Nyreepitelmålrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A-mangel resulterer i progressiv mitokondriel udtømning forbundet med alvorlig cystisk sygdom

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi & et al.

INTRODUKTION

Mitokondriel (mt) dysfunktion er et velkendt patologisk træk ved almindelige nyresygdomme og kan udløse cellulær skade, inflammation og fibrose. I nyrerne er tubulære epitelceller stærkt afhængige af adenosintriphosphat(ATP) genereret fra oxidativ phosphorylering (OXPHOS), fordi de udfører flere energiforbrugende epiteltransportfunktioner. Derfor er næring af effektiv mt ATP-produktion afgørende for normal nyrefunktion og systemisk elektrolythomeostase. Derudover tyder nyere beviser på, at mitokondrier har en stor rolle i genregulering, cellulær signalering og celledifferentiering via generering af intermediære metabolitter og reaktive oxygenarter (ROS).2 På trods af disse fremskridt, spiller mt-signaleringens rolle i patogenesen af almindelige nyresygdomme er ikke godt forstået.

For at undersøge mt-funktion i renal homeostase og patogenese, har vimålrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A(TFAM). TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)er en nuklear-kodet faktor, der er essentiel for mt-funktion, opretholdelse af mt-kopinummer og strukturel stabilitet af mt-DNA, fordi den regulerer replikation og transkription af mt-genomet ved at bøje promotor-DNA.3 Pattedyr mt-DNA indeholder 37 gener, hvoraf 13 koder proteinunderenheder af respiratorisk kædekompleks, 22 koder for transfer-RNA'er og 2 ribosomale RNA'er. Dermed,TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)er direkte involveret i reguleringen af ​​mt-elektrontransport og ATP-syntese via transkriptionen af ​​gener såsom mitokondrielt kodet cytochrom b(MT-CYB), mitokondrielt kodet cytokrom c oxidase-underenhed 1 (MT-CO1) og mitokondrielt kodet ATP-syntasemembranunderenhed 6 (MT-ATP6).3UdenTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A), mister celler deres evne til at producere ATP via OXPHOS, kan ikke generere betydelige mængder mt ROS og bliver gradvist udtømt for mitokondrier.-Genetiske undersøgelser har vist, atTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)er afgørende for normal embryogenese, fordi global homozygotTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering resulterede i intrauterin dødelighed på embryonal dag 10.5, hvorimod heterozygot mangel, selvom det reducerede mt kopiantallet med -40 procent og førte til respiratorisk kædemangel, ikke førte til embryonal dødelighed. Således genetisk målretning afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A) er en nyttig eksperimentel strategi til at undersøge rollen af ​​progressiv mt-dysfunktion i cellulær differentiering og vævshomeostase. Celletype-specifik betinget inaktivering afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)foreslog, at OXPHOS- og/eller mt ROS-generering er afgørende for cellulær differentiering, funktion og normal fysiologi.-1o

Primære mt-lidelser på grund af nukleare eller mt-genmutationer kan vise sig med nyresygdom, der oftest manifesteres som tubulointerstitiel skade eller isoleret tubulær dysfunktion.(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)forårsager nyresygdom er ikke blevet rapporteret. For nylig reduceretTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)udtryk er blevet forbundet med kronisk nyresygdom. Tab af mt integritet pgaTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering forårsagede tubulointerstitiel sygdom og nyresvigt hos mus, hvilket til dels skyldtes aktivering af mt DNA-stress-induceret cyklisk GMP-AMP-syntase(cGAS)-stimulator af interferon-gener (STING)-afhængige inflammatoriske responser.

Her rapporterer vi, at mus med betingetTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A) inaktivering i sine oculis-relateret homeobox 2(SIX2)-udtrykkende nefron-stamceller udvikler alvorlig cystisk sygdom og dør for tidligt af nyresvigt som unge unge mus.TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-mus var karakteriseret ved defekter i nefronmodning, som var forbundet med mt-depletering, en reduktion i OXPHOS og et metabolisk skift mod glykolyse iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7-nyreepitel. I betragtning af sværhedsgraden af ​​cystisk sygdom iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7-mus analyserede vi 2 musemodeller af polycystisk nyresygdom (PKD), som skyldes mutationer i enten polycystin-1 (Pkd1) eller cystin-1 (Cys1), såvel som mennesker væv fra patienter med autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD). Det slår vi fastTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)er dysreguleret i cyster fra både murine og humane PKD-væv. Tilsammen tyder vores undersøgelser på, at TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)dysregulering og mt-depletion er karakteristiske træk ved nyrecystiske sygdomme og kan have en medvirkende rolle i deres patogenese.

