Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Klik her for information om del II (Introduktion, materialer og metoder) i denne artikel.

Nær-encellet proteomisk profilering af det proksimale rør og glomerulus af den normale menneskelige nyre

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Swastika Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* og Minnie M. Sarwal¹* for Kidney Precision Medicine Project (KPMP) konsortiet

¹Division of MultiOrgan Transplantation, Department of Surgery, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

²Pacific Northwest National Laboratory, Biological Sciences Division, Richland, WA, USA

³Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, USA

⁴Institut for patologi, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

Nøgleord:glomerulus, massespektrometri, enkeltcelleanalyse, proteomik,nyre

Molekylære vurderinger på enkeltcelleniveau kan fremskynde biologisk forskning ved at give detaljerede vurderinger af cellulær organisation og vævsheterogenitet i både sygdom og sundhed. Mennesketnyrehar komplekse multicellulære tilstande med varierende funktionalitet, hvoraf meget nu kan udnyttes fuldstændigt med de seneste teknologiske fremskridt inden for vævsproteomik på et næsten enkeltcelleniveau. Vi diskuterer de grundlæggende trin i den første anvendelse af denne massespektrometri (MS) baserede proteomikmetode til analyse af undersektioner af det normale menneskenyre, som en del af Kidney Precision Medicine Project (KPMP). Ved at bruge ~30-40 laserfangede mikrodissekerede nyreceller identificerede vi mere end 2.500 humane proteiner med specificitet tilproksimalt rørformet(PT; n=25 proteiner) og glomerulære (Glom; n=67 proteiner) regioner inyreog deres unikke metaboliske funktioner. Denne pilotundersøgelse giver køreplanen for anvendelsen af ​​vores næsten-enkeltcellede proteomik-arbejdsgang til analyse af andre nyremikrokompartementer i større skala for at optrevle forstyrrelser af nyresubcellulær funktion i den normale nyre såvel som forskellige ætiologier af akut og kronisknyre sygdom.

cistanche kan forbedre nyrefunktionen

Introduktion

Nylige fremskridt inden for molekylær profilering, specifikt transkriptionel analyse på enkeltcelleniveau, kan afdække sjældne cellepopulationer i heterogene kliniske væv, hvilket bidrager til vores forståelse af nyrebiologi og dens molekylære processer (1-7). Der er et udækket behov for at udvikle metoder, der kan give omfattende biologisk information på RNA- og DNA-niveauer og også give mulighed for enkeltcellet proteomisk vævsanalyse.

Proteomiske teknologier kan i modsætning til genomik give funktionel information om cellulære tilstande og regulatoriske netværk (2). En teknologisk udfordring for massespektroskopi (MS) baseret proteomik er begrænsningen af ​​udgangsmateriale. I modsætning til transkriptomik tillader proteomik ikke molekylær amplifikation. Denne factoid har resulteret i væsentlige bestræbelser på at øge den analytiske følsomhed af MS-baseret proteomik, inklusive teknologiminiaturisering og højere effektivitet ved elektrospray-ioniseringskilden (8, 9), således at den analytiske følsomhed nu er tilstrækkelig til at detektere proteiner i enkelt pattedyr celler. På trods af høj analytisk følsomhed har proteomiske applikationer til små prøvevolumener introduceret yderligere udfordringer, såsom ikke-specifik adsorption af proteiner og peptider til overfladerne af reaktionsrør, ineffektiv fordøjelseskinetik, behovet for oprydning og udfordringer med levering. Vores gruppe har for nylig rapporteret om nær-enkeltcellet proteomik (nscProteomics) metoden i HeLa-celler, som giver yderst innovativ og følsom teknologi til proteommålinger af prøver med sub-nanogram mængder af protein fra et lille antal celler (10). Denne metode kræver meget tilpasset prøvebehandlingsudstyr og er vanskelig at overføre til andre forskningslaboratorier i sin nuværende udvikling. Behandler menneskenyrevæv gennem denne pipeline har krævet nøje opmærksomhed på protokoludvikling for at optimere vævsbevaring og celleindfangning.

