser. Disse forbindelser hæmmede produktionen af ​​prostaglandin E2, interleukin-6 og tumornekrosefaktor-c og ekspressionen af ​​inducerbar nitrogenoxidsyntase og cyclooxygenase-2 efter LPS-stimulering. Forbehandling med 3 og 4 hæmmede aktiveringen af ​​nuklear faktor kappa B-signalvejen i begge celletyper. Forbindelserne inducerede også ekspressionen af ​​hæmoxygenase(HO)-1 gennem aktivering af nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2. Undertrykkelse af aktiviteten af ​​HO-1 vendte de forårsagede antiinflammatoriske virkninger ved forbehandling med 3 og 4, hvilket tyder på, at de antiinflammatoriske virkninger blev reguleret af HO-1. Tilsammen er 3 og 4 potentielle kandidater til at udvikle terapeutiske og forebyggende midler tilinflammatoriske sygdomme.

Nøgleord: Morus alba; kuwanon T; sanggenon A; BV2; RAW264.7 celler; anti-inflammatoriske virkninger

flavonoids anti-inflammatory

Klik her for at lære flere produkter

1. Introduktion

Morus alba, en lægeplante, der tilhører familien Moraceae, er blevet brugt til behandling af lungebetændelse i traditionel medicin [1]. Dens rodbark indeholder forskellige aktive komponenter såsom umbelliferon, scopoletin, muciner, tanniner,flavonoider(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E og kuwanon H)[2], 2-arylbenzofuraner (moracenin D, moracin P, moracin O og mulberrofuran O), og prenylerede flavonoider (licoflavon C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin og Kuwana U)[3,4]. M. alba ekstrakter og aktive forbindelser kan lindre lungesygdomme, som afsløret af nyere undersøgelser [5-7]. Ud over den farmakologiske effekt af M.alba på lungerne, udøver isoprenylerede flavonoider (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G og mulberrofuran C) hepatobeskyttende virkninger i t-BHP-inducerede HepG2-celler [8]. Prenyl-flavonoider (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T og morusin) og triterpenoider (betulinsyre, avail og -sitosterol) hæmmer i væsentlig grad differentieringen af ​​3T3-L1-adipocytter [9]. Morinhydrat, den vigtigste flavonoidbestanddel af M. alba, lindrer kronisk uforudsigelig stress-induceret hukommelsessvækkelse, hvilket indikerer, at denne forbindelse kunne booste antioxidantforsvarssystemet og hæmme neuroinflammatoriske veje [10]. Disse undersøgelser tyder på, at bestanddelene i M.alba er potentielle kandidater til behandling af forskellige sygdomme.

Betændelse, et komplekst selvforsvarsrespons på skadelige stimuli, spiller en vigtig rolle i immunforsvaret gennem aktivering af flere immunceller, herunder makrofager, monocytter, leukocytter, mastceller og andre celletyper [11]. Makrofager er de mest udbredte og mest udbredte immunceller i kroppen, og mikroglia er residente makrofager i centralnervesystemet (CNS)[12]. Makrofager og mikrogliaceller er nøglespillere i den inflammatoriske reaktion. De kan aktiveres som reaktion på stimuli såsom lipopolysaccharid (LPS), cytokiner og kemokiner og inducerer inflammatoriske tilstande [13]. Under inflammatoriske tilstande forårsager overdrevent aktiverede makrofager og mikrogliaceller unormal regulering af pro-inflammatoriske mediatorer (nitrogenoxid (NO), prostaglandin E2(PGE,), inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og cyclooxygenase (COX)-2 ) og pro-inflammatoriske cytokiner (interleukin (IL)-6 og tumornekrosefaktor (TNF)-a), gennem aktiveringen af ​​den nukleære faktor kappa B (NF-B) signalvej[14,15]. Øgede niveauer af pro-inflammatoriske mediatorer forværrer yderligere udviklingen af ​​inflammatoriske sygdomme, som yderligere øger aktiveringen af ​​inflammatoriske faktorer, hvilket resulterer i en ond cirkel[16]. Derfor er regulering af inflammatoriske mediatorer afgørende for behandling og forebyggelse af inflammatoriske sygdomme.

Hæm-oxygenase (HO)-1 er et hastighedsbegrænsende enzym, der katalyserer nedbrydningen af ​​hæm til biliverdin, ferro-ion (Fe2 plus) og carbonmonoxid (CO)[17]. HO-1-induktion reguleres af aktiveringen af ​​nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2(Nrf2). HO-1 kan induceres som reaktion på oxidativ stress og inflammation for at beskytte væv og opretholde homeostase i kroppen[18]. Derfor er målretning af HO-1-induktion en af ​​de potentielle strategier til behandling af inflammatoriske sygdomme.

