ISG15-afhængig aktivering af sensoren MDA5 modvirkes af SARS-CoV-2 Papain-lignende protease for at undgå værtens medfødte immunitet
Nov 08, 2023
Aktivering af de RIG-I-lignende receptorer, retinsyre-inducerbart gen I (RIG-I) og melanomdifferentieringsassocieret protein 5 (MDA5) etablerer en antiviral tilstand ved at opregulere interferon (IFN)-stimulerede gener (ISG'er). Blandt disse er ISG15, hvis mekanistiske roller i medfødt immunitet stadig forbliver gådefulde. I denne undersøgelse rapporterer vi, at ISG15-konjugation er afgørende for antivirale IFN-responser medieret af den virale RNA-sensor MDA5. ISGylering af caspaseaktiverings- og rekrutteringsdomænerne af MDA5 fremmer dets oligomerisering og udløser derved aktivering af medfødt immunitet mod en række vira, herunder coronavirus, flavivira og picornavira. Den ISG15-afhængige aktivering af MDA5 antagoniseres gennem direkte de-ISGylering medieret af den papainlignende protease fra SARS-CoV-2, en nyligt opstået coronavirus, der har forårsaget COVID-19-pandemien . Vores arbejde viser en afgørende rolle for ISG15 i det MDA5-medierede antivirale respons og identificerer også en vigtig immunundvigelsesmekanisme for SARS-CoV-2, som kan være målrettet mod udviklingen af nye antivirale midler og vacciner til bekæmpe COVID-19.
cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet
Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity
【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Viral forstyrrelse af værtens immunhomeostase overvåges af det medfødte immunsystem, som er afhængig af receptorer, der registrerer fare- eller patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er) 1-3. De RIG-I-lignende receptorer (RLR'er) RIG-I og MDA5 er afgørende for virusdetektion ved at undersøge cytoplasmaet for virale eller værts-afledte immunstimulerende RNA'er4. Bindingen af RNA til det C-terminale domæne (CTD) og helicase af RIG-I og MDA5 fører til deres signal-primede konformation, der muliggør rekruttering af flere enzymer5. Disse enzymer modificerer RLR'er på flere domæner og steder, og post-translationelle modifikationer (PTM'er) er særligt velundersøgte for caspaseaktiverings- og rekrutteringsdomænerne (CARD'er), signalmodulerne. Proteinphosphatase 1 (PP1) / dephosphorylerer RIG-I og MDA5 CARDs6. I tilfælde af RIG-I fremmer dephosphorylering Lys63-koblet polyubiquitinering af CARD'erne af TRIM25 (tredelt motiv indeholdende 25) og andre E3-ligaser7,8, som stabiliserer den oligomere form af RIG-I, og derved muliggør mitokondriel antiviral -signalerende protein (MAVS) binding. Sammenlignet med dem i RIG-I er de individuelle trin af MDA5-aktivering og kritiske PTM'er involveret mindre godt forstået. RLR-aktivering inducerer produktionen af type I og III IFN'er, som igen udbreder antiviral signalering ved at opregulere ISGs9,10. Blandt disse er ISG15, et ubiquitin-lignende protein, der kan kovalent konjugeres til lysinrester af målproteiner, en PTM-proces kaldet ISGylation11. Selvom ISG15-konjugation er blevet bredt anerkendt for at virke antiviralt12, er mekanismer for værtsprotein-ISGylering, der kunne forklare den brede antivirale restriktionsaktivitet af ISG15, i øjeblikket ukendte. Årsagsagenset til den igangværende COVID-19-pandemi, alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SCoV2), tilhører Coronaviridae-familien, som indeholder adskillige andre humane patogener. Coronaviruss har en enestående evne til at undertrykke IFN-medierede antivirale responser og lav IFN-produktion hos SCoV2-inficerede patienter korreleret med alvorlig sygdom13. Blandt de coronavirale IFN-antagonister er den papainlignende protease (PLpro), som har deubiquitinerende og de-ISGylerende aktiviteter14,15. I denne undersøgelse identificerer vi en væsentlig rolle for ISGylering i MDA5-aktivering. Vi viser yderligere, at SCoV2 PLpro interagerer med MDA5 og antagoniserer ISG15-afhængig MDA5-aktivering via aktiv de-ISGylering, hvilket afslører, at SCoV2 allerede har udviklet sig til at undslippe immunovervågning af MDA5.