I denne undersøgelse har vi fokuseret på at give en køreplan for vellykket måling af proteomisk forespørgsel af forskellige underafdelinger afnyrepå næsten-enkeltcelleniveau med følgende leverancer: (i) Vurdering af optimal nyrevævsopsamling og opbevaring for nscProteomics; (ii) Identifikation af den relevante referencestandard for nscProteomics; (iii) Optimering af nyrevævstykkelsen til laser capture microdissection (LCM); (iv) Optimering af LCM-parametre; (v) Beskrivelse af nscProteomics-metoden ved anvendelse af en LC-MS-baseret, fuldautomatisk mikro POTS-metode (μPOTS; Processing in One pot for Trace Samples) (11); (vi) Dataanalyse for nscProteomics.

For at nå de førnævnte opgaver har vi bearbejdet 11 unikke menneskernyrebiopsier og udviklede protokoller og metoder til at indsamle, behandle og udspørge det proteomiske udtryk af menneskernyreprøver af μPOTS. Når det kombineres med meget sensitiv LC-MS, udviser vi en fuldautomatisk μPOTS-metode, der muliggør reproducerbarhed og giver kvantitative proteomiske målinger af ~3,000 proteiner fra 10 til 100 laserfangst mikro-dissektion (LCM) nyreceller, en dækningsniveau kun opnået tidligere for tusindvis af celler (12-17). Denne undersøgelse vil hjælpe til molekylær karakterisering af vævscellulær heterogenitet og patologi i nyrebiopsier fra patienter med forskellige årsager til akut og kronisk nyresygdom. Denne unikke teknologi har potentialet til at opklare proteomisk heterogenitet og unikke proteinmarkører i forskelligenyresygdomsundertyper og understrukturer, der vil korrelere med sygdomspatogenese, prognose og risikostratificering. Undersøgelsen er opsummeret i figur 1.

Figur 1. Workflowet for nær enkeltcellet proteomics (nscProteomics) er optimeret til behandling af menneskernyrevæv. Arbejdsgangen omfatter identifikation af optimalnyrevævsindsamling og -opbevaring, kvalitetskontrollerne for laserfangst mikrodissektion etablering af nscProteomics metode til nyreceller.

Eksperimentelle procedurer

Studere design

Den skematiske repræsentation af de proteomiske undersøgelser udført på 11 unikke menneskelige normalenyrerer vist i figur 2A. I alt 28 massespektrometri (MS)-kørsler blev udført for bulk- og laserindfangning mikro-dissektion (LCM) nscProteomics på parrede glomerulære (Glom) og proksimale viklede tubulære (PT) sektioner. Væv fra de to førstenyrerblev konserveret som FFPE og i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) medium. Nyrevævsproblemer fra 9 flere nyrer blev kun behandlet i OCT (figur 2A).

Figur 2. (A) Et resumé af undersøgelsesprøver og assays. (B) QC-plottet for reproducerbarhed af processen ved hjælp af OCT-væv. Spektraltællingsforskelle mellem proteiner for 2 separate kørsler ved anvendelse af OCT-væv blev plottet mod det gennemsnitlige proteinspektraltal for 1.257 proteiner. I plottet viser den blå linje middelforskel; de røde og grønne linjer viser henholdsvis 2 SD- og 3 SD-grænser. 97,96 procent af proteinerne er inden for den beregnede reproducerbarhedsgrænse på 13,52, hvilket indikerer en høj grad af reproducerbarhed. Det ses også, at inter-run variabiliteten af ​​processen, der involverer OCT-væv, er lavere end for processen, der involverer FFPE-væv (beregnet reproducerbarhedsgrænse: 24,43). (C) Sammenligning af spektraltællefordelinger af 374 almindelige proteiner i OCT og FFPE. Et større antal proteiner fra OCT-væv viser høje spektrale tællinger, mens en højere overvægt af lave spektrale tællinger ses for proteiner fra FFPE-væv. (D) Sammenligning af spektraltællefordelinger af 76 unikke proteiner i FFPE og 244 unikke proteiner i OCT. Den højere overvægt af proteiner med lavt spektralt antal ses i OCT-væv. Dette kan indikere, at OCT-vævsteknik er bedre til påvisning af lavt rigelige proteiner i det aktuelle scenarie. Korrelationskoefficienten mellem proteiner identificeret fra 2 OCT frosne væv var 0.96 (P <>