cistanche for nyre

RESULTATER

TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering i SIX2-celler forårsager alvorlig cystisk sygdom, der resulterer i nyresvigt

For at undersøge mt-funktionen i nyreepitelet inaktiverede viTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)i SIX2-udtrykkende progenitorceller, som giver anledning til alle nefronsegmenter undtagen samlekanalen (CD).15For dette krydsede viTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)floxet allel med bakterielle kunstige kromosom-transgene mus, der udtrykker et forstærket grønt fluorescerende protein/Cre-rekombinase-fusionsprotein (eGFP/Cre) under transkriptionel kontrol af Six2-promotoren (figur la)."Mus homozygote forTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)floxet allel og heterozygot for eGFP/Cre-transgenet(Six2-eGFP/Cre plus ; T fam) er herefter omtalt som seks2-Tfam-/- mutanter. Seks2-Tfam-/- mus blev født i forventede Mendelske forhold og kunne ikke skelnes fra Cre- kuldmate-kontroller ved visuel inspektion ved fødslen. Men forskelle i kropsvægt mellem seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A){{0}}mutanter og Cre- kuldmate-kontroller blev tydelige efter postnatal dag(P)14(5,7±0.3g for mutanter vs.7.5± 0.3g for kontroller,n{{11} } hver, P=0.004; Supplerende tabel S1). Seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A) mutante mus var karakteriseret ved forstørrede nyrer sammenlignet med kontroller (nyre/kropsvægtforhold på 1,45 procent ± 0,19 procent for mutanter vs.0.60 procent ±0,02 procent for kontrol , n=4 hver, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7- mutanter udviklede signifikant albuminuri (urin albumin/kreatinin-forhold=362,4 ± 75,18 mg/g hos seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)--mutanter vs. 43,58±3,39 mg/g i kontroller ved henholdsvis P14, n=6 og 10;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-'mutanter, mus med heterozygotTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)mangel på SIX2 progenitorceller udviklet normalt var fertile og udviklede ikke åbenlys nyresygdom (Supplerende figur S1).

Figur 1|Tfam-inaktivering i SIX2-celler resulterer i alvorlig cystisk sygdom og nyresvigt.(a) Et skema, der illustrerer den eksperimentelle tilgang og placering af målrettede sekvenser i Tfam floxed allelen. Polymerasekædereaktionsanalyse af totalt genomisk nyre-DNA isoleret fra kuldkammeratkontrol (Cre) og seks{{0}}Tfammus i en alder af postnatal dag (P) 7; den ikke-rekombinerende Tfam floxede allel er betegnet med 2-lox (2); den rekombinerede allel af 1-lox, vildtype-allelen efter wt; þ eller - angiver tilstedeværelsen eller fraværet af Six2-eGFP/Cre-transgenet. (b) Venstre paneler, fotografier af nyrer fra Cre-kontrol- og seks2-Tfam-mus i en alder af P20. Nyrevægte (KW'er) er udtrykt som en procentdel af kropsvægt (BW) (n ¼ 4-14). Højre paneler, blodurea-nitrogen-niveauer (BUN) i Cre kuldkammerat-kontrol (co) og seks2-Tfam-mus i alderen P7 (henholdsvis n ¼ 7 og 6) og Kaplan-Meier-overlevelseskurver for Cre-kontrol og seks{ {16}}Tfam-mus sammenlignet med log-rank-testen (n ¼ 10-13). (c) Repræsentative billeder af formalinfikserede, paraffinindlejrede nyresektioner fra Cre-kontrol- og Six2-Tfam-mus i alderen P7 og P29 farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) og analyseret ved immunhistokemi for a-glatmuskelaktin (ACTA2) og cluster differentiation (CD) antigen 31. Taltegn viser cystiske strukturer og stjerner afbilder glomeruli. Søjler ¼ 1 mm for hele nyretværsnit, 100 mm for højeffekt H&E-billeder og 50 mm for IHC-billeder. Data er udtrykt som gennemsnitlig SEM og blev analyseret ved den 2-tailed Student's t-test. ***P < 0,001.="" for="" at="" optimere="" visningen="" af="" ​​dette="" billede,="" se="" venligst="" onlineversionen="" af="" ​​denne="" artikel="">www.kidney-international.org.