I vores løbende stræben efter at udforske kandidat(er) fra naturlige produkter til behandling af inflammatoriske sygdomme, præsenterer vi herianti-inflammatoriske virkningeraf 11 l forbindelser isoleret fra M.alba i LPS-inducerede BV2- og RAW264.7-celler.

4flavonoids anti-inflammatory

2. Resultater

2.1. Virkninger af 11 forbindelser isoleret fra M.alba på levedygtigheden af ​​BV2- og RAW264.7-celler

I den tidligere undersøgelse blev rodbarken af ​​M.alba ekstraheret i vandig methanol, og de opnåede ekstrakter blev successivt opdelt i EtOAc, n-BuOH og H2O2. Gentagen SiO2-, ODS- og Sephadex LH-20-søjlekromatografi af EtOAc-fraktionen gav 11 forbindelser, såsom kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) og norartocarpanon (11)[6,19,20]. De kemiske strukturer af 11 forbindelser isoleret fra M.alba er illustreret i figur 1. For at bestemme de cytotoksiske virkninger af disse forbindelser, en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{ 26}}.5-diphenyltetrazoliumbromid(MTT)-assay blev udført, BV2- og RAW264.7-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af forbindelserne i 48 timer i koncentrationer på op til 80 μM. (Figur 2). Forbindelser 2, 3 og 4 havde toksiske virkninger ved 80 μM, forbindelse 5 havde toksiske virkninger ved 40 μM. Baseret på resultatet af toksicitetsevalueringen blev et ikke-toksisk koncentrationsområde udvalgt til efterfølgende undersøgelser af de antiinflammatoriske virkninger (forbindelse 2, 3,4 ved 40 uM, forbindelse 5 ved 200 μM og andre forbindelser ved 80 μM) .

Chemical structures of compounds 1–11 isolated from M. alba

Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were incubated for 48 h with various concentrations of the compounds, and their viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 ,*** p < 0.001 compared with the control group. Figure 2. Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW

2.2. Virkninger af 1-forbindelser isoleret fra M. alba på ekspressionen af ​​inflammatoriske faktorer og iNOS-protein i BV2- og RAW264.7-celler

NO er ​​et frit radikal i kardiovaskulære, nervøse ogimmunsystemer. Det opretholder intracellulær homeostase, transporterer neurotransmittere og regulerer antiinflammatorisk aktivitet og cytotoksicitet. Men når en stor mængde NO produceres, har det skadelige virkninger på kroppen, herunder vasodilatation, cytotoksicitet og vævsskade [21,22]. Vi undersøgte derefter virkningerne af disse forbindelser på nitritproduktion i LPS-inducerede BV2- og RAW264.7-celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af forbindelser i 2 timer før stimulering med LPS (1 ug/mL) i 24 timer. Blandt forbindelserne inhiberede kun forbindelse 3 (kuwanonT) og 4(sanggenon A) signifikant nitritproduktion i både BV2- og RAW264.7-cellelinjer (figur 3). Derudover udførte vi et yderligere eksperiment for at sammenligne den hæmmende effekt af nitritproduktion mellem den LPS-behandlede gruppe efter den sammensatte forbehandling og den sammensatte-behandlede gruppe efter LPS-forbehandlingen. Som et resultat var der ingen forskel i den hæmmende effekt af nitritproduktion mellem de to forsøgsgrupper (Supplerende figur S1). Derfor blev følgende eksperimenter i denne undersøgelse udført under anvendelse af forbehandlingen med forbindelser inden for 2~3 timer før behandling af LPS.

. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Produktionen af ​​NO øges af de pro-inflammatoriske proteiner inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS). Imidlertid forringer overekspression af iNOS alvorligt sygdommens patofysiologi [23]. Forbindelser 3 og 4 inhiberede ekspressionen af ​​iNOS på en koncentrationsafhængig måde (figur 4). Vi undersøgte virkningerne af forbindelser 3 og 4 på LPS-induceret ekspression af inflammatoriske faktorer i BV2- og RAW264.7-celler. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af forbindelser 3 og 4 i 2 timer før stimulering med LPS (1 ug/ml) i 24 timer. Begge forbindelser inhiberede signifikant LPS-induceret ekspression af PGE2, TNF og IL-6 i BV2- og RAW264.7-celler (figur 5). Resultaterne så ud til at vise, at forbehandling med forbindelse 3 og 4 undertrykte den LPS-inducerede inflammation i BV2- og RAW264.7-celler.

Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Molecules 2021, 26, x FOR PEER REVIEW 5 of 16 Figure 3. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A,D), IL-6 (B,E), and TNF-α (C,F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

effects of cistanche improve immunity (33)

2.3. Virkninger af forbindelser 3 og 4 på NF-xB-translokation i BV2- og RAW264.7-celler

NF-kB er en transkriptionsfaktor, der regulerer iNOS-ekspression [24]. Normal NF-kB forbliver i sin inaktive form ved at danne komplekser med regulatoriske proteiner såsom IKB. Men når det aktiveres af LPS, nedbrydes IkBa ved phosphorylering, og NF-kB (såsom p65) translokeres til kernen [25], hvilket fremmer det inflammatoriske mediatorgen og inducerer ekspressionen af ​​inflammatoriske faktorer [26]. For yderligere at undersøge den hæmmende effekt af forbindelser 3 og 4 på produktionen af ​​pro-inflammatoriske faktorer i LPS-aktiverede BV2- og RAW264.7-celler, undersøgte vi ekspressionsnuklear translokation af p65 i celler behandlet med forbindelser 3 og 4, LPS, eller begge under anvendelse af et anti-p65 FITC-mærket antistof. DAPI blev brugt til nuklear farvning. I kontrolgruppen blev p65-ekspression påvist i cytosolen. I de LPS-inducerede celler blev p65-akkumulering imidlertid påvist i kernen, som angivet i de fusionerede billeder af DAPI- og p65-farvning. Sammenlignet med de LPS-inducerede celler reducerede forbindelser 3 og 4 endvidere markant den LPS-medierede stigning i NF-KB (p65) DNA-bindende aktivitet (figur 6A, B) og nuklear translokation (figur 6C-F). Disse resultater indikerer, at forbindelser 3 og 4 er negative regulatorer af LPS-stimuleret NF-kB nuklear translokation.

Effects of compounds 3 and 4 on and NF-κB DNA-binding activity (A,B) and NF-κB (p65) localization (C–F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated with compounds 3 or 4 for 2 h and stimulated with liposaccharide (LPS; 1 µg/mL) for 1 h. Experiments were performed using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in the Materials and Methods section. ** p and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

2.4. Effekter af forbindelser 3 og 4 på Nrf2/HO-1-banen i BV2 og RAW264.7

Cells Heme oxygenase-1(HO-1)er et mål for nuklear faktor E2-relateret faktor 2(Nrf2), Nrf2/HO-1-vejen er et kraftigt antioxidant-signalsystem for at fremme frit jern i kulilte (CO), biliverdin og hæm [27]. Kulilte, en gasformig metabolit af hæmkatabolisme, udviser regulatoriske virkninger af vasodilatation og proinflammatoriske reaktioner [28]. Derudover er HO-1 også kendt for at spille en vigtig rolle i at beskytte celler mod inflammation og oxidativt stress og for at regulere nitritproduktion i aktiverede makrofager [29]. Vi udførte Western blotting for at undersøge, om forbindelser 3 og 4 øger ekspressionsniveauet af HO-1, hvor den velkendte HO-1-inducer cobalt protoporphyrin(CoPP) blev brugt som en positiv kontrol, der øgede HO{{ 16}} proteinekspression. [30]. Resultaterne afslørede, at forbindelser 3 og 4 også opregulerede ekspressionen af ​​HO -1 (figur 7). Vi undersøgte yderligere, om forbindelser 3 og 4 regulerer aktiveringen af ​​Nrf2. Translokationen af ​​Nrf2 til kernen blev øget på en tidsafhængig måde, hvilket indikerer, at forbindelser 3 og 4 signifikant opregulerede Nrf2/HO-1-vejen i BV2- og RAW264.7-celler (figur 8).

ffects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 μM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B and D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group. Figure 7. Effects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 µM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B,D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group.