Indsamling af nyrevævsprøve

Humannyrevævblev indsamlet fra i alt 11 de-identificerede partielle nefrektomier, opnået fra University of California San Francisco (UCSF) og University of Michigan (UM), med godkendt IRB, som en del af et pilotteknologisk feasibility-studie i NIH Kidney Precision Medicine Projekt (KPMP). Kun det sunde område afnyresom bestemt af en uddannet patolog blev brugt til dette formål. Prøver blev anonymiseret med det eneste forbehold, at vævene blev indsamlet fra voksne. For at vurdere den optimale prøveopsamlingsprotokol for teknologien blev ~100 mg væv fra 2 nyrer indledningsvist delt ligeligt og enten forberedt som formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) vævssnit eller frosset i Tissue-Plus™ OCT-forbindelse (Fisher Scientific). Én 5 μm og tre 10 μm tykke på hinanden følgende sektioner blev skåret fra hver OCT-blok med en kryomikrotom og monteret på 1,0 polyethylenterephthalat (PET) membranglas (Zeiss) til glomerulær ogproksimale tubulidissektion. Det 5 μm tykke afsnit blev H&E-farvet til visualisering af større histologiske strukturer. De resterende 10 μm tykke sektioner blev efterladt ufarvede. Alle objektglas blev opbevaret ved -80 grader indtil dissektion.

Cistanche til forbedring af nyredysfunktion

Vurdering af indvirkningen af ​​vævsforsendelse og -behandling på proteomisk output

For at vurdere virkningen af ​​forsinkelser på den proteomiske analyse af OLT frosset væv,nyretissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 timers rejse væk, og behandlet ved det andet center, og omvendt. Bulk proteomics blev udført på to 2 unikkenyrer(nyre #3, #4), anskaffet ved University of Michigan og sendt til 2 forskellige lokationer (Ohio State University og UCSF) til MS-analyse ved brug af samme protokol og MS-parametre på begge steder. Resultaterne af MS-kørslerne blev derefter sammenlignet mellem de 2 steder.

Proteinekstraktion og udfældning

Dette blev udført på både OCT- og FFPE-vævsforberedelsesmetoderne til udvælgelse af den optimale metode til vævsproteomik. OCT-væv blev sektioneret i 10 μm tykke sektioner ved hjælp af en kryomikrotom. For at vælge den minimale mængde væv, der er nødvendig til proteinekstraktion for MS, blev tre krøller (en sektion, der lægges i et Eppendorf-rør i stedet for at spredes på objektglasset), og 5 krøller af frossent væv skåret, optøet og overført til mikrocentrifugerør indeholdende en 5 mm rustfri stålperle (Qiagen), udsat for pattedyrcellelysisbuffer (inklusive Benzonase® Nuclease and Protease Inhibitor Solution; Qiagen), og homogeniseret i en TissueLyser LT (Qiagen) ved 50 r/s i 3 min. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret (Bradford-assay; Thermo Scientific) og opbevaret ved -20 grader indtil brug. Væv opbevaret til<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Trypsin fordøjelse

Ca. 15 0 ug totalt protein (~15 procent af det tilgængelige input) blev udsat for reduktionsmidler (200 mM DTT og 100 mM Tris-HCl) og alkyleringsreagenser (200 mM iodacetamid og 100 mM Tris-HCl) og derefter fortyndet med RNAse/DNAse-frit vand for at reducere urinstofkoncentrationen til 0,6 M. Fire ug svinetrypsin (Sigma) blev tilsat, og prøven fordøjet ved 37 grader. Proteinkoncentration blev kvantificeret (Bradford assay; ThermoScientific), og 10 ug protein blev brugt til MS.

MS for Bulk Proteomics til at vurdere den optimale nyrevævsbehandlingsmetode

Den tryptiske peptidblanding blev syrnet med myresyre, renset med C18 Monospin-søjler og analyseret på Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS/MS blev udført under anvendelse af Higher-Energy C-Trap Dissociation (HCD). Massespektre blev analyseret under anvendelse af Byonic v2.14.27 (Protein Metrics), hvilket muliggjorde 12 ppm massetolerancer. Variable post-translationelle modifikationer blev tilladt, herunder oxidation, methylering, carbamylering og phosphorylering. Proteiner var begrænset til dem, der scorede bedre end en 1 procent falsk opdagelsesrate (FDR). Sammenligninger af proteinoverflod og MS-data blev foretaget for at vælge den optimale metode tilnyrevævsopsamling mellem FFPE og OCT.

