Hvordan man bruger nyre-tonificerende formel til at beskytte oxidativ skade på MES23.5-celler?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yihui Xu,¹Wei Lin,²Shuifen Ye,³Huajin Wang,⁴Tingting Wang,⁵Youyan Su, ⁵Liangning Wu,⁶Yuanwang Wang,⁷Qian Xu,⁵Chuanshan Xu,⁸og Jing Cai 5, *

Abstrakt

Oxidativ skadespiller en afgørende rolle i ætiologien af ​​neurodegenerative lidelser, herunder Parkinsons sygdom (PD). I vores undersøgelse, en gammel kinesernyre-tonificerendeformel, som består af Cistanche, Epimedii og Polygonatum cirrhifolium, blev undersøgt for at beskytte MES23.5 dopaminerge neuroner mod hydrogenperoxid- (H2O2-) induceretoxidativ skade. Skadevirkningerne af H2O2 påMES23.5 cellerog de beskyttende virkninger af KTF modoxidativstress blev evalueret ved hjælp af MTT-assay, transmissionselektronmikroskopi (TEM), immuncytokemi (ICC), enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) og immunoblotting. Resultaterne viste, at cellernes levedygtighed blev dramatisk reduceret efter 12 timers eksponering for 150 μM H2O2. TEM-observation fandt, at H2O2-behandletMES23.5 cellerpræsenteret cellulær organelskade. Men når celler blev inkuberet med KTF (3,125, 6,25 og 12,5 ug/ml) i 24 timer efter H2O2-eksponering, blev der observeret en signifikant beskyttende effekt mod H2O2-induceret skade iMES23.5 celler. Ved hjælp af ICC fandt vi ud af, at KTF hæmmede reduktionen af ​​tyrosinhydroxylasen (TH) induceret af H2O2, opregulerede mRNA- og proteinekspressionen af ​​HO-1, CAT og GPx-1 og nedregulerede ekspressionen af caspase 3. Disse resultater indikerede, at KTF kan give neuronbeskyttelse mod H2O2-induceret celleskade gennem forbedringoxidativstress, og vores resultater giver en ny potentiel strategi til forebyggelse og behandling af Parkinsons sygdom.

CISTANCHE FORDELE:behandling af Parkinsons sygdom

1. Introduktion

Neurodegenerative sygdomme er for nylig blevet et vigtigt folkesundhedsproblem. Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ sygdom karakteriseret ved det progressive tab af dopaminerge neuroner i substantia nigra. Selvom årsagen til PD stadig mangler at blive klarlagt, tyder flere beviser stærkt på detoxidativ skadeog mitokondriel dysfunktion spiller en vigtig rolle i de patologiske mekanismer af PD [1-3]. Øgetoxidativstress skyldes en ubalance mellemoxidativprodukter såsom reaktive oxygenarter (ROS) og antioxidantmolekyler i cellen [4]. Forbedring af den antioxidative kapacitet i hjerneceller er blevet en effektiv strategi til at beskytte nerveceller mod oxidative stressskader.

PD er en svær at behandle sygdom, der truer ældre på verdensplan. De nuværende terapeutiske lægemidler har begrænset effekt med alvorlige bivirkninger. Traditionelle kinesiske urter og formler har været meget brugt i folkemedicin til behandling af neurodegenerative sygdomme, herunder PD i lang tid. Ifølge kinesisk medicin teori, mangel pånyreer den vigtigste patologiske mekanisme ved PD. Cistanche deserticola YC Ma, en art af Cistanche, der tilhører familien Orobanchaceae, er en velkendt urt i traditionel kinesisk medicin med såkaldtenyre-tonificerendeeffekt og bruges til behandling afnyremangel, kvindelig infertilitet, sygelig leukorré, neurasteni og senil obstipation [5]. Det er blevet rapporteret, at Cistanche totale glycosider udøvede beskyttende virkninger på substantia nigra dopaminerge neuroner i musemodeller og celler af PD [6, 7]. Desuden er de aktive ingredienser i Cistanche blevet dokumenteret at have en neurobeskyttende effekt ved at øge antioxidantkapaciteten og hæmme apoptose af neuroner [8-15]. Herba Epimedii er også en traditionelnyre-tonificerendeKinesisk urt med betydelig antioxidativ aktivitet, som i vid udstrækning anvendes til behandling af osteoporose og hjerte-kar-sygdomme og til forbedring af seksuelle og neurologiske funktioner [16]. Polygonatum sibiricum er ofte ansat som en assistent til at forbedre effektiviteten af ​​monark-lægemidlet og minister-lægemidlet i den traditionelle kinesiske formel. En nylig rapport viste, at vandekstrakterne af Polygonatum sibiricum er naturlige antioxidanter.