cistanche mandlige fordele

Analysen af ​​seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-mus, som også udtrykte ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reporter-allelen, heri omtalt som Six2-mT/mG;TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7 mus, hvilket indikerer, at langt de fleste cystiske strukturer iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-nyrer (Supplerende figur S3). Disse resultater stemmer overens med øgede phosphoryleret ekstracellulær signalreguleret kinase (p-ERK) og -catenin niveauer i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/- nyrevæv (Supplerende figur S3). Tilsammen indikerer vores data, at seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/ nyrer udviser molekylære træk, der ofte er forbundet med nyrecystiske sygdomme.

Nefronmodningen er defekt i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/mus Fordi der kan gå op til flere uger før mus med vævsspecifikkeTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering udvikle patologi, vi derefter undersøgt tidsforløbet af nyresygdom udvikling i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A){{0}}mus. Vi indsamlede nyrer fra kontrol- og mutante mus i alderen P0, P7 og P14 og brugte histologiske metoder, immunfluorescens (IF)-farvning og genekspressionsanalyse i hele nyreekstrakter til vurdering. IF-farvning for SIX2 og E-cadherin i alderen P0 viste, at nyrer fra kontrol og Sic2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-var histologisk ens. Dannelsen af ​​kortikale nefrogene zonestrukturer, såsom SIX2 plus cap mesenchyme, E-cadherin-udtrykkende ureteriske spidser og begyndende nefronstrukturer såsom nyrevesikler og kommaformede og S-formede legemer, blev ikke blokeret i Six{{7} }TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7- nyrer (figur 2a). Disse histologiske fund var i overensstemmelse med ekspressionsniveauerne af gener, der koder for nefrogene markører. Six2, parret box 2 (Pax2), LIM homeobox protein 1 (Lhx1) og spalt-lignende transkriptionsfaktor 1(Sall)mRNA-niveauer var ikke signifikant forskellige mellem kontrol og seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/mus i total nyrehomogenater fra P0 nyrer (figur 2b). Dette antydede detTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering i SIX2 nefron pro-genitorer havde ikke signifikant indflydelse på dannelsen af ​​nefrogene strukturer.

Figur 2|Nephronmodning er defekt i seks2-Tfam-7mus.(a) Repræsentative billeder af formalinfikserede, paraffinindlejrede snit fra Cre~-kontrol og seks2-Tfam-/nyrer i alderen efter fødslen dag (P) 0. Nyresektioner blev farvet med toluidinblåt og analyseret ved immunfluorescens for sinus oculis-relateret homeobox 2(SIX2) og E-cadherin (ECAD) ekspression. Ureteriske træer er markeret med stiplede hvide linjer. Hættemesenkym (CM), kommaformet krop (CSB), S-formet krop (SSB) og urinlederspids (UT) er annoteret. (b) Venstre panel, relative mRNA-ekspressionsniveauer af udviklingsmarkører ved en kvantitativ polymerasekædereaktion i totale nyrehomogenater fra seks2-Tfam-/mutanter i alderen PO sammenlignet med Cre-kuldkammeratkontroller (n =6 hver ). Højre panel, relativ glomerulær (glom) og nefronsegment-specifik genekspression i totale nyrehomogenater fra seks2-Tfam7mutanter i alderen P7 sammenlignet med Cre-kuldskammeratkontroller (n =4 hver). PT, proximal tubuli; mTAL, tykt opstigende lem af Henle; DT, distale tubuli; CD, opsamlingskanal. (c) Alcian blue/periodic acid-Schiff (AB-PAS)-farvede nyresektioner i alderen P0, P7 og P14. Pile angiver PAS-positive tubuli med børstekant, stjerner viser glomeruli, og taltegn viser cystiske tubuli, søjler=100 um for AB-PAS-billeder og 50 um for toluidin-blå-farvede billeder og IF-billeder. Data er udtrykt som middel ± SEM;2-tailed Student's t-test;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.