Resultater
MDA5, men ikke RIG-I, signalering kræver ISG15.
For at identificere PTM'er af MDA5-KORTENE, der kan regulere MDA5-aktivering, underkastede vi affinitetsoprenset MDA5-2CARD fusioneret til glutathion-S-transferase (GST-MDA5-2CARD), eller GST alene, for væskekromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC) –MS/MS), og fandt, at specifikt GST–MDA5–2CARD co-oprenset med ISG15, som fremstod som to bånd, der migrerede langsommere (med ~15 og 30 kDa) end umodificeret GST–MDA5–2CARD (Udvidet Data) fig. la). Immunblotting (IB) bekræftede, at GST-MDA5-2CARD er modificeret af ISG15 (Udvidede data Fig. 1b). Vi bestemte derefter relevansen af ISG15 for MDA5-induceret signalering. Mens FLAG-MDA5-ekspression i vildtype (WT) muse-embryonale fibroblaster (MEF'er) inducerede IFN-messenger-RNA og protein såvel som Ccl5-transkripter på en dosisafhængig måde, førte FLAG-MDA5-ekspression i Isg15-/- MEF'er til ablerede antiviralt gen og proteinekspression (fig. la og udvidede data fig. 1c). Tilsvarende blev antiviral geninduktion kraftigt formindsket i ISG15 knockout (KO) HeLa (humane) celler sammenlignet med WT kontrolceller (fig. 1b og udvidede data fig. 1d), hvilket udelukker en artsspecifik effekt. I modsætning hertil inducerede FLAG-RIG-I sammenlignelige mængder af udskilt IFN-protein såvel som Ifnb1- og Ccl5-transkripter i Isg15-/- og WT MEF'er (fig. 1a og udvidede data, fig. 1c). IFNB1- og CCL5-transkripter samt IFN-proteinproduktion ved FLAG-RIG-I var ens eller svagt forbedret i ISG15 KO HeLa-celler sammenlignet med WT-celler (fig. 1b og udvidede data, fig. 1d), i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at ISGylering var negativt påvirker RIG-I-signalering16,17
Fig. 1|ISGylering er påkrævet for MDA5, men ikke RIG-I, signalering. a,b, ELISA af IFN- fra supernatanter af MEF'er (WT eller Isg15-/-) (a) og HeLa-celler (WT eller ISG15 KO) (b) transient transficeret med stigende mængder af FLAG-mærket MDA5 eller RIG-I for 40 t. Helcellelysater (WCL'er) blev probet af IB med anti-ISG15, anti-FLAG og anti-actin (belastningskontrol). c, ELISA af IFN- fra supernatanter af WT eller Isg15−/− MEF'er, der blev simuleret stimuleret eller transficeret med EMCV RNA (0.1 eller 0.4 µg ml−1), HMW-poly (I: C) (0,5 µg ml−1 ) eller RABVLe (1 pmol ml−1 ), eller inficeret med SeV (10 hæmagglutinationsenheder (HAU) ml−1 ) i 24 h. d, RT-qPCR-analyse af Ifnb1, Ccl5 og Tnf mRNA i WT og Isg15-/- MEF'er stimuleret som i c. e, IRF3-phosphorylering i WCL'erne af NHLF'er, der blev transficeret med de angivne siRNA'er i 30 timer og derefter spot-stimuleret eller transficeret med EMCV RNA (0,4 µg ml-1) eller RABVLe (1 pmol ml-1) i 6 timer, vurderet ved hjælp af IB med anti-pSer396-IRF3 og anti-IRF3. f, ELISA af IFN- fra supernatanter af NHLF'er, der blev transficeret med de angivne siRNA'er i 30 timer og derefter spot-stimuleret eller transficeret med EMCV RNA (0,4 µg ml-1) eller RABVLe (1 pmol ml-1) eller inficeret med SeV (10 HAU ml-1) i 16 timer. g, ELISA af IFN- fra supernatanterne af PBMC'er, der blev transduceret i 40 timer med de angivne shRNA lentivirale partikler og derefter inficeret med mutEMCV (MOI=10) eller SeV (200 HAU ml-1) i 8 timer. h, RT-qPCR-analyse af IFNA2 og IL-6 mRNA i PBMC'er, der blev transduceret og inficeret som i g. Data repræsenterer mindst to uafhængige eksperimenter med lignende resultater (gennemsnit ± sd af n= 3 biologiske replikater i a–d og f, og middelværdi af n= 2 biologiske replikater i g og h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