Baseret på disse fordele fra den gamle kinesiskenyre-tonificerendeformel (KTF), som består af Cistanche, Epimedii og Polygonatum cirrhifolium, antog vi, at KTF kunne beskytte MES23.5 dopaminerge neuroner mod hydrogenperoxid- (H2O2-) induceretoxidativ skade. Heri udførte vi som et proof-of-concept en række eksperimenter for at undersøge virkningerne af KTF på celledød og ekspression af antioxidantenzymer i det H2O2-behandledeMES23.5 celler.

Nyre-tonificerende formel kan beskytte oxidativ skade på MES23.5-celler

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier og reagenser

HO-1, CAT, caspase 3 og -actin antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology Inc. (Boston, USA). GPx-1-antistof var fra Abcam (Cambridge Science Park, UK). Kanin Anti-Tyrosine Hydroxylase var fra Boster (BA1454, Kina). Gede-anti-kanin IgG1 konjugeret til et peberrodsperoxidasemærke var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Californien, USA). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) blev købt fra GIBCO BRL Co. Ltd. (Gaithersburg, MD, USA). Alle de andre reagenser, medmindre andet er angivet, var fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit var fra Fermentas Inc. (Burlington, USA). DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) var fra Fermentas Inc. (Burlington, USA). Bio DL100 var fra BioFlux (Tokyo, Japan). Polink-2 plus Polymer HRP-detektionssystem for kanin-primært antistof (PV-9001) og DAB (3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid) (ZLI-9032) var fra ZSGB-BIO (Beijing, Kina). ELISA-sæt til måling af CAT, GPx-1 og GSH var fra Hufeng Biotechnology Inc. (Shanghai, Kina). Ginkgo biloba-ekstrakter (GE) var fra Shanghai Sine Promod Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, Kina).

2.2. Forberedelse og standardisering af nyreforstærkende formel

Komponenterne inyre-tonificerendeformel, Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum og Polygonatum sibiricum, blev leveret af Second Affiliated People's Hospital, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, og omhyggeligt autentificeret i henhold til den kinesiske farmakopé (The Pharmacopoeia Commission of China, 2005). For at forberede KTF-prøver blev Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum og Polygonatum sibiricum i vægtforholdet 1 : 1 : 1,2 blandet og malet i pulveret og derefter nedsænket i et samlet volumen på 10 gange (w/v) destilleret vand i 1 h og kogt i 2 timer. Efter at opløsningen var filtreret, blev filtratet opsamlet. Hele resten blev opsamlet og yderligere kogt med et samlet volumen på 8 gange (vægt/volumen) destilleret vand i 2 timer. Opløsningen blev filtreret, og de to filtrater blev kombineret, koncentreret og frysetørret. Udbyttet af den endelige tørrede ekstrakt var 25 procent (vægt/vægt) af udgangsråmaterialerne og blev opbevaret ved -20 grader indtil brug. Stamopløsningen KTF (10 mg/ml) blev fremstillet ved at opløse KTF i phosphatpufferopløsning (PBS), efterfulgt af sonikering, sterilisering ved 100 grader og filtrering.

2.3. Cellekultur og H2O2-behandling

MES23.5 cellerblev dyrket og udsat for H2O2 som beskrevet i vores tidligere papir [10]. Kort,MES23.5 cellerblev dyrket i DMEM/F12 (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, USA) medium indeholdende 5 procent (vol/vol) FBS (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, USA), 1{{12} }0 U penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) og Sato's (50 × Sato'er: insulin 25 mg; overførsel af 25 mg; pyrodruesyre, 243 mg; putrescin 20 mg; 1 mg/ml natriumselenat, 25 ul; 0,315 mg/ml progesteron) ved 37 grader med 5 procent CO2. Overnight voksetMES23.5 cellerblev yderligere inkuberet med 150 μM H2O2 i 12 timer.

2.4. KTF behandling

MES23.5 cellerblev tilfældigt opdelt i kontrolgruppe (frisk kulturmedium), H2O2-gruppe (H2O2-dyrkningsmedium), Ginkgo biloba-ekstrakt (GE)-gruppe (H2O2 og GE-dyrkningsmedium), og KTF-grupper inklusive den lave dosis af KTF-behandling, en mellemdosis på FTF-behandling, og høj dosis KTF-behandling.MES23.5 celleri den logaritmiske fase blev podet i en kulturplade belagt med poly-L-lysin (PLL) i 24 timer. Cellerne i kontrolgruppen blev behandlet med det friske dyrkningsmedium, og cellerne i alle andre grupper blev behandlet med dyrkningsmediet indeholdende 150 μM H2O2 i 12 timer. Cellerne i GE-gruppen blev behandlet med dyrkningsmediet indeholdende 12,5 ug/ml GE, og cellerne i lavdosis KTF-gruppen, middeldosis KTF-gruppen og højdosis KTF-gruppen blev behandlet med KTF i koncentrationerne 3,125, 6,25, og 12,5 ug/ml i henholdsvis 24 timer.