Laserfangst mikrodissektion

Ufarvede 5, 10 og 20 μM tykke sektioner monteret på PET-objektglas blev placeret på scenen af ​​Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet (Zeiss) for at teste optimal skæretykkelse. Glomerulær ogproksimale tubuliregioner blev udvalgt ved hjælp af frihåndsværktøjet, og dissektioner blev udført ved 10X objektiv. Sektioner med ~4.580 μm2 areal og 10 uM tykkelse blev fanget, hvilket tegnede sig for ~40 glomerulære celler baseret på den tidligere offentliggjorte formel til estimering af glomerulære celler i en sund voksennyre(18). Forproksimalt rørformetceller, vi fangede ~2.900 μm2 afproksimalt rørformetceller, som tegnede sig for ~36 celler. Udskårne sektioner blev katapulteret i en 200 μL uigennemsigtig klæbende hætte (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) og opbevaret ved -80 grader.

Nær-encellet-proteomik (nscProteomics)

For at solubilisere proteiner opsamlet i capture caps med LCM blev en 10 μL dråbe på 0,1 procent DDM 50 mM Tris pH 8 tilsat direkte til hætten. Prøver blev inkuberet i 30 minutter ved 37 grader i en Eppendorf ThermoTop termomixer for at reducere fordampning, efterfulgt af centrifugering ved 2,000 x g i 1 minut for at overføre lysatet til hætteglasset. Proteiner blev reduceret med 5 mM dithiothreitol og inkuberet ved 37 grader i 30 minutter. Alkylering blev udført ved 10 mM iodacetamid med en 45 minutters inkubation i mørke ved 25 grader. Derefter blev en 10 ng alikvot af Ls-C tilsat efterfulgt af en 3 timers inkubation ved 25 grader. En 10 ng alikvot trypsin blev derefter tilsat efterfulgt af natten over fordøjelse ved 25 grader. De fordøjede peptider blev blandet med en 15 μL alikvot af 18 MΩ vand.

LC-MS platform til de ultra-små prøver

Peptidprøver (25 μL) blev separeret ved hjælp af en 60 cm søjle med en indvendig diameter på 50 μm og en integreret emitter (New Objective). Søjlerne blev pakket internt med 1,7 μm diameter Waters BEH-medier. En 100-min gradient blev produceret ved hjælp af en Dionex Ultimate 3000 RSLC nanopumpe (Thermo Scientific). Dette system blev koblet til et QExactive Plus massespektrometer (Thermo Scientific). Massespektre blev opsamlet fra 300 til 1.800 m/z under anvendelse af en top 12 dataafhængig opsamlingsmetode. MS1-spektre blev opsamlet med en masseopløsning på 35K og MS2 med 17,5K. En maksimal IT på 100 ms blev brugt til at øge identifikationer fra ioner med lav abundance.

Proteomisk dataudtræk

Alle råfiler blev behandlet ved hjælp af MaxQuant (version 1.5.3.30) til funktionsdetektion, databasesøgning og protein/peptid-kvantificering (19) efter indstillinger beskrevet tidligere (10). Tandem massespektre blev søgt i UniProtKB/Swiss-Prot human database (downloadet den 29. december 2018 og indeholdt 20.417 gennemgåede poster). MS proteomics data for nscProteomics er blevet deponeret til ProteomeXchange Consortium via PRIDE (20) partner repository med datasættet identifikatoren PXD015058 og 10.6019/PXD015058.

Dataanalyse

MS-data blev opnået fra kørsler udført ved PNNL (nscProteomics) og Stanford University (bulk proteomics). Til bulk proteomics. Følgende statistiske metoder blev brugt til at vælge den optimalenyrevævsopsamlingsmetode, enten frosset i OLT eller behandlet som FFPE, som vurderet ved kvantitativ vævsmasseproteomik, (i) Proteinudbytte/mg af ækvivalent inputvæv blev beregnet; (ii) MS-reproducerbarhed blev testet på MS-output fra FFPE- og OCT-sektioner fra hver af 2 nyrer, fremstillet af det samme individ ved hjælp af den samme protokol, analyseret på det samme MS-instrument ved hjælp af en fast protokol med få dages mellemrum (21). En reproducerbarhedsgrænse (22) blev brugt til at give en omtrentlig grænse for måleforskelle mellem successive kørsler af en enkelt proces samt et skøn over præcision til sammenligning mellem processer. Korrelationskoefficienten, som gav graden af ​​overensstemmelse mellem successive kørsler (ved anvendelse af det samme væv), blev beregnet; (iii) Proteinoverflod og peptidfragmentstørrelsesfordeling blev beregnet for at vurdere variationer stammende fra proteinnedbrydning, tværbinding på grund af formalin osv. Andre aspekter af QC, inkluderede (iv) vurdering af procesdrift over replikater og tid ved at bruge en fælles puljenyrereference og (v) beregning af bias. Stringent kvantitativ analyse og identifikation af unikke proteiner brugte kun data med proteiner med spektraltal større end eller lig med 5 (23). Fishers eksakte test blev brugt til at vurdere berigelsen af ​​almindelige og unikke proteiner kortlagt mellem to normale humane nyrer (#1 og #2). Baseret på ovenstående analyse (se resultater) blev OCT frosset væv valgt som indsamlingsmetode for alle efterfølgende analyser.