Vi testede derefter effekten af ISG15-gendeletion på aktiveringen af endogen MDA5 og RIG-I af deres respektive ligander. IFN-produktion samt IFNB1-, CCL5- og TNF-genekspression induceret ved transfektion af encephalomyocarditis virus (EMCV) RNA eller højmolekylærvægt (HMW)-poly(I:C), som begge overvejende registreres af MDA5, var dybt svækket i Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa og ISG15 KO HAP-1 celler sammenlignet med deres respektive kontrolceller (fig. 1c,d og udvidede data, fig. 1e–g). Det er vigtigt, at ablationen af antiviral geninduktion med EMCV RNA eller HMW-poly(I:C) i ISG15 KO-celler ikke skyldtes ophævet MDA5-genekspression; tværtimod blev MDA5-mRNA-ekspression forbedret i ISG15 KO-celler sammenlignet med WT-celler (Udvidede data Fig. 1f, g). I modsætning til stimulering med MDA5-agonister førte stimulering af Isg15−/− MEF'er og ISG15 KO HeLa-celler ved rabiesvirus leder RNA (RABVLe) transfektion eller Sendai virus (SeV) infektion, som er RIG-I stimuli, til IFN-produktion og antiviral genekspression sammenlignelig med WT-celler (fig. 1c,d og udvidede data, fig. 1e). For at udelukke potentielle klonale virkninger, der kunne være forbundet med ISG15-gen-deleterede celler, udførte vi forbigående gen-silencing-eksperimenter i primære normale humane lungefibroblaster (NHLF'er). ISG15-dæmpning, svarende til MDA5 knockdown, førte til et næsten fuldstændigt tab af phosphorylering af IFN-regulatorisk faktor 3 (IRF3) – et kendetegn for RLR-signalaktivering – efter stimulering med EMCV RNA, men ikke RABVLe ished IFN-produktion samt antiviral transkriptekspression i NHLF'er transficeret med EMCV RNA, men ikke i celler stimuleret med RABVLe eller SeV (fig. 1f og udvidede data, fig. 1h). Små hårnåle (sh)RNA-medieret silencing af ISG15 eller MDA5 i primære humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) reducerede også væsentligt antiviralt protein og transkriptekspression efter infektion med en rekombinant mutant EMCV (mutEMCV), der mangler MDA5-antagonisme18,19, sammenlignet med inficerede PBMC'er transduceret med ikke-målrettet kontrol-shRNA (fig. 1g, h og udvidede data fig. 1i). I modsætning hertil påvirkede ISG15- eller MDA5-depletering ikke cytokinresponser i PBMC'er efter SeV-infektion (fig. 1g, h og udvidede data, fig. 1i). Disse resultater viser, at ISG15 er afgørende for immunsignalering af MDA5, men ikke RIG-I. MDA5-KORTET er ISGyleret ved Lys23 og Lys43.
cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet
For at bekræfte vores MS-analyse, der identificerede MDA5-2CARD ISGylering, testede vi først, om endogen MDA5 også er modificeret af ISG15. Endogent MDA5 blev robust ISGyleret i celler transficeret med HMW-poly(I:C) eller inficeret med dengue (DENV) eller Zika (ZIKV) virus, der registreres af MDA5 (ref. 5) (fig. 2a). Navnlig blev endogen MDA5 også ISGyleret i uinficerede celler, dog i meget lave niveauer (Udvidede data Fig. 2a), hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund om, at mange værtsproteiner også er ISGyleret ved lave niveauer under normale (uinficerede) forhold20. I celler behandlet med anti-IFNAR2 for at blokere IFNAR-signal-medieret ISG-opregulering førte ISG15- eller MDA5-silencing til en sammenlignelig reduktion af IFNB1-genekspression efter mutEMCV-infektion (Udvidet Data Fig. 2b), hvilket indikerer, at ISG15-afhængig MDA5-signalering forekommer selv i fravær af IFNAR-signalering.