2.5. Cellelevedygtighed

Efter KTF-behandling i 20 timer blev cellerne inkuberet med MTT (0,5 mg/ml) i 4 timer ved 37 grader, og mediet blev forsigtigt fjernet, og 150 μL DMSO blev tilsat til hver brønd. Formazan-krystallerne blev opløst i 10 minutter, og absorbansen blev målt ved 490 nm. Den optiske densitet (OD) af hver brønd blev målt med spektrofotometer (BIO-TEK ELX 800, BioTek Instruments Inc., Vermont, USA). Frisk cellekulturmedium blev anvendt som en negativ kontrol.

Nyre-tonificerende formel kan beskytte oxidativ skade på MES23.5-celler

2.6. Observation af ultrastrukturel morfologi

Efter KTF-behandling i 24 timer blev cellerne opsamlet, suspenderet og fikseret med 3 procent glutaraldehyd i 1,5 procent paraformaldehydopløsning (pH 7,3) ved 4 grader i 24 timer. Cellesuspensioner blev derefter skyllet to gange med PBS og efterfikseret med 1 procent osmisk syre og 1,5 procent kaliumhexacyanoferrat (II) opløsning (pH 7,3) og inkuberet ved 4 grader i 2 timer; derefter blev cellesuspensioner dehydreret i en gradueret serie af alkohol i 5 minutter hver. De dehydrerede pellets blev indlejret tre gange med propylenoxid i 1 time og infiltreret med en harpiks/propylenoxidblanding i forholdet 1:1 i 2 timer og derefter med harpiks i 12 timer ved stuetemperatur. Inkluderingen blev lavet med epoxyharpiks 618 og Araldite, og polymerisation blev udført ved 60 grader i 48 timer. Til sidst blev ultratynde snit (80 nm) farvet med uranylacetat og modfarvet med blycitrat i 5 min. De farvede celler blev undersøgt med H7650 transmissionselektronmikroskop (Hitachi, Japan).

2.7. Immuncytokemisk analyse af tyrosinhydroxylase (TH)

Efter KTF-behandling i 24 timer blev cellerne vasket to gange i 2 minutter med PBS og fikseret med 4 procent paraformaldehyd i 15 minutter. De fikserede celler blev vasket 3 gange og derefter behandlet med 0,5 procent Triton X-100 i 20 min. Bagefter blev cellerne vasket 3 gange og behandlet med 3 procent H2O2 i 10 min. De H2O2--behandlede celler blev vasket 3 gange og derefter blottet med gedeserum i 20 min. Efter at være blevet blottet, blev kanin-anti-TH (1:400) tilsat til hver prøve ved 4 grader natten over. Prøverne blev derefter vasket 3 gange og behandlet med Polymer Helper i 20 min. Efter polymerbehandling blev cellerne vasket 3 gange og behandlet med poly-HRP anti-kanin IgG i 20 min. Cellerne blev vasket 3 gange og behandlet med DAB i 3 min. Til sidst blev prøverne vasket med rindende vand og behandlet med hæmatoxylin-modfarvning i 1 min og derefter vasket med rindende vand og forseglet med overordnet monteringsmedium.

2.8. Måling af antioxidative enzymer ved ELISA

Efter KTF-behandling i 24 timer blev aktivitetsniveauet for intracellulær CAT, GPx-1 og GSH målt ved hjælp af et ELISA-kit (Hufeng Biotechnology Inc., Shanghai, Kina) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev 100 μL homogenat supernatant af lysatet af de behandlede celler tilsat til ELISA-brøndene og derefter inkuberet ved 37 grader i 30 minutter. Efter at være blevet vasket fem gange og tørret, blev 50 μL enzymmærket antistofarbejdsopløsning tilsat til hver brønd (forventet kontrolrør). Den resulterende opløsning blev inkuberet i 30 minutter ved 37 grader og vasket fem gange og tørret. Substratarbejdsopløsning (150 μL) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 15 minutter ved 37 grader. Til sidst blev en stopopløsning (50 μL) tilsat til hver brønd, og absorbansværdien blev bestemt ved 450 nm ved hjælp af en automatisk ELISA-læser (XL800, BioTex, Incorporated, Houston, TX, USA).

