Polycystisk nyresygdom

ali.ma@wecistanche.com

Del Ⅱ: Nyreorganoider genereret fra erythroide progenitorceller fra patienter med autosomal dominant polycystisk nyresygdom

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

Baggrund:Nyreorganoider er bredt blevet opnået fra kommercielt tilgængelige inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er); dog har det været en stor udfordring at producere renale organoide modeller fra patienter med autosomal dominant polycystisknyresygdom (ADPKD), der rekapitulerer både embryogenese og mekanismerne bag cystogenese.

Klik for at cistanche bivirkninger og fordele for nyrerne

Metoder: Blod erythroide progenitorer (EP'er) fra to ADPKD (autosomal dominant polycystisknyresygdomspatienter og en rask donor(HC) blev brugt som en sammenlignende kontrol til at normalisere de mange tekniske trin til omprogrammering af EP'er og for generering af organoider. EP'er blev omprogrammeret af en episomal vektor til iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller), som blev differentieret til renale tubulære organoider og derefter stimuleret af forskolin til at inducere cysterdannelse.

Resultater: iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) afledt af EP'er udviste alle karakteristika for pluripotens og var i stand til at differentiere til alle tre kimlag. 3D rørformede organoider blev genereret fra enkeltceller efter 28 dage i Matrigel. HC og ADPKD (autosomal dominant polycystisknyresygdom) organoider dannede ikke spontant cyster, men efter forskolin-stimulering blev der observeret cyster-lignende strukturer i ADPKD (autosomal dominant polycystisknyresygdom) organoider, men ikke i de HC-afledte organoider.

Konklusion: Resultaterne af denne undersøgelse viste detnyreorganoider blev med succes genereret fra blodets EP-celler fra ADPKD (autosomal dominant polycystisknyresygdom) patienter og en sund kontroldonor. Denne tilgang bør bidrage som et kraftfuldt værktøj for fosteretnyreudviklingsmodel, som er i stand til at rekapitulere de meget tidlige patofysiologiske mekanismer involveret i cytogenese.

KLIK HER FOR AT DELTAⅠ

Diskussion

I denne undersøgelse beskrev vi i detaljer en procedure til at generere nyreorganoider fra humane iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) opnået fra blodets erythroide stamceller fra patienter med ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). Mange somatiske celletyper er med succes blevet omprogrammeret til iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller), herunder blodceller [Z]. Her valgte vi at bruge blod erythroide stamceller som startcelletype af en række årsager, såsom deres genomiske integritet, epigenetiske hukommelse og effektive omprogrammering [11,17,18]. Den effektivitet, hvormed erythroide progenitorer var blevet omdannet til iPSC'er, var så meget som to størrelsesordener bedre (7 procent -28 procent ) end effektiviteten af ​​differentierede blodcelletyper (0).0 2 procent -0,60 procent )eller fibroblaster (0,74 procent )[Z]. På trods af den lave overflod af disse celler i det perifere blod, kan de let isoleres og udvides in vitro for at producere et tilstrækkeligt antal til omprogrammering. En af de vigtigste udfordringer ved at etablere egnede iPSC'er er deres genotype og fænotypiske variabilitet [6], men der er nogle tekniske strategier foreslået for at omgå eller reducere en sådan variabilitet. I de nuværende eksperimenter brugte vi et ikke-integrerende episomalt system til omprogrammering, der ikke kræver genomintegration for at omprogrammerende gener skal udtrykkes [10], hvilket tillader mindre immunogenicitet og gør mere genetisk stabile celler [19,20]. Desuden blev alle prøver afledt fra den samme kilde, hvilket hjælper med at minimere epigenetisk variabilitet [12] under antagelse af, at differentiering af startcellen kan påvirke effektiviteten af ​​slutresultaterne. Analyse af pluripotensmarkørerne og evnen af ​​iPSCs (inducerede pluripotente stamceller) til at differentiere til alle tre kimlag blev sammenlignet side om side, og de blev også sammenlignet med H9 embryonale cellelinje, som blev brugt som en positiv kontrol . Alle disse sammenligninger viste ingen signifikante forskelle mellem ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom), HC'er og H9-celler.