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

For yderligere at undersøge, om de anti-neuroinflammatoriske og antiinflammatoriske virkninger af forbindelser 3 og 4 er korreleret med HO-1-ekspression i BV2- og RAW264.7-celler, udførte vi et sæt eksperimenter med tinprotoporphyrin-IX(SNPP) som er en selektiv aktivitetshæmmer af HO-1. Ved at bruge SNPP, som kan nedregulere ekspressionen af ​​HO-1, forsøgte vi at bestemme, om HO-1 medierer den hæmmende effekt af ovenstående forbindelser på det inflammatoriske respons induceret af LPS 【31】. Efter behandling af cellerne med 20 μM af forbindelser 3 og 4 i 2 timer med eller uden 50 uM SNPP blev de behandlet med LPS i 24 timer. Selvom forbindelser 3 og 4 reducerede nitritproduktion i LPS-inducerede BV2- og RAW264.7-celler, blev deres antiinflammatoriske virkninger vendt ved SNPP-behandling (figur 9). SNPP alene påvirkede ikke produktionen af ​​nitrogenoxid (NO) efter LPS-stimulering, hvilket tyder på, at de antiinflammatoriske virkninger af forbindelser 3 og 4 er reguleret af HO-1-ekspression.

image

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on nitrite production through the regulation of HO-1 activity in BV2 (A,C,E) and RAW264.7 (B,D,F) cells. The cells were treated with 50 µM of tin protoporphyrin-IX (SnPP) or compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. ** p < 0.01 and *** p < 0.001

3. Diskussion

Den nuværende undersøgelse viste, at Kuwana T og sanggenon A udøver undertrykt LPS-induceret inflammation i BV2- og RAW264.7-celler. Disse forbindelser hæmmede den LPS-inducerede produktion af NO, PGE2 og pro-inflammatoriske cytokiner, herunder IL-6 og TNF-, og ekspressionen af ​​iNOS og COX-2 i både BV2- og RAW264.7-celler. Disse resultater indikerede, at Kuwana T og sanggenon A udøvede deres antiinflammatoriske virkninger ved at inaktivere NF-kB-signalvejen. Derudover inducerede disse forbindelser ekspressionen af ​​HO-1 gennem aktiveringen af ​​Nrf2. Derudover inducerede disse forbindelser ekspressionen af ​​HO-1 via Nrf2-aktivering, og denne effekt blev også bekræftet at være relateret til den antiinflammatoriske aktivitet.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), og thromboxan A2(TXA,)[361. Under inflammatoriske tilstande stiger niveauerne af iNOS og COX-2, hvilket resulterer i overproduktion af henholdsvis NO og PGE2 og fører til forværring af inflammatoriske lidelser [37]. I denne undersøgelse evaluerede vi først 11 forbindelser isoleret fra M.alba for at bestemme, om NO-produktion er hæmmet i LPS-stimulerede BV2- og RAW264.7-celler. Vores resultater viste, at kuwanon T og sanggenon A udøvede de stærkeste hæmmende virkninger i både BV2- og RAW264.7-celler (figur 3). I vores tidligere undersøgelse havde moracin M en anti-inflammatorisk effekt på alveolære makrofager, men vores resultater viste en anden mønster. Men da hver celle har forskellige karakteristika, kan forskellige aktiviteter forekomme selv med den samme mekanisme J38]. Derfor, som i resultaterne af dette papir, blev det bekræftet, at moracin M ikke havde nogen anti-inflammatorisk aktivitet i BV2- og RAW264.7-celler op til behandlingskoncentrationen. Derfor blev kuwanon T og sanggenon A udvalgt til yderligere eksperimenter.

Cytokiner har en kompleks regulatorisk indflydelse på inflammatoriske og immunresponser [39]. Aktivering af makrofager og mikrogliaceller øger sekretionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner J40, og denne øgede sekretion fører til yderligere cytokinfrigivelse [41]. IL-6 er et af de vigtigste cytokiner og er en opløselig mediator, der er ansvarlig for inflammation, immunrespons og hæmatopoiesis [42]. IL-6-signalering reguleres gennem to forskellige mekanismer, herunder binding til den membranbundne IL-6-receptor (mblL6R) og genkendelse af den opløselige IL-6-receptor (sIL6R)[43]. Begge mekanismer er forbundet med glycoprotein (GP)130-aktivering, hvilket resulterer i aktivering af downstream-signalmolekyler, herunder Janus-kinase (IAK)/signaltransducer og aktivator af transkription (STAT)-kinaser, phosphoinositide 3--kinase (PI3K) ), og mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK)[44]. IL-6 bruges til at forudsige og evaluere inflammationsniveauer hos patienter med cancer, infektion, autoimmune sygdomme, bugspytkirtelsygdomme og hjerte-kar-sygdomme.