2.9. Western Blot Analyse

Efter KTF-behandling i 24 timer blev cellerne vasket med iskold PBS, og proteiner blev ekstraheret i en lyseringsbuffer indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 procent Nonidet P{{ 9}}, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 10 ug/ml aprotinin. Proteinkoncentration blev bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois, USA). Protein blev separeret ved SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blokering blev udført med 5 procent fedtfri tørret mælk; membranen blev inkuberet med kanin anti-rotte HO-1, CAT, caspase 3, -actin antistof (1: 1000, cellesignalering) og kanin anti-rotte GPx-1 antistof (1: 1000) , Abcam) natten over ved 4 grader. Den behandlede membran blev vasket og derefter udsat for gede-anti-kanin IgG1 konjugeret til et peberrodsperoxidasemærke (1:5000, Santa Cruz, USA) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter yderligere fem vaske blev krydsreaktivitet visualiseret ved hjælp af Electrochemiluminescence (ECL) Western blotting-detektionsreagenser og analyseret ved hjælp af scanning densitometri i et billedsystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.10. RT-PCR-analyse

PCR-primere af HO-1, CAT, GPx-1 og -actin blev købt fra Sangon Biotech Co. Ltd. (Shanghai, Kina). Efter KTF-behandling i 24 timer blev total-RNA fra celler isoleret ved hjælp af Trizol-reagens i henhold til producentens anvisninger. Revers transkription (RT) blev udført under anvendelse af AMV revers transkriptionssystem (Fermentas, Burlington, USA). cDNA-fragment og -actin blev amplificeret under anvendelse af Green PCR master MIX Kit (Fermentas, Burlington, USA). DNA blev amplificeret øjeblikkeligt med en enkelt cyklus ved 94 grader i 5 minutter og 30 cyklusser ved 94 grader i 30 sekunder og 58 grader i 30 sekunder og 72 grader i 30 sekunder for -actin, og et sidste forlængelsestrin blev taget ved 72 grader for 10 min. Ethidiumbromid-farvede geler blev scannet og kvalificeret ved hjælp af Tanon Image Software. Intensiteten af ​​hvert bånd blev normaliseret mod intensiteten af ​​-actin.

2.11. Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Alle data blev vist som middelværdi ± SD (standardafvigelse), og statistisk signifikans af forskel blev udført ved envejs ANOVA og LSD (lineær standardafvigelse). En forskel blev anset for at være signifikant ved P <>

Nyre-tonificerende formel kan beskytte oxidativ skade på MES23.5-celler

3. Resultater

3.1. Skadevirkningerne af H2O2 på MES23.5-celler og de beskyttende virkninger af KTF mod oxidativ stress

Som vist i figur 1(a) udviste H2O2 en dosis- og tidsafhængig hæmning i levedygtigheden af ​​MES23.5 dopaminerge neuronale celler. Efter 12 timers eksponering for 50 μM H2O2 blev et signifikant tab af cellelevedygtighed noteret, og cellelevedygtighedstabet steg gradvist med H2O2-dosis stigende til 150 μM. Imidlertid resulterede yderligere forøgelse af H2O2-dosis fra 200 til 500 μM ikke i signifikant højere tab af cellelevedygtighed. UdvidelseMES23.5 cellereksponering for H2O2 fra 12 timer til 24 timer og 48 timer øgede tabet af cellelevedygtighed ved lavere H2O2-koncentrationer. Et signifikant tab af MES23.5-cellelevedygtighed blev bemærket efter 24 timers eksponering for 25 μM H2O2 og 48 timers eksponering for 12,5 μM H2O2. En tidsafhængig måde for tab af cellelevedygtighed blev observeret i alle testede koncentrationer af H2O2.

Figur 1 Skadevirkningerne af H2O2 påMES23.5 cellerog de beskyttende virkninger af KTF modoxidativstress blev evalueret ved hjælp af MTT-assay. (a) Virkninger af forskellige koncentrationer af H2O2-behandling på celleskade. MES23.5-celler blev behandlet med 12,5, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400 og 500 μMol/L H2O2 i 12, 24 og 48 timer. (b) Beskyttende virkninger af forskellige koncentrationer af KTF-behandling på H2O2-induceret celleskade. Behandling af KTF resulterede i en stigning i MES23.5-cellernes levedygtighed efter H2O2-tilsætning.MES23.5 cellerblev inkuberet med GE (12,5 ug/ml) eller KTF (3,125, 6,25, 12,5 ug/ml) i 24 timer efter tilsætning af H2O2. Cellelevedygtigheden blev målt med MTT. Data er udtrykt som middel ± SD (standardafvigelse) i tre uafhængige eksperimenter. #P < 0.05="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen.="" ∗p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="">

EksponeringMES23.5 cellertil KTF alene havde ikke en signifikant cytotoksisk effekt, selv når KTF-koncentrationen var op til 100 ug/ml. MES23.5 celler co-dyrket med 150 μM H2O2 i 12 timer forårsagede cellelevedygtighed tab på 46,76 procent. Den cytotoksiske virkning af H2O2 på MES23.5-celler blev signifikant svækket ved KTF-behandling i 24 timer (figur 1(b)). Øget levedygtighed af H2O2-behandletMES23.5 cellerblev genoprettet til 95.86 procent ± 7,18 procent, 96,49 procent ± 15,07 procent og 99,04 procent ± 10,57 procent ved behandling med KTF i koncentrationer på henholdsvis 3,125, 6,25 og 12,5 ug/ml.