cistanche anmeldelser

Selvom dannelsen af ​​ny nephronstruktur ikke blev hæmmet, indikerede farvning med alcian blue/periodic acid-Schiff og lotus tetragonolobus lectin defekt terminal nefronmodning hos seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A){{0}}mus i alderen P0. Alcian blue/periodic acid-Schiff, som farver tubulære basalmembraner og børstekant, og lotus tetragonolobus lectin, som identificerer specifikke oligosaccharider i børstekanten af ​​proksimale tubuliceller, blev begge reduceret i mutante nyrer. Figur 2c viser alcian blue/periodic acid-Schiff-farvning ved P0-, P7- og P14-tidspunkterne. Lotus tetragonolobus lectinhistokemi og IF-farvning for Wilms tumor 1-protein ved P0-, P7- og P14-tidspunkterne er vist i supplerende figur S4. Ved PO-alderen var det relative areal, der farvede positivt med lotus tetragonolobus lectin, 2,10 procent ±0,51 procent og 0,39 procent ± 0,1 procent ved alder P7 versus henholdsvis 6,25 procent ± 0,28 procent og 6,2 procent ±1,1 procent for kontroller (henholdsvis n=3-4,P=0.0004 og 0.0007; Supplerende figur S4). I overensstemmelse med disse histologiske fund er det signifikante fald i ekspressionen af ​​gener, der koder for glomerulære og nefronsegment-specifikke markører podocin, nephrin, aquaporin 1 (Agp1), natrium-phosphat cotransporter 2a (NaPi2a), uromodulin, natrium-kalium-chlorid cotransporter 2 (Nkcc2) og thiazidfølsom natriumchlorid-cotransporter (Ncc) i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/ mus (figur 2b). Tilsammen tyder disse data på, at seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/- nyrer udviser en progressiv reduktion i antallet af modne proksimale nefronsegmenter og glomeruli.

Fordi seks2-eGFP/Cre-aktivitet resulterer iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-deficient cap mesenchyme-afledte nefronsegmenter, forudsagde vi modningen af ​​CD-epitelceller, som er ureteriske knopper-afledte, ikke ville blive påvirket i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/ nyrer. I overensstemmelse med denne opfattelse er, at farvning med Dolichos biflorus agglutinin, som reagerer med N-acetyl-D-galactose i distale tubuli og CD, indikerede en relativ overrepræsentation af Dolichos biflorus agglutinin-positive strukturer i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/- nyrer. Ved alder P7 udgjorde positivt farvede områder for Dolichos biflorus agglutinin 13,91 procent ±0,9 procent af det samlede areal for mutanter mod 1,93 procent ± 0,1 procent for kontrollen (n {{11} }, P=0.0002; Supplerende figur S4). mRNA-ekspression af natriumkanalepitel 1 alfa-underenhed (Scnnla) eller aquaporin 2(Agp2), som begge udtrykkes i CD-epitelceller, var ikke signifikant nedsat sammenlignet med kontrollen (figur 2b). I modsætning til seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-nyrer,TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering i homeobox B7(HOXB7) progenitorceller, som giver anledning til CD-epitelceller, hvilket resulterer i tab af CD-nephronmarkørekspression og mild tubulær dilatation, men ikke cystogenese (Supplerende figur S5). Samlet indikerer vores data, at tabet afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)funktion i SIX2 progenitorceller blokerer ikke udviklingen af ​​spirende nefronstrukturer, men hæmmer terminal nefronmodning.

TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-cyster er mangelfulde i almindelige nefronsegmentmarkører

At karakterisere den histogenetiske oprindelse afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7nyrecyster, vi udførte IF-analyser afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um var karakteriseret ved intraluminale aflejringer af uromodulin, hvilket antydede oprindelse fra nefronsegmenter distalt for den proksimale tubuli og den nedadgående løkke af Henle (figur 3b).

Figur 3ITfam-/cyster udtrykker ikke almindelige nefronsegment-specifikke markører.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Repræsentative billeder af formalinfikserede, paraffinindlejrede nyresektioner fra seks2-mT/mG; Tfam-7mus i alderen P14 farvet for eGFP og uromodulin af IF. Stjerner viser cyster med intraluminalt uromodulin. Tilstedeværelsen af ​​intraluminalt uromodulin blev undersøgt i cyster med en maksimal diameter på enten 50-100 um eller i cyster større end 100 um i maksimal diameter. Barer =(a,b)100 um. For at optimere visningen af ​​dette billede, se venligst onlineversionen af ​​denne artikel på www kidney-international.org.