TNF-, et andet vigtigt cytokin, spiller også en vigtig rolle i mange immun- og inflammatoriske processer, såsom immuncelleproliferation, apoptose, nekrose og overlevelse. De biologiske virkninger af TNF- reguleres ved binding til to forskellige receptorer, tumornekrosefaktorreceptor (TNFR)1 og TNFR2. TNFR1 er den vigtigste mediator for TNF-aktivitet i de fleste celler, fordi TNFR2 har mindre bindingsaffinitet for TNF-, hvilket resulterer i, at TNF- dissocieres lettere fra TNFR2 end fra TNFR1. Abnormiteter i TNF-signalering og overproduktion af TNF- fører til udviklingen af ​​mange sygdomme, herunder reumatoid arthritis, psoriasis, Crohns sygdom, åreforkalkning, sepsis, diabetes og fedme [45,46. Derfor er det vigtigt at hæmme produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner for at undertrykke og forhindre inflammatoriske reaktioner og udvikling af inflammatoriske sygdomme. I denne undersøgelse hæmmede kuwanon T og sanggenon A den LPS-inducerede produktion af IL-6 og TNF- i både BV2- og RAW264.7-celler.

NF-KB er den mest allestedsnærværende transkriptionsfaktor[47], og NF-kB-signalering spiller en vigtig rolle i ekspressionen af ​​gener relateret til inflammatoriske responser, herunder dem der koder for iNOS, COX-2 og pro-inflammatoriske cytokiner [ 48]. I den inaktiverede tilstand eksisterer NF-kB-underenheder i cytoplasmaet bundet til dets inhibitorprotein, inhibitor kappa B (kB)-. Adskillige stimuli, herunder LPS og cytokiner, inducerer phosphoryleringen og nedbrydningen af ​​IkB-, hvilket tillader frigørelse og translokation af NF-kB-underenheder ind i kernen. De translokerede underenheder binder til kB-steder af målgener i DNA, hvilket resulterer i induktion af transkription af gener, der koder for pro-inflammatoriske mediatorer [49]. Derfor kan inaktiveringen af ​​NF-kB-vejen være et terapeutisk mål for inflammatoriske sygdomme. I denne undersøgelse hæmmede forbehandling med kuwanon T og sanggenon A den LPS-inducerede aktivering af NF-kB-signalering ved at hæmme den DNA-bindende aktivitet og nuklear translokation af NF-kB-underenheder (figur 6). Disse resultater tyder på, at de antiinflammatoriske virkninger af kuwanon T og sanggenon A udøves via regulering af NF-kB-signalvejen.

Under normale forhold binder Nrf2 til Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 (Keap1) i cytoplasmaet. Det dissocierer imidlertid fra Keapl, translokerer ind i kernen og binder til antioxidantresponselement(ARE)-steder på DNA'et, hvilket fører til ekspression af forskellige antioxidantgener, herunder dem der koder for HO-1, NAD(P)H : quinonoxidoreduktase 1(NQO1), peroxiredoxin (Prx) og thioredoxin (Trx)[50]. Især er HO-1 kendt for at være forbundet med antiinflammatoriske virkninger, og dets aktivitet er repræsenteret ved niveauerne af CO, et af de tre biprodukter, der genereres fra hæm af den enzymatiske aktivitet af HO{{12 }} [51]. I denne undersøgelse fandt vi, at kuwanon T og sanggenon A-inducerede HO-1-ekspression ved at aktivere Nrf2 (figur 7 og 8). Derudover verificerede vi sammenhængen mellem den antiinflammatoriske virkning af kuwanon T og sanggenon A og HO-1-ekspression ved hjælp af SNPP, en selektiv hæmmer af HO-1-aktivitet. De hæmmende virkninger af kuwanon T og sanggenon A på NO- og TNF-produktion og NF-kB-aktivering blev delvist vendt ved samtidig behandling med SNPP (figur 9). Disse resultater tyder på, at de antiinflammatoriske virkninger af kuwanon T og sanggenon A reguleres af HO-1-ekspression.

effects of cistanche improve immunity (11)

4. Materialer og metoder

4.1. Materialer

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) og føtalt bovint serum blev købt fra Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA). Alle kemikalier blev opnået fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). De primære antistoffer anti-iNOS, anti- -actin, anti-p65 og anti-HO-1 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); og anti-kanin og anti-mus sekundære antistoffer fra Millipore

(Billerica, MA, USA). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kits for PGE,, IL-6 og TNF- blev købt fra R&DSystems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Isoleringen og den strukturelle bestemmelse af de 11 forbindelser fra Morus alba er blevet beskrevet andetsteds [19-21].