t MDA5A2CARD (indeholdende helicase og CTD) er det primære sted for MDA5 ISGylering, der viser to fremtrædende bånd for ISGylated 2CARD (fig. 2b). Rekonstitution af ISG15 KO HeLa-celler med enten WT ISG15 eller en ikke-konjugerbar ISG15-mutant, hvori de to glyciner, der er nødvendige for konjugering, blev erstattet med alanin (ISG15-AA)21, viste kovalent ISG15-konjugation (fig. 2c) . Mutation af individuelle lysinrester i GST-MDA5-2CARD til arginin afslørede, at enkeltstedsmutation af Lys23 og Lys43 mærkbart reducerede ISGylering (Udvidede data Fig. 2c), hvorimod deres kombinerede mutation (Lys23Arg/Lys43Arg) næsten ophævede ISGylering (Fig. 2d) ). Fuldlængde FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg viste også markant formindsket ISGylering (fig. 2e og udvidede data fig. 2d); den resterende ISGylering set i FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg skyldes sandsynligvis yderligere mindre steder i 2CARD og/eller Δ2CARD. Det skal bemærkes, at Lys23Arg/Lys43Arg-mutationen ikke påvirkede MDA5-2CARD SUMOylation5 (Udvidede data Fig. 2e). Ydermere, mens RIG-I-2CARD var robust ubiquitineret (hvilket repræsenterer kovalent Lys63-linked ubiquitination7), viste hverken MDA5-2CARD WT eller Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten påviselige niveauer af ubiquitinering (Udvidet data Fig. 2f). Samlet indikerer disse resultater, at MDA5-KORTENE gennemgår ISGylering på to hovedsteder, Lys23 og Lys43.
KORT ISGylering er påkrævet for MDA5-aktivering.
Ved sammenligning af deres signaltransducerende evne viste MDA5–2CARD Lys23Arg og Lys43Arg enkeltstedsmutanter delvist reduceret IFN-promotoraktivering sammenlignet med WT MDA5–2CARD, hvorimod Lys23Arg/Lys43Arg mutanten havde en dybt reduceret signalaktivitet, som var næsten lige så stærk som for de signaleringsdefekte mutanter Ser88Glu og Ser88Asp6 (udvidede data, fig. 2g). I modsætning hertil viste en mutant, hvor Lys68, som er den lysinrest, der er mest proksimalt for Lys43 og Lys23, var substitueret med arginin (Lys68Arg), sammenlignelig ISG15-konjugation og signaleringsevne til WT 2CARD (Udvidet data Fig. 2c,g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, i modsætning til WT MDA5–2CARD, kunne heller ikke inducere IRF3-dimerisering (Udvidet data Fig. 2h). FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg eller Lys23Arg/Lys43Arg viste også reducerede eller næsten ophævede IFN-promotoraktiverende evner sammenlignet med FLAG-MDA5 WT (fig. 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg viste en dyb signaleringsdefekt, selv når den blev udtrykt i høje mængder, hvorimod WT MDA5 inducerede antivirale transkripter på en dosisafhængig måde (fig. 2g). I overensstemmelse hermed blev STAT1-phosphorylering, et kendetegn for IFNAR-signalering, såvel som ISG-proteinekspression stærkt induceret af MDA5 WT, men ikke Lys23Arg/Lys43Arg (fig. 2h). Komplementering af MDA5-genredigerede humane astrocytter (SVGA'er) med MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg eller Ser88Glu førte til stærkt formindskede IFNB1-, CCL5- og ISG-transkripter sammenlignet med celler, der udtrykker WT MDA5 (fig. 2i og udvidede 2i-data) . Disse resultater viser, at ISGylering ved Lys23 og Lys43 er afgørende for MDA5-medierede cytokinresponser.
cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet
Dephosphorylering af PP1 regulerer MDA5 ISGylering.