TEM viste, at normale celler i kontrolgruppen udviste oval form med intakt cellemembran, som har mange korrugeringer og mikrovilli-lignende strukturer. Cellekernen var elliptisk i midten med en enkelt nukleolus og havde normalt euchromatin og spredt heterochromatin. Mitokondrier udviste stavlignende eller elliptiske, spredte og med normale cristae mitokondrier. Det ru endoplasmatiske retikulum var veludviklet og havde ingen tydelig degranulering (figur 2(a)). Imidlertid præsenterede cellerne behandlet med H2O2 typiskeoxidativ skademed mindre, uregelmæssige kerner og svulmede mitokondrier. Tydelig degranulering blev fundet i det ru endoplasmatiske retikulum (figur 2(b)). I cellerne behandlet med KTF forbedret H2O2-induceretoxidativ skade, mitokondrier udviste stavlignende eller elliptiske, spredte og med flere cristae mitokondrielle. Det ru endoplasmatiske retikulum havde ingen tydelig degranulering (figur 2(d), 2(e) og 2(f)).

Figur 2 Effekt af KTF på cellulær ultrastruktur i H2O 2-induceretMES23.5 celler. Cellulær ultrastruktur blev observeret under TEM. Normal morfologi af cytoplasma, celleorganeller i kontrolgruppe ((a), ×15,000), karakteristisk ultrastrukturel morfologi foroxidativ skadei H2O2-behandlet gruppe ((b), ×15,000), behandling med KTF-gruppe (henholdsvis 3,125, 6,25 og 12,5 ug/ml) ((d), (e), (f), ×15,000) eller Ginkgo-ekstrakt (12,5 ug/ml) ((c), ×15,000).

3.2. Stigende ekspression af TH i MES23.5-celler efter KTF-behandling

TH er et kritisk katalyserende enzym i omdannelsen af ​​aminosyren L-tyrosin til L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), som er forstadiet til neurotransmitterne dopamin. Den normale ekspression af TH er mærket af de aktive neuroner. Derfor sammenlignede vi TH-udtrykket i det H2O2-inkuberedeMES23.5 cellermed eller uden efter KTF-behandling med immunhistokemi. Resultatet viste, at H2O2 reducerede TH-ekspression i MES23.5-cellerne, og efter KTF-behandling kunne TH-ekspression forbedres betydeligt (figur 3). Dette indikerer, at KTF-behandling var i stand til at genoprette funktionen af ​​de H2O2-behandlede MES23.5-celler.

Figur 3 KTF-forbedret H2O2-induceret reduktion af TH iMES23.5 celler. Celler blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd, og ekspressionen af ​​TH blev påvist ved immuncytokemi. (a) Tan repræsenterer det positive TH-udtryk (×400). (b) Negativ kontrol. (c) Resultater er udtrykt som en gennemsnitlig grå grad. Data er middelværdi ± SD i tre uafhængige eksperimenter. #P < 0,05="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen.="" ∗p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="">

3.3. KTF-undertrykt H2O2-induceret Caspase 3-aktivering i MES23.5-celler

For yderligere at undersøge mekanismen for MES23.5-cellebeskadigelse evaluerede vi ekspressionen af ​​proapoptosefaktor caspase 3 ved immunblotting. Resultatet viste, at H2O2-behandling markant nedregulerede ekspressionen af ​​procaspase 3 og opregulerede ekspressionen af ​​caspase 3. I modsætning hertil genoprettede KTF-behandlingen procaspase 3 og caspase 3 balancen ved at øge ekspressionen af ​​procaspase 3 og mindske ekspressionen af ​​caspase 3 (Figur 4) ). Disse resultater viser, at KTF-behandling effektivt hæmmede caspase 3-aktiveringer.

Figur 4 Effekt af KTF på proteinekspressionen af ​​caspase 3 i H2O2-induceretMES23.5 celler. (a) Proteinekspressionen af ​​caspase 3 blev bestemt med western blot og kvantificeret i (b). Data er udtrykt som middel ± SD i tre uafhængige eksperimenter. #P < 0.05="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen.="" ∗p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="" den="" h2o2="" -behandlede="">

3.4. Øget ekspression af antioxidative enzymer i MES23.5-celler ved KTF-behandling