4.2. Cellekultur og levedygtighedsassays

BV2- og RAW264.7-celler blev podet med en tæthed på 5 x 105 celler/ml i RPMI 1640 suppleret med 1 procent antibiotika (penicillin-streptomycin) og 10 procent varme-inaktiveret FBS. Cellerne blev dyrket ved 37 grader i en befugtet 5 procent CO, med en 95 procent luft atmosfære, ifølge en tidligere beskrevet metode [52].

4.3. Måling af NO-produktion

Produktionen af ​​nitrit, et stabilt slutprodukt af NO-oxidation, blev målt som en indikator for NO-produktion i celler. Kort fortalt blev koncentrationen af ​​nitrit i de konditionerede medier bestemt ved hjælp af en metode baseret på Griess-reaktionen [53]. Detaljerne i assayet er blevet beskrevet tidligere [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

Koncentrationen af ​​PGEz i hver prøve blev målt ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt ELISA-kit ifølge en tidligere beskrevet metode [55].

4.5. Måling af IL-6 og TNF-a niveauer

Kulturmediet blev opsamlet for at bestemme niveauerne af IL-6 og TNF- ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (BioLegend, San Diego, CA, USA). Assayet blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner. Kort fortalt blev BV2- og RAW264.7-celler podet i 24-brøndkulturplader ved en tæthed på 20 x 10 celler/brønd. Efter inkubation blev supernatanten opsamlet og brugt til at måle koncentrationerne af IL-6 og TNF- med ELISA-kits.

4.6. Western Blot Analyse

De pelleterede BV2- og RAW264.7-celler blev vasket med PBS og lyseret i RIPA-buffer. Lige mængder af proteiner blev kvantificeret under anvendelse af proteinanalysefarvestofreagenskoncentrat opnået fra Bio-Rad Laboratories (#5000006; Hercules, CA, USA), blandet i prøvepåfyldningsbufferen og adskilt ved brug af SDS-PAGE. De adskilte proteiner blev derefter overført til en nitrocellulosemembran. Ikke-specifik binding til membranen blev blokeret ved inkubation i en opløsning af skummetmælk. Membranen blev inkuberet med primære antistoffer (som alle blev brugt ved en 1:1000) ved 4 grader natten over og derefter reageret med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (som alle blev brugt ved en 1:5000) (Millipore) [ 31].

4.7.NF-xB lokalisering og immunfluorescensanalyse

For at studere lokaliseringen af ​​NF-kB blev BV2- og RAW264.7-celler dyrket på Lab-Tek II-kammerglas og behandlet med forskellige koncentrationer af forbindelser i 2 timer før LPS-stimulering (0,5 ug/mL) i 1 h. Cellerne blev derefter fikseret i formalin og permeabiliseret med kold acetone og probet med anti-p65-antistoffer (1:200), efterfulgt af inkubation med et fluorescein-isothiocyanat-mærket sekundært antistof (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). For at visualisere kerner blev celler behandlet med 1 ug/mL 4'6-diamidino-2-phenylindol (DAPI i 30 minutter, vasket med PBS i 5 minutter og behandlet med 50 μL VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Farvede celler blev visualiseret, og billeder blev erhvervet ved hjælp af et Zeiss fluorescensmikroskop (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan). [31].

4.8. Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter. En-vejs variansanalyse, efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest, blev brugt til at sammenligne forskelle mellem de tre grupper. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-softwaren (version 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA),

5. Konklusioner

Kuwanon T og sanggenon A udøvede antiinflammatoriske virkninger i LPS-inducerede BV2- og RAW264.7-celler ved at hæmme produktionen af ​​NO, PGE2, IL-6 og TNF- og ekspressionen af ​​iNOS og COX{{8} }. Vores resultater viste, at disse hæmmende virkninger blev medieret via inaktivering af NF-KB-vejen ved behandling med kuwanon T og sanggenon A. Derudover inducerede disse forbindelser ekspressionen af ​​HO-1 ved at aktivere translokationen af ​​Nrf2 ind i kernen . Vores resultater viste, at HO-1-ekspressionen induceret af kuwanon T og sanggenon A var forbundet med de undertrykkende virkninger mod LPS-induceret inflammation. Tilsammen giver vores resultater bevis for, at Kuwana T og sanggenon A isoleret fra M. Albu kunne være kandidater til udvikling af terapeutiske og forebyggende midler mod neuroinflammatoriske sygdomme såsom Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom.


Du kan også lide