Det næste trin i dataanalysefokuset var at identificere, kvantificere og validere proteinsæt beriget i eller specifikke for de ~10-100 celler opnået fra hver af to udvalgtenyreunderafdelinger—Glom- og PT-regioner, opnået fra sammenyre, i bulk og LCM af OLT frossetnyrevæv(n=9; nyrer #3-11) og drives af nscProteomics.

En {{0}}trins semi-konservativ filtreringstilgang blev vedtaget for at håndtere problemer med manglende/ufuldstændige data, og G-testen (24) blev brugt til at identificere, om dataene manglede tilfældigt (MAR) eller Missing Not At Random (MNAR). Yderligere datapålidelighedsvurdering blev udført ved strengt at udvælge proteiner observeret i mere end eller lig med 50 procent af alle prøver. T-test blev brugt til at identificere for proteiner signifikant berigelse i glomming eller PT, og multiple testkorrektion (Benjamini-Hochberg FDR) med en signifikansgrænse på 0,1 blev anvendt. Til analysens formål er MS-dataene med relativ intensitet (log 2 transformeret) opnået fra Glom, PT og bulkfraktioner fra en enkeltnyreblev anset for at være parret. Vi identificerede proteiner beriget i Glom (med lave niveauer i PT/bulk) og unikke for Glom (fraværende i PT) samt proteiner beriget med PT (med lave niveauer i Glom/bulk) og unikke for PT (fraværende i Glom) . Berigelsesanalyse blev kun udført på data uden manglende værdier i hver gruppe for at øge tilliden. Korrelationen mellem overflodsværdierne af almindelige proteiner blev brugt til at vurdere graden af ​​overensstemmelse mellem berigede sub-rumsproteiner mellem separate kørsler af det samme eksperiment. Vi udførte også krydsvalidering af signifikant berigede proteiner i hvert kompartment ved at parse disse sammenligninger fra unikke prøvesæt mellem 2 forskellige kørsler, kørsel 1 og kørsel 2. Biologisk validering for berigede sub-kompartment (Glom og PT) sæt af proteiner blev udført af forespørgsel på, om kendte underkompartementberigede proteiner kunne lokaliseres tilbage til deres specifikke regioner i offentlige data fra Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Cistanche for symptomer på nyresvigt

Cross-Omics data sammenligning/integration

For at vurdere overensstemmelsen af ​​proteinekspression på RNA-niveau blev data genereret fra enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA Seq) udført på 10 native nefrektomier anvendt, hvoraf 9 overlappede mednyrerbruges i nscProteomics. Til dette blev 10x Genomics Chromium-platform med v3-kemi brugt ved hjælp af metoden optimeret i Sarwal-laboratoriet som et vævsforhørssted (TIS) af KPMP Consortium (et manuskript, der beskriver metoden og resultaterne er under udarbejdelse). Til denne cross-omics-analyse brugte vi transkriptomdata fra 45.411nyreceller opløses i ni hovedcelletyper: Podocytter, mesangiale celler, glomerulært endotel, stroma/interstitium, immunceller,proksimale tubuli, tykt opadgående lem af løkken af ​​Henle, distal/forbindelsesrør og opsamlingskanal. Analyse af enkeltcelledata blev udført ved hjælp af Seurat R-pakken version 2.3.4. Mere dybdegående analyse af disse data er under udvikling (26).

Fra: 'Nær-enkeltcellet proteomikprofilering afProksimal rørformetogGlomerulusaf det normale menneskeNyre' af Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Yinghui Luo4, Yinghui Luo4 Yang4, Wei-Jun Qian2* og Minnie M. Sarwal1* forNyrePrecision Medicine Project (KPMP) konsortium

---ORIGINAL FORSKNINGSartikel Forside. Med., 17. september 2020 |