ELISA-assay afslørede, at intracellulær CAT, GPx-1 og GSH blev nedreguleret efter 150 μM H2O2-behandling i MES23.5-celler. Bemærk, efter behandling af KTF genoprettede intracellulær CAT, GPx-1 og GSH-ekspression. RT-PCR-analyse viste, at H2O2-behandling nedregulerede CAT- og GPx-1-mRNA-ekspression; KTF-behandling genoprettede imidlertid ekspressionerne af CAT og GPx-1 mRNA iMES23.5 celler. Immunoblot med specifikke antistoffer bekræftede også, at CAT- og GPx-1-proteinekspression iMES23.5 cellerblev nedreguleret af H2O2-behandling, og KTF-behandling var i stand til at genoprette CAT- og GPx-1-proteinekspression. Desuden mRNA-ekspression afoxidativstress reagerende protein HO-1 blev også hæmmet efter H2O2-behandling og blev derefter genoprettet ved at følge KTF-behandling. Immunblotting viste også, at HO-1-proteinekspression var markant nedreguleret af H2O2, men KTF-behandling var i stand til at genoprette HO-1-proteinekspression. Som forventet har den højeste KTF-koncentration, der er brugt i vores undersøgelse, den bedste effekt på gendannelse af CAT-, GPx-1-, GSH- og HO-1-udtryk (figurerne (figur 55 og og 6).6). Tilsammen viser de opnåede resultater, at KTF-behandling signifikant opregulerede antioxidantsubstrater i de H2O2-behandlede MES23.3-celler.

Figur 5 Effekt af KTF på niveauet af intracellulær CAT, GPx-1 og GSH i H2O2-induceretMES23.5 celler. Aktivitetsniveauet for intracellulær CAT, GPx{{0}} og GSH blev målt ved hjælp af et ELISA-kit. Data er udtrykt som middel ± SD i tre uafhængige eksperimenter. #P < 0.05="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen.="" ∗p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="">

Figur 6 KTF øgede protein- og mRNA-ekspressionen af ​​antioxidantenzymer i H2O2-induceretMES23.5 celler. (a) Proteinekspressionerne af HO{{0}}, CAT og GPx-1 blev bestemt med Western blot og kvantificeret i (c). (b) mRNA-ekspressionerne af HO-1, CAT og GPx-1 blev bestemt med RT-PCR og kvantificeret i (d). Data er udtrykt som middel ± SD i tre uafhængige eksperimenter. #P < 0.05="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen.="" ∗p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="">

4. Diskussion

Som en vigtig komponent i redoxsystemet spiller ROS en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellefunktionen. Moderate niveauer af ROS kan fungere som signaler til at fremme celleproliferation og overlevelse. Under fysiologiske forhold opretholder balancen mellem generering og eliminering af ROS den korrekte funktion af det redoxfølsomme signalsystem. Redox-homeostase kan forstyrres af en stigning i ROS-produktion eller et fald i ROS-opfangningskapacitet, hvilket fører til en samlet stigning ioxidativstress [17, 18], hvilket efterfølgende forårsager irreversibel skade på intracellulær struktur og inducerer celledød.

Højt forbrug af O2 i hjernen fører til ophobning af ROS; således er neuroner særligt sårbare over for angreb afoxidativstress. Postmortem undersøgelser har vist lipidperoxidation ogoxidativ skadetil hjerneceller hos PD-patienter [19]. Voksende undersøgelser bekræfter detoxidativ skadespiller en kritisk rolle i patogenesen af ​​neuron degenerative sygdomme, såsom AD, PD, HD og ALS [18, 20]. I denne undersøgelse blev et signifikant tab af cellelevedygtighed observeret i MES23.5 dopaminerge neuronale celler efter eksponering for 50 μM H2O2 i 12 timer, 25 μM H2O2 i 24 timer eller 12,5 μM H2O2 i 48 timer. Som vist ved morfologisk observation udviste cellerne eksponeret 12 timer for 150 μM H2O2 en typisk oxidativ skade, herunder multiple membranøse vakuoler i cytoplasmaet, afbrydelse af endoplasmatisk retikulum og mitokondrier og kondenserende euchromatin i cellekernen.

Ifølge kinesisk medicin teori, mangel pånyreer den vigtigste patologiske mekanisme ved PD. Opkvikkendenyreer en vigtig strategi i behandlingen af ​​PD. I nærværende undersøgelse fandt vi, at den traditionellenyre-tonificerendeformel KTF, som består af Cistanche, Epimedii og Polygonatum sibiricum, signifikant forbedret cellelevedygtighed og ekspressionen af ​​TH af H2O2-behandletMES23.5 celler.