Progressive abnormiteter i mt funktion og morfologi iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7-epitelceller

At karakterisere tidsforløbet af de metaboliske konsekvenser afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)deletion, undersøgte vi først mRNA-niveauer afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)ogTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-reguleret mt-Col,mt-Cyb og mt-Atp6 inTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/-nyrer i alderen PO, P7 og P14. Som forventet,TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)mRNA-niveauer af mt-Col, mt-Cyb og nt-Atp6 blev signifikant reduceret (figur 4a). Tfam-7--epitelceller mærket med eGFP(Seks2-mT/mG; Tfam-7-mus) udviste en signifikant reduktion i MT-CO1-proteinekspression (Supplerende figur S7). Mt DNA-kopitallet blev reduceret med 63 procent, hvilket er i overensstemmelse med mt-depletering, et kendetegn forTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)mangel (figur 4a). I modsætning hertil blev ekspressionen af ​​nukleare gener, der koder for nikotinamid-adenindinukleotid: ubiquinonoxidoreduktase-kerneunderenhed 3(Ndufs3) og succinatdehydrogenasekompleksflavoproteinunderenhed A (Sdha) ikke påvirket i alderen P0, men blev reduceret i alderen P7 og P1. (Figur 4a). Disse fund fra mt-genet og proteinanalysen er i overensstemmelse med det progressive tab af mt-kopiantal i Tfam-/-epitel.

Vi undersøgte derefter de metaboliske virkninger afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)inaktivering i primære proksimale tubuli-epitelceller (PTEC'er) isoleret i alder P7.TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7 PTEC'er udviste signifikante reduktioner i basal iltforbrug (40,77 ± 4,10 for mutanter vs. 61,75± 5,18 pmol/min/10 celler for kontroller, n=3 hver, P= 0.034 ),ATP-koblet respiration (33,11 ± 3,91 for mutanter vs. 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* celler for kontroller, n=3 hver, P=0}.093), maksimal respiration (116,8 ± 14,19 for mutanter vs. 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* celler for kontroller, n= 3 hver,P=0.005) og ekstra respiratorisk kapacitet (76,05 ± 10,18 for mutanter vs. 163,7 ± 8,61 pmol/min/10* celler for kontroller, n=3 hver, P= 0.003; figur 4b).

cistanche reddit

For yderligere at karakterisere graden af ​​mt-udtømning og skade undersøgte viTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/- nyrer ved transmissionselektronmikroskopi og 3-dimensionel struktureret belysningsmikroskopi (3D SIM). I en alder P7 udviste mitokondrier uregelmæssige former og ballondannelse, hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)knockout mus. Transmissionselektronmikroskopisk analyse indikerede, at strukturelle abnormiteter af mitokondrier, såsom øget størrelse og unormale cristae, udviklede sig postnatalt, fordi de morfologiske forskelle mellem mutanter og kontrollen var mindre tydelige i alderen P0 og blev mere alvorlige med alderen (Figur 4c) ).3D SIM blev brugt til at undersøge mt-volumen og netværksstørrelse i seks2-mT/mG;TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/ mutanter sammenlignet med seks2-mT/mG kontrolmus i alderen P7; mt volumen blev målt i tværsnit på 5 til 8 tubuli pr. sektion, idet man undersøgte 25 til 4 0 eGFP-positive kortikale epitelceller farvet for spændingsafhængig anionselektiv kanal 1 ved IF-farvning. Vi fandt, at det totale mt-volumen pr. eGFP-positiv celle var signifikant reduceret (62,66 ± 16,46 um/celle for mutanter vs. 177,4±30.17 μm'/celle for kontroller, n=3 hver , P= 0.0289) og var forbundet med en ændring i forholdet mellem samlet mt-volumen pr. samlet cellevolumen fra 0,230 ±0,01 i kontroller til 0,089 ± 0,016 i seks 2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7 mutanter (n= 3 hver, P=0.0017; figur 4c). Den maksimale mt-netværksstørrelse, som måler det største mt-netværk, der er stødt på i alle undersøgte eGFP-positive celler, blev reduceret i seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/ nyrer (143,2 ± 23,2 μm² for mutanter vs. 318,3 ± 49,45 um² for kontroller, n= 3 hver, P= 0.0327). Tilsammen er ultrastrukturelle og SIM-fund og fundene fra mt-gen- og proteinanalyse i overensstemmelse med progressivt tab af mt-kopinummer iTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-7-epitel.