I lighed med RIG-I phosphoryleres MDA5 i CARD'erne i uinficerede celler, hvilket forhindrer autoaktivering; dephosphorylering af RIG-I og MDA5 af PP1 / er afgørende for at frigøre RLR'er fra deres signaleringsundertrykte tilstande6,22-24. Dephosphorylering af RIG-I muliggør Lys63-koblet ubiquitinering af CARD'erne, hvilket fremmer RIG-I multimerisering og signalering5. Detaljerne om, hvordan CARD-dephosphorylering (ved Ser88) udløser MDA5-aktivering, er forblevet uhåndgribelige, og derfor testede vi, om dephosphorylering regulerer MDA5 ISGylering. Silencing af PP1 / stærkt formindsket MDA5–2CARD ISGylering (Udvidede data Fig. 3a). Desuden havde de phosphomimetiske Ser88Glu- og Ser88Asp-mutanter reduceret ISGylering, hvorimod phospho-null Ser88Ala-mutanten viste stærkere ISGylering end WT MDA5-2CARD (Udvidede data Fig. 3b). Omvendt havde MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg sammenlignelig Ser88-phosphorylering (udvidede data, fig. 3c). Tilsammen tyder disse data på, at MDA5-dephosphorylering ved Ser88 går forud for CARD ISGylering. Vi gjorde derefter brug af mæslingevirus V-protein (MeV-V), som modvirker MDA5 Ser88-dephosphorylering gennem PP1 / antagonisme25. MeV-V-ekspression øgede Ser88-phosphoryleringen (indikerende for ableret dephosphorylering) af GST-MDA5-2CARD eller FLAG-MDA5 på en dosisafhængig måde, som tidligere vist25. Forstærket phosphorylering med MeV-V korreleret med et fald i ISGylering (Udvidede data Fig. 3d,e). I modsætning til WT MeV-V udviste en mutant MeV-V, der har ophævet PP1-binding og MDA5-dephosphoryleringsantagonisme (MeV-VΔtail)25, ringe effekt på MDA5-2CARD ISGylering (udvidede data) Fig. 3f), hvilket styrker inhiberingen af ISGylering, der primært skyldes PP1-hæmning, og ikke andre antagonistiske virkninger, af MeV-V. V-proteinerne fra Nipah- og Hendra-virus (NiV-V og HeV-V) forbedrede også MDA5 Ser88-phosphorylering og dæmpede tilsvarende MDA5 ISGylering (Udvidet data Fig. 3g,h), hvilket tyder på, at adskillige paramyxovirale V-proteiner hæmmer MDA5 ISGylering gennem manipulation af Ser88-phosphorylering, selvom de præcise mekanismer for individuelle V-proteiner stadig mangler at blive bestemt. Tilsammen tyder disse data på, at MDA5 CARD ISGylering er afhængig af dephosphorylering ved Ser88.
ISGylering fremmer MDA5-samlinger af højere orden.
RLR-aktivering kræver RNA-binding, RLR-oligomerisering og deres translokation fra cytosolen til mitokondrier for interaktion med MAVS5. For at belyse mekanismen, hvorved ISGylering påvirker MDA5-aktivitet, undersøgte vi først, om ISGylering påvirker RNA-binding. Endogent MDA5 oprenset fra WT eller Isg15−/− MEF'er interagerede lige så godt med HMW-poly(I:C) in vitro (Udvidet data Fig. 4a). MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg viste sammenlignelig binding til HMW-poly(I:C), hvilket indikerer, at ISGylering ikke påvirker MDA5's RNA-bindingsevne (udvidede data, fig. 4b). Da vi overvågede translokationen af MDA5 fra cytosolen til mitokondrier efter EMCV RNA-stimulering, fandt vi ud af, at ISG15-silencing, men ikke so.C-transfektion, afskaffede MDA5-translokation (fig. 3a). I modsætning hertil var RIG-I-translokation efter RABVLe-transfektion effektiv i både ISG15-depleteret og si. C-transficerede celler (fig. 3b). Disse data indikerede, at ISGylering regulerer MDA5-translokation eller et trin opstrøms for det. Da cytosol-til-mitokondrier-translokationen af MDA5 kræver interaktion med 14-3-3η26, sammenlignede vi 14-3-3η-binding af WT og mutant MDA5. MDA5 Lys23Arg/Lys43Args evne til at binde 14-3-3η var den samme som WT MDA5 eller Lys68Arg-mutanten (udvidet data, fig. 4c). Men hvor EMCV RNA-stimulering effektivt inducerede MDA5-oligomerisering i WT MEF'er, blev dannelsen af MDA5-oligomerer fjernet i ISG-15--mangelfulde MEF'er (fig. 3c). ISG15-knockdown i 293T-celler afskaffede også oligomeriseringen af FLAG-MDA5-2CARD (fig. 