Celleapoptose er en tilstand for programmeret celledød efter forskellige stimuli, som aktiverer enten ydre eller indre veje. Cysteinylaspartat-specifikke proteaser (caspaser) er meget konserverede i multicellulære organismer og fungerer som centrale regulatorer af apoptose. Aktivering af caspaser er hovedaksen for alle apoptosehændelser. Blandt disse caspaser er caspase 3 blevet identificeret som en nøglemediator og indikator for celleapoptose. Som andre caspaser eksisterer caspase 3 normalt som et inaktivt proenzym (procaspase 3). Efter proteolytisk behandling vil det producere to underenheder, der kan dimerisere til dannelse af aktiv caspase 3, hvilket efterfølgende fremkalder mange af de biokemiske og biofysiske ændringer for at inducere celleapoptose [21]. Vores nuværende undersøgelse afslørede, at H2O2-behandling signifikant opregulerede caspase 3, men denne tendens blev vendt af KTF-behandling iMES23.5 celler, hvilket indikerer, at KTF reducerede celleapoptose af H2O2-behandlede MES23.5-celler.

Antioxidative enzymer, såsom superoxiddismutase (SOD), CAT, GPx-1, GSH og HO-1, er vigtige forsvarsmekanismer for celler modoxidativstress. Som et antioxidativt enzym kan SOD transformere superoxidradikaler til hydrogenperoxid, som efterfølgende blev omdannet til H2O af CAT og GPx [22]. GSH er også en vigtig antioxidant. Katalytisk omdannelse af reduceret glutathion (GSH) til oxideret glutathion (GSSG) af GPx er nyttig til at omdanne H2O2 til O2. Det er blevet rapporteret, at aktiviteten af ​​antioxidanten blev reduceret i PD-modelmus [23-25]. Derfor kan lægemidler, der regulerer ekspressionen af ​​enzymatiske antioxidanter, tjene som potentielle kandidater til behandling af PD. Vores data viste, at H2O2-behandling undertrykte CAT, GPx, GSH og HO-1 iMES23.5 celler, mens KTF-behandling ved forskellige koncentrationer effektivt genoprettede ekspressionen af ​​CAT, GPx, GSH og HO-1.

Som konklusion viser vores resultater, at traditionelle kinesiske urternyre-tonificerendeformulering, som består af Cistanche, Epimedii og Polygonatum sibiricum, har en stærk antioxidativ kapacitet og betydelige neurobeskyttende virkninger. Denne undersøgelse giver et fingerpeg om at udviklenyre-tonificerendeformulering som et potentielt terapeutisk middel til at forebygge og behandle Parkinsons sygdom.

Nyre-tonificerende formel kan beskytte oxidativ skade på MES23.5-celler

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af den videnskabelige fond for Folkerepublikken Kinas nationale sundheds- og familieplanlægningskommission (WKJ-FJ-38), Chen Keji Development Fund of Integrative Medicine (CKJ2014012) og Fund of Key Disciplinary ( X2014010-skælv). Forfatterne udtrykker deres oprigtige tak til Miss Xin Pan for hendes hjælpsomme hjælp.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer, at undersøgelsen blev udført i fravær af nogen kommercielle eller økonomiske relationer, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Forfatteres bidrag

Yihui Xu og Wei Lin deler det samme bidrag til artiklen. Chuanshan Xu er den tilsvarende forfatter.

Referencer

1. Fahn S., Cohen G. Hypotesen om oxidant stress i Parkinsons sygdom: beviser, der understøtter det. Annals of Neurology. 1992;32(6):804-812. doi: 10.1002/ana.410320616. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Jenner P., Olanow CWOxidativtstress og patogenesen af ​​Parkinsons sygdom. Neurologi. 1996;47(tillæg 3): S161–S170. doi: 10.1212/wnl.47.6_suppl_3.161s. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Akaneya Y., Takahashi M., Hatanaka H. Inddragelse af frie radikaler i MPP plus neurotoksicitet mod rotte dopaminerge neuroner i kultur. Neurovidenskabsbreve. 1995;193(1):53-56. doi: 10.1016/0304-3940(95)11668-M. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Emerit J., Ideas M., Bricaire F. Neurodegenerative sygdomme ogoxidativstress. Biomedicin og farmakoterapi. 2004;58(1):39–46. doi: 10.1016/j.biopha.2003.11.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Kinesisk farmakopékommission. Farmakopé for Folkerepublikken Kina. Vol. 1. Beijing, Kina: People's Medical Publishing House; 2010. [Google Scholar]

6. Cai J., Tian Y., Lin R., Chen X., Liu Z., Xie J. Beskyttende virkninger afnyre-tonificerendeKinesisk urtepræparat på substantia nigra neuroner i en musemodel af Parkinsons sygdom. Neural Regeneration Research. 2012;7(6):413–420. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Google Scholar]

7. Li WW, Yang R., Cai DF Beskyttende virkninger af Cistanche totale glycosider på en dopaminerg neuron i substantia nigra af modelmus af Parkinsons sygdom. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2008;28(3):248-251. [PubMed] [Google Scholar]

8. Wei W., Jing C. En analyse af TCM-mønster og formel for Parkinsons sygdom. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2013;54(20):1778-1782. [Google Scholar]