Figur 4| Tfam-/renal epitel er karakteriseret ved progressiv mitokondriel udtømning.(a) Mitokondriel (mt) genekspression ved kvantitativ polymerasekædereaktion i alderen postnatal dag (P){{0}},P7 og P14 (fold ændring over kontrol, n =6 hver) og mt DNA-indhold (P7) i total nyrehomogenater fra Cre~ kuldkammeratkontrol (co) og seks2-Tfam-/mus. (b) Iltforbrugshastighed (OCR) i primære proksimale tubulære epitelceller (PTEC'er) isoleret fra Cre kuldkammeratkontrol og seks2-7famnyrer i alderen P7 på en Seahorse XFe24-platform. Repræsentative OCR-målinger i kontrol- og Tfam-7PTEC'er behandlet med oligomycin A (oligo A, adenosintriphosphat [ATP]-syntaseinhibering), carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP, uncoupler) og inhibitorer af oxidativ rotenphononsphorylation og antimycin A(AA). Der er også vist beregnet basal og maksimal respiration, ATP-forbundet respiration og ekstra respirationskapacitet (n =3 hver). (c) Ultrastrukturel analyse af mitokondrier ved transmissionselektronmikroskopi. Repræsentative transmissionselektronmikroskopiske billeder af nyresektioner fra Cre-control og seks2-Tfam-7mus i alderen P0 og P7, røde pile viser mitokondrier. Bar=500 nm. (d) Tredimensionelle strukturerede belysningsmikroskopibilleder af nyresektioner fra seks2-mT/mG (co) og seks2-mT/mG; Tfam-/-mus i en alder af P7. Forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP), cytochrom c-oxidase-underenhed 4(COXⅣ) og spændingsafhængig anionselektiv kanal 1(VDAC blev påvist ved immunofluorescens.4',6-diamidino-2-phenylindol (DAP) ) blev brugt til nuklear farvning (blå fluorescens). Hvide stiplede linjer skitserer nyretubuli i kontrol- og cystelumen i mutantnyren, og taltegn viser tubulær lumen i kontrol eller cystelumen i mutantnyren. Mt-området blev kvantificeret med Imaris software (Oxford Instruments, Abingdon, UK; n =3 hver). Total (tot) mt volumen (vol) pr. eGFP-positiv celle (25-40 celler/prøve analyseret), forholdet mellem samlet mt volumen samlet cellevolumen og den maksimale (maks.) størrelse af mt-netværket pr. celle. mt-netværksstørrelsen blev bestemt i et rørformet tværsnit med 5 celler pr. tværsnit. Søjler =4 um. Data er repræsenteret som middel ± SEM og blev analyseret ved Students t-test *P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)mangel skifter nyreepitelmetabolisme mod glykolyse

PTEC'er i nyrerne bruger fedtsyreoxidation og OXPHOS til ATP-generering og er glukoneogenetiske.' grad For at få yderligere indsigt i metaboliske ændringer forbundet med Tam-inaktivering udførte vi RNA-sekventeringsanalyse af nyrer fra Six2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/- og Cre~ kuldkammerat kontrolmus i alderen P7. Vi fandt ud af, at vigtige regulatoriske gener involveret i glykolyse, såsom hexokinase 2(Hk2) og enolase 2(Eno2), blev opreguleret. I modsætning hertil var ekspressionen af ​​de fleste gener involveret i tricarboxylsyrecyklussen reduceret (fx isocitrat dehydrogenase 1[Idh1), ligesom ekspressionen af ​​gener involveret i fedtsyreoxidation, såsom acetylcoenzym A acyltransferase 1B(Acaalb), mellemkædet acyl-coenzym A-dehydrogenase(Acadm) (figur 5a og b, supplerende figur S8). I overensstemmelse med nedsat ekspression af gener involveret i tricarboxylsyrecykluskontrol og mutante nyrer i alderen P7 ved brug af en Seahorse XFe24-platform (Agilent, Santa Clara, CA). Mutante PTEC'er blev karakteriseret ved en signifikant stigning i basal glykolyse (protonudstrømningshastighed=117,4 ± 12.07 pmol/min for mutanter og 73,34 ± 6,33 pmol/min for kontrol, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) og et fald i forholdet mellem mt iltforbrugshastighed og glykolytisk protonudstrømningshastighed fra 0,73 ± 0,08 i kontrollen til 0,34 ± 0,02 i mutante PTEC'er (n=3,P=0.0074). Tilsammen indikerer disse data detTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/- epitelceller havde gennemgået et metabolisk skift fra OXPHOS og fedtsyreoxidation mod glykolyse (figur 5d).