3d). Omvendt forbedrede co-ekspression af ISGyleringsmaskinkomponenterne, Ube1L og UbcH8, kraftigt MDA5-2CARD oligomerisering i si. C-transficerede celler, men ikke i ISG15-depleterede celler (fig. 3d), hvilket indikerer, at ISGylering er påkrævet for MDA5-oligomerdannelse. Til støtte for dette koncept viste FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg næsten ophævet oligomerisering, hvorimod WT MDA5 oligomeriserede effektivt (fig. 3e). Vi sammenlignede også effekten af Lys23 Arg/Lys43Arg-mutationen med effekten af oligomeriseringsforstyrrende mutationer, der lokaliseres enten til grænsefladen mellem MDA5-monomerer og hæmmer RNA-bindingsmedieret MDA5-filamentering (Ile841Arg/Glu842Arg og Asp848Ala/Phe849,Phe849Ala,Phe849,288) eller til KORTENE (Gly74Ala/Trp75Ala) og forstyrre 2CARD-oligomerisering27. I modsætning til WT MDA5 udviste Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten, svarende til MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, mangelfuld oligomerisering og ophævede i overensstemmelse hermed IFN-promotoraktiverende evne (fig. 3f, g). Introduktion af Lys23Arg/Lys43Arg i Ile841Arg/Glu842Arg- eller Asp848Ala/Phe849Ala-baggrunden, hvoraf begge i sig selv reducerede MDA5-oligomerisering og signalering, ophævede også MDA5-oligomerdannelse og IFN-induktion (fig. 3f). Da LGP2 letter MDA5-kernedannelse på dobbeltstrenget RNA og derved MDA5-oligomerisering29,30, sammenlignede vi LGP2-bindingen af MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg interagerede med LGP2 lige så effektivt som WT MDA5 (Udvidet Data Fig. 4d), hvilket styrker forslaget om, at CARD ISGylering fremmer MDA5-oligomerisering uafhængigt af RNA-bindingsmedieret filamentering. Samlet fastslår disse resultater, at ISGylering letter CARD-oligomerisering og MDA5-samlinger af højere orden.
Fig. 2|MDA5-aktivering kræver ISGylering ved Lys23 og Lys43. en endogen MDA5 ISGylering i NHLF'er, der blev simuleret behandlet, transficeret med HMW-poly(I:C) (0.1 µg ml−1) i 40 timer (venstre) eller inficeret med DENV eller ZIKV (MOI {{ 10}} for hver) i 48 timer (til højre), bestemt ved IP med anti-MDA5 (eller en IgG-isotypekontrol) og IB med anti-ISG15. b, ISGylering af FLAG-mærket MDA5-2CARD og MDA5Δ2CARD i forbigående transficerede HEK293T-celler, der også udtrykte V5-ISG15, HA-Ube1L og FLAG-UbcH8, vurderet af FLAG PD og IB med anti-V5 ved 40 timer efter transfektion. c, Endogen MDA5 ISGylering i ISG15 KO HeLa-celler stabilt rekonstitueret med vektor, WT ISG15 eller ISG15-AA og co-transficeret med HA–Ube1L og FLAG–UbcH8 efter IFN-behandling (1,000 U ml−1) i 24 timer, bestemt ved IP med anti-MDA5 og IB med anti-ISG15. d, ISGylering af GST-MDA5-2CARD WT og Lys23Arg/Lys43Arg i HEK293T-celler, der blev co-transficeret med V5-ISG15, HA-Ube1L og FLAG-UbcH8 i 24 timer, bestemt af GST PD og IB med anti-V5. e, ISGylering af FLAG-MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg i HEK293T-celler, der var co-transficeret med V5-ISG15, HA-Ube1L og FLAG-UbcH8, bestemt af FLAG PD og IB med anti-V5. f, IFN-luciferase-reporteraktivitet i HEK293T-celler, der blev transficeret i 40 timer med vektor, FLAG-MDA5 WT eller mutanter. Luciferaseværdier præsenteres som fold-induktion i forhold til værdierne for vektortransficerede celler, sat til 1. WCL'er blev probet af IB med anti-FLAG og anti-actin. g, RT-qPCR-analyse af IFNB1- og CCL5-mRNA i HEK293T-celler, der var forbigående transficeret med enten vektor eller stigende mængder af FLAG-MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg. h, STAT1-phosphorylering og ISG (IFIT1 og -2) proteinoverflod i WCL'erne af HEK293T-celler, der var forbigående transficeret med vektor eller FLAG-MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, bestemt af IB. I, RT-qPCR-analyse af de angivne antivirale gener i MDA5 KO SVGA'er, der var forbigående rekonstitueret med enten tom vektor eller FLAG-mærket MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg eller Ser88Glu. Data repræsenterer mindst to uafhængige eksperimenter med lignende resultater (gennemsnit ± sd af n=3 biologiske replikater i f, g og i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Fig. 3|CARD ISGylation fremmer dannelsen af højere-ordens MDA5-samlinger. a,b, Cytosol-mitokondrier fraktionering af WCL'er fra NHLF'er, der blev transficeret i 30 timer med ikke-målrettet kontrol siRNA (si. C) eller ISG15-specifikt siRNA (si.ISG15), og derefter mock-behandlet eller transficeret med EMCV RNA (0,4 µg ml−1) (a) eller RABVLe (1 pmol ml−1) (b) i 16 timer. IB blev udført med anti-MDA5 (a), anti-RIG-I (b), anti-ISG15 og anti-actin (a og b). -Tubulin og MAVS fungerede som renhedsmarkører for henholdsvis den cytosoliske og mitokondrielle fraktion (a og b). c, Endogen MDA5-oligomerisering i WT og Isg15-/- MEF'er, der blev transficeret med EMCV RNA (0,5 µg ml-1) i 16 timer og vurderet ved SDD-AGE og IB med anti-MDA5. WCL'er blev yderligere analyseret ved SDS-PAGE og probet af IB med anti-MDA5 og anti-actin. d, Oligomerisering af FLAG-MDA5-2CARD i HEK293T-celler, der blev transficeret med de angivne siRNA'er, enten med eller uden HA-Ube1L og FLAG-UbcH8 i 48 timer, bestemt ved NativePAGE og IB med anti-FLAG. WCL'er blev yderligere analyseret ved SDS-PAGE og probet af IB med anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15 og anti-actin. e, Oligomerisering af FLAG-MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg i forbigående transficerede MDA5 KO HEK293-celler, vurderet ved SDD-AGE og IB med anti-FLAG. WCL'er blev yderligere analyseret ved SDS-PAGE og IB med anti-FLAG og anti-actin. f, Oligomerisering af FLAG-mærket MDA5 WT og mutanter i forbigående transficerede MDA5 KO HEK293-celler, vurderet ved NativePAGE og IB med anti-MDA5. WCL'er blev yderligere analyseret ved SDS-PAGE og probet af IB med anti-MDA5 og anti-actin. g, IFN-luciferase-reporteraktivitet i MDA5 KO HEK293-celler, der blev transficeret i 24 timer med enten tom vektor eller FLAG-mærket MDA5 WT eller mutanter. Luciferaseaktivitet præsenteres som fold-induktion i forhold til værdierne for vektortransficerede celler, sat til 1. Data repræsenterer mindst to uafhængige eksperimenter med lignende resultater (gennemsnit ± sd af n= 3 biologiske replikater i g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
ISGyleringsafhængig MDA5-signalering begrænser virusreplikation.
Vi vurderede derefter, om ISGylering af MDA5 er påkrævet for dets evne til at begrænse virusreplikation. FLAG-MDA5 WT, men ikke Lys23Arg/Lys43Arg, hæmmede kraftigt (med ~2log) EMCV-replikation (fig. 4a). Tilsvarende begrænsede MDA5 KO HEK293-celler rekonstitueret med WT MDA5, men ikke celler komplementeret med Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten, effektivt DENV-replikation (fig. 4b). Vi rekonstituerede også MDA5 KO-astrocyte SVGA'er, en fysiologisk relevant celletype for ZIKV-infektion, med enten vektor eller MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, og vurderede derefter ZIKV-replikation over et 40-h tidsforløb. ZIKV-replikation blev svækket ~100-fold i celler rekonstitueret med WT MDA5 sammenlignet med vektor-udtrykkende celler. I modsætning hertil begrænsede celler komplementeret med MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ikke ZIKV, svarende til celler, der udtrykker MDA5 Ser88Glu (fig. 4c). WT MDA5, men ikke Lys23Arg/Lys43Arg, begrænsede også SCoV2-replikation, dog i mindre grad end det, der ses for de andre testede vira (fig. 4d).
Fig. 4|ISGylering er påkrævet for viral begrænsning af MDA5. EMCV-titre i supernatanten af HEK293T-celler, der blev transficeret i 40 timer med enten vektor eller FLAG-MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg og derefter inficeret med EMCV (MOI=0.001) i 24 h, bestemt ved TCID50-assay. b, procentdel af DENV-inficerede MDA5 KO HEK293-