9. Tian Y., Cai J., Chen X. Beskyttelse afnyre-tonificerendeKinesisk urt på nigra striatale neuroner mus med Parkinsons sygdom. Chinese Journal of Gerontology. 2011;31(3):440–443. [Google Scholar]

10. Lin SG, Ye SF, Huang JM, et al. Hvordan virker kinesisk medicin, der tonificerernyrehæmme dopaminerge neuron apoptose? Neural Regeneration Research. 2013;8(30):2820-2826. doi: 10.3969/j.issn.1673-5374.2013.30.004. [PMC gratis artikel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Wang H., Li W.-W., Cai D.-F., Yang R. Beskyttende virkning af Cistanche-ekstrakter på MPP plus-induceret skade af Parkinsons sygdomscellemodellen. Journal of Chinese Integrative Medicine. 2007;5(4):407-411. doi: 10.3736/jcim20070409. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

12. Geng X., Tian X., Tu P., Pu X. Neuroprotektive virkninger af echinacosid i muse-MPTP-modellen af ​​Parkinsons sygdom. European Journal of Pharmacology. 2007;564(1–3):66–74. doi: 10.1016/j.ejphar.2007.01.084. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

13. Tian X.-F., Pu X.-P. Phenylethanoidglycosider fra Cistanches salsa hæmmer apoptose induceret af 1-methyl-4-phenylpyridiniumion i neuroner. Journal of Ethnopharmacology. 2005;97(1):59–63. doi: 10.1016/j.jep.2004.10.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. Geng X., Song L., Pu X., Tu P. Neuroprotektive virkninger af phenylethanoidglycosider fra Cistanches salsa mod 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,{{ 6}}tetrahydropyridin (MPTP)-induceret dopaminerg toksicitet i C57-mus. Biologisk og farmaceutisk bulletin. 2004;27(6):797-801. doi: 10.1248/bpb.27.797. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

15. Wong HS, Ko KM Herba Cistanches stimulerer cellulær glutathion-redox-cyklus af reaktive oxygenarter genereret fra mitokondriel respiration i H9c2-kardiomyocytter. Farmaceutisk biologi. 2013;51(1):64–73. doi: 10.3109/13880209.2012.710242. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

16. Wing Sze SC, Tong Y., Ng TB, Yin Cheng CL, Cheung HP Herba Epimedii: anti-oxidativegenskaber og dets medicinske implikationer. Molekyler. 2010;15(11):7861-7870. doi: 10.3390/molecules15117861. [PMC gratis artikel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

17. Trachootham D., Lu W., Ogasawara MA, Valle NR-D., Huang P. Redox-regulering af celleoverlevelse. Antioxidanter og redoxsignalering. 2008;10(8):1343-1374. doi: 10.1089/ars.2007.1957. [PMC gratis artikel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Moore DJ, West AB, Dawson VL, Dawson TM Molekylær patofysiologi af Parkinsons sygdom. Årlig gennemgang af neurovidenskab. 2005;28:57-87. doi: 10.1146/annurev.neuro.28.061604.135718. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

19. Sian J., Dexter DT, Lees AJ, et al. Ændringer i glutathionniveauer i Parkinsons sygdom og andre neurodegenerative lidelser, der påvirker basale ganglier. Annals of Neurology. 1994;36(3):348-355. doi: 10.1002/ana.410360305. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

20. Halliwell B., Gutteridge JMC Rolle af frie radikaler i menneskelige sygdomme: en oversigt. Metoder i enzymologi. 1990;186:1-85. [PubMed] [Google Scholar]

21. Venderova K., Park DS Programmeret celledød ved Parkinsons sygdom. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2012;2(8) doi: 10.1101/cshperspect.a009365.a009365 [PMC gratis artikel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

22. Fridovich I. Grundlæggende aspekter af reaktive oxygenarter, eller hvad er der i vejen med oxygen? Annals of the New York Academy of Sciences. 1999;893:13-18. doi: 10.1111/j.1749-6632.1999.tb07814.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

23. Xiong Q., Kadota S., Tani T., Namba T. Antioxidative virkninger af phenylethanoider fra Cistanche deserticola. Biologisk og farmaceutisk bulletin. 1996;19(12):1580-1585. doi: 10.1248/bpb.19.1580. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

24. Koppula S., Kumar H., More SV, Lim H.-W., Hong S.-M., Choi D.-K. Nylige opdateringer i redoxregulering og frie radikalers opfangende virkninger af urteprodukter i eksperimentelle modeller af Parkinsons sygdom. Molekyler. 2012;17(10):11391-11420. doi: 10.3390/molecules171011391. [PMC gratis artikel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25. Fang Z., Wang Y. Virkning af isatin på aktiviteterne af antioxidase i PD-modelmus. Kina apotek. 2008;19(22):1696-1697. [Google Scholar]