Figur 5] Nyreepitel mitokondriel transkriptionsfaktor A (TFAM) mangel er forbundet med øget glykolyse og unormal fedtsyremetabolisme.(a) Analyse af metabolisk genekspression ved RNA-sekventering af helnyrecortex isoleret fra seks2-Tfam-/- og Cre-kulds-kontrolmus (co) i alderen postnatal dag(P) 7 (n {{6) }} hver). Der er vist differentielt regulerede metaboliske gener involveret i glykolysen og tricarboxylsyrecyklussen. Gener med en statistisk signifikant stigning i mRNA-ekspression er vist med rødt, og gener med nedsat ekspression er vist med grønt. (b) mRNA-ekspressionsniveauer af udvalgte differentielt regulerede gener ved kvantitativ polymerasekædereaktion (n=4-6). (c) Ændret fedtsyremetabolisme i seks2-7Tfam-7mutante mus. Repræsentative billeder af olierøde O-farvede nyresektioner fra Six2-Tfam-7og Cre-littermate kontrolmus i en alder af P14. Pile peger på olierøde O-positive celler, og talsian viser omkostningerne. Bar=10 um.(d) Glykolytisk fluxanalyse af primære proksimale tubulære epitelceller (PTEC'er) isoleret fra Cre kuldkammeratkontrol og seks2-Tfam-/nyrer i alderen P7 (n=4 hver ) på en Seahorse XFe24-platform. Der er vist repræsentative målinger af glykolytisk protonudstrømningshastighed (glyco PER) i kontrol- og Tfam-7PTEC'er behandlet med 2-deoxyglucose (2-DG) og oxidative phosphoryleringshæmmere rotenon og antimycin A(AA) . Også vist er gennemsnitlig glyco PER ved baseline og forholdet mellem mitokondrie (mt) oxygenforbrugshastighed (OCR) over glyco PER. Data er repræsenteret som middel ± SEM og blev analyseret under anvendelse af Student's t-test. (Fortsatte)

ReduceretTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)ekspression i murine og humane PKD-væv er forbundet med mt-depletering

Fordi seks2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/ nyrer lignede PKD nyrer, vurderede vi derefter, omTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)var dysreguleret i PKD-væv. Vi undersøgte førstTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)og TFAM-reguleret genekspression i 2 veletablerede genetiske PKD-musemodeller.TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)mRNA-niveauer blev signifikant reduceret i helnyre-homogenater fra Pkd1-/- og Cyspk/pk-mus, som bærer mutationer i enten Pkd1 eller Cys1. Dette var forbundet med et fald i ekspressionen af ​​mitokondrielt og nuklear-kodede mt-gener samt dysreguleret glykolytisk genekspression. Svarer til Six2-TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)-/kidneys, Pkd1-7 og CysPkpk nyrer blev karakteriseret ved forhøjede Eno2 og Hk2 og signifikant nedsatte phosphoglycerat kinase (Pkg)1, pyruvat dehydrogenase kinase(Pdk)1 og Pdk4 transkriptniveauer (Figur 6a).TFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)proteinekspression, som vurderet ved IF-farvning, blev reduceret i cysteforingsepitelceller sammenlignet med epitelceller fra tilstødende ikke-cystiske tubuli (figur 6b). Dette var forbundet med reduceret mt-Co1 og mt-Atp6 ekspression ved RNA-fluorescens in situ hybridisering (figur 6b, supplerende figur S9); mt volumen, som bestemt af 3D SIM, blev reduceret med 55 procent sammenlignet med enten epitelceller fra tilstødende, ikke-cystiske tubuli eller PTEC'er fra normale kontrolnyrer. Forskelle i mt-volumen mellem normale kontrol-PTEC'er og PTEC'er fra ikke-cystiske tubuli blev ikke fundet (figur 6c).