Der er udviklet adskillige protokoller til at inducere differentieringen af ​​iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) til nyreorganoider [13,21]. Baseret på protokoller beskrevet af Cruz et al. [6], vi opnåede strukturer med karakteristika af proksimale tubuli, herunder ekspressionen af ​​NHE3 og AOP1. Derudover udtrykte organoiderne NPHS2, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​podocytlignende celler.

Omvendt blev AQP2 ikke udtrykt i disse rørformede organoider. Dette fund er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der peger på adskillige begrænsninger i udviklingen af ​​strukturer afledt af den ureteriske knop (UB) in vitro, hvor udviklingen af ​​UB kræver specifikke protokoller, da tidsvinduet for tilføjelsen af ​​den specifikke induktor er meget begrænset [ 6,22,23].

I processen med at generere nyreorganoider fra iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) rekapituleres al den renale embryogenese in vitro, hvilket oprindeligt involverer dannelsen af ​​kaviterede sfæroider fra enkeltceller [14]. Faktisk fandt vi, at udifferentierede iPSCss (inducerede pluripotente stamceller) fra både ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) patienter og sund kontrol dannede epiblastlignende sfæroide strukturer, der var morfologisk ens. Selvom DNA-sekventering af PKD1- og PKD2-generne ikke blev udført i denne undersøgelse, indikerer de nuværende resultater, at den type mutation, som patienterne bærer, ikke havde nogen indflydelse på typisk epiblastmorfogenese. Yderligere undersøgelser er stadig nødvendige for mere korrekt at evaluere ekspressionen af ​​pivotale molekyler involveret i denne fase af embryonal udvikling.

Ifølge protokollen udviklet af Freedman et al. [14], vi observerede, at sfæroider differentierede til tubulære organoider 26 dage efter induktion af differentiering, og timingen var ens for både ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) patienter og HC (Fig ③). Ikke desto mindre bemærkede vi en vis variation med hensyn til tidsplanen for udtryk og niveauerne af differentieringsmarkører. På den anden side var morfologien af ​​de rørformede strukturer ens og sammenlignelig blandt prøver fra ADPKD-patienterne og HC. I modsætning hertil fandt Cruz et al-gruppen en større variabilitet i disse cellers evne til at danne organoider ved at bruge iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller), der stammer fra nyrebiopsier af ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). Ud over den enorme mangfoldighed af mutationer, der er forbundet med denne sygdom, kan disse forskelle i effektiviteten af ​​opnåelse af organoider også forklares af de heterogene celletyper, der er til stede i biopsiprøver, i modsætning til de erythroide progenitorer, som udgør en mere homogen cellepopulation. Tilsammen indikerer disse resultater, at på trods af variabiliteten og forskellene i effektiviteten af ​​forskellige iPSC-kloner til at danne nyreorganoider, kan opnåelse af sidstnævnte fra ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) udgøre en unik model til at studere de mange former for fænotypiske manifestationer af denne sygdom. Desuden er det vigtigt at bemærke, at hvis der er betydelig variation af mutationer i den ADPKD-ramte population, idet de patientspecifikke iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller), der er fuldstændig immunkompatible, kan de blive brugt til individuelle regenerative terapier i fremtiden , ud over at tillade udviklingen af ​​en in vitro-model til at verificere, om de meget tidlige fænotypiske manifestationer også er lige så forskellige som den kliniske præsentation.

Ustimulerede organoider afledt af HCor ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) dannede ikke spontant cyster. Den typiske morfologi af cyster og ekspressionen af ​​cystogenese-markører var ikke detekterbare i nogen prøve, hvilket endda forlængede den organoide differentiering i kulturen indtil 35 dage. Det er blevet påvist, at celleproliferation alene ikke producerer cyster[24]. Desuden kræves en tredje uafhængig begivenhed (kendt som tredje-hit) for at accelerere cystedannelse og vækst in vivo [23]. Omvendt forekom cystedannelse induceret af forskolin i organoiderne fra ADPKD-patienter, men ikke i dem fra HC. Det skal bemærkes, at selvom de var til stede, blev cyster observeret i en lav procentdel i ADPKD-prøverne, selv i nærvær af forskolin, som det også er blevet observeret af Freedman et al. [14] i organoider dannet fra CRISPR/Cas9-modellen for ADPKD-sygdom. Nogle hypoteser kan rejses for at forklare den lave frekvens af cyster fundet i den nuværende model. 1) Organoider dyrket i et 3D-suspensionsmiljø udviste meget højere cystogenese-effektivitet sammenlignet med adhærente organoider [6], hvilket indikerer, at mikromiljøet er direkte impliceret i cystogenese.2) Den eksperimentelle protokol anvendt i denne undersøgelse dannede proksimale tubuli-organoider, men ikke distale dele af nefronet [23]. Selvom alle nefronsegmenter kan stamme fra cyster, inklusive proksimale tubuli [25], synes dem, der stammer fra samlekanaler, tilsyneladende at være større og i højere antal end dem fra andre segmenter [26], 3) Endelig blev det for nylig påvist, at cysternes oprindelse kan være relateret til tilstedeværelsen af ​​flere PKD1-mutationer, der bestemmer sværhedsgraden af ​​sygdommen, og at cystedannelse i opsamlingskanalerne var forbundet med sygdommens sværhedsgrad [27, 28].

Som konklusion viste de nuværende resultater, at det er muligt at generere organoider med tredimensionelle strukturer svarende til nyre-progenitor-arkitekturen ved hjælp af iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) omprogrammeret fra erythroide progenitorer, der let blev isoleret fra ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) patienter, og at disse organoider er i stand til at danne cyster under forskolin-stimulering. Denne lovende metode afslører en metode til at øge forståelsen af ​​de meget tidlige genetiske, fænotypiske og fysiologiske trin i cystedannelsen i ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) indstilling.

Referencer

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.0357PM08:266

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatisk mutation i individuelle levercyster understøtter en to-hit model for cystogenese i autosomal dominant polycystisk nyresygdom. Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Somatiske PKD2-mutationer i individuelle nyre- og levercyster understøtter en "to-hit"-model af cystogenese i type 2 autosomal dominant polycystisk nyresygdom.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: En kritisk udviklingskontakt definerer kinetikken af ​​nyrecystedannelse efter tab af Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: Nyreskade er et tredje hit, der fremmer den hurtige udvikling af voksen polycystisk nyresygdom. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: Organoid cystogenese afslører en kritisk rolle for mikromiljø i human polycystisk nyresygdom. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Induktion af pluripotente stamceller fra fibroblastkulturer. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al.: Reduceret ciliært polycystin-2 i inducerede pluripotente stamceller fra patienter med polycystisk nyresygdom med PKD1-mutationer. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Afledning af transgenfri inducerede pluripotente stamceller fra en enkelt bloddråbe.Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human-inducerede pluripotente stamceller fri for vektor- og transgensekvenser.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Differentieringsstadiet bestemmer potentialet for hæmatopoietiske celler til omprogrammering til inducerede pluripotente stamceller. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Effektiv human iPS-celleafledning af et ikke-integrerende plasmid fra blodceller med unikke epigenetiske og genekspressionssignaturer. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Pluripotente stamcelle-afledte nyreorganoider: En in vivo-lignende in vitro-teknologi. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al.: Modellering af nyresygdom med CRISPR-mutante nyreorganoider afledt af humane pluripotente epiblastsfæroider. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Ensartede kriterier for ultralydsdiagnose af ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: En ROCK-inhibitor tillader overlevelse af dissocierede humane embryonale stamceller. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Et højeffektivt system til generering og undersøgelse af human-inducerede pluripotente stamceller. Cel/ Stamcelle. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420