Figur 6| Mitokondriel transkriptionsfaktor A (TFAM)-ekspression er reduceret i Pkd1-7-- og CysPkepk-nyrecyster.(a) Relative mRNA-ekspressionsniveauer (fold ændring i forhold til Cre kuldkammerat-kontrol) af mitokondrielle og nuklear-kodede mitokondrielle og glykolytiske gener i Pkd1-7og Cyskidneys (n=3-5).(b)Repræsentative billeder af nyre sektioner fra Pkd1-7og kuldkammerat kontrolmus analyseret i en alder efter fødslen dag (P)22. Vist er immunofluorescens (IF) farvning for TFAM og RNA fluorescerende in situ hybridisering (RNA-FISH) for mitokondrielt kodet cytochrom c oxidase 1 (mt-Co1) og mitokondrielt kodet ATP syntase membran subunit 6 (mt-Atp6) transkripter. Hvide pile identificerer cysteforing af epitelceller med stærkt reduceret TFAM-, mt-Co1- eller mt-Atp6-ekspression. Glomeruli er præget af gl. TFAM-udtrykkende rørformede strukturer identificeres ved rød fluorescens. Stjerner viser rørformede epitelceller med detekterbare mt-Co1- og mt-Atp6-transkripter. 4',6-diamidino-2-phenyindol (DAPI) blev brugt til nuklear farvning (blå fluorescens). Søjler=25 um for IF-billeder og 10 μm for RNA-FISH-billeder. （c） Tredimensionel struktureret belysningsmikroskopi. Vist er billeder af nyresektioner fra Pkd1-7-nyrer analyseret ved histokemi med lotus tetragonolobus lectin (LTL) og IF for cytochrom c oxidase underenhed 4 (COXIV) og spændingsafhængig anion-selektiv kanal 1 (VDAC) ekspression. Mitokondrielt (mt) volumen blev kvantificeret med Imaris-software baseret på COXIV-farvning. Pile viser cysteforing af epitelceller, talskilte viser cystelumina, og asterisker viser ikke-cystiske tubuli. Cysteforing af epitelceller er angivet med stiplede linjer. Søjler=10 μm for venstre panel og 3 μum for højre panel. Data er repræsenteret som middel ± SEM og blev analyseret ved hjælp af Student's t-test *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

At undersøge, om tabet afTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)ekspression er et almindeligt molekylært træk ved human PKD, vi analyserede nefrektomiprøver fra 5 ADPKD-patienter ved immunhistokemi, IF-farvning, RNA-fluorescens in situ-hybridisering og 3D SIM. ReduceretTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)ekspression blev observeret i 75,2 procent ± 7,5 procent af nyrecyster analyseret ved immunhistokemi. Dette var forbundet med en nedsat ekspression af MT-CO1 og MT-ATP6 ved RNA-fluorescens in situ hybridisering (figur 7a, supplerende figur S10); mt volumen i cysteforing af epitelceller blev reduceret med ca. 70 procent som vurderet ved 3D SIM (figur 7b). Tilsammen antydede analysen af ​​2 PKD-musemodeller og humant ADPKD-væv detTFAM(målrettet mitokondriel transkriptionsfaktor A)mangel og mt-depletering er almindelige fund i PKD-væv og vil sandsynligvis påvirke patogenesen af ​​den renale cystiske sygdom.

Figur 7| Mitokondriel transkriptionsfaktor A (TFAM) ekspression i nyrecyster fra patienter med polycystisk nyresygdom er reduceret.(a) Repræsentative billeder af formalinfikserede paraffinindlejrede snit fra normale humane nyrer og nyrer fra polycystisk nyresygdom (PKD)-patienter analyseret ved immunhistokemi for TFAM-ekspression, ved immunfluorescens (IF) for spændingsafhængig anionselektiv kanal 1 (VDAC) ) ekspression og ved RNA fluorescerende in situ hybridisering for mitokondrielt kodet cytochrom c oxidase 1(MT-CO1) og mitokondrielt kodet ATP syntase membran subunit 6(MT-ATP6) mRNA ekspression, pile identificerer cyste foring epitelceller, tal tegn viser lumina , og stjerner viser glomeruli. Bar=100 μm for billeder med lav forstørrelse og 10 um for billeder med høj forstørrelse (b)Repræsentative 3-dimensionelle strukturerede belysningsmikroskopiske billeder af humane PKD-nyresektioner analyseret med IF for VDAC-ekspression.4',{ {17}}diamidino-2-phenylindol (DAPl) blev brugt til nuklear farvning (blå fluorescens). Stiplede linjer markerer tubuli, og talskilte viser rørformet eller cyste lumina. Mitokondriel (mt) volumen blev kvantificeret ved hjælp af Imaris-software (n=5). Bar =4 μm. Data er repræsenteret som middel ± SEM og blev analyseret ved hjælp af Elevens t-test.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

KLIK HER FOR AT DEL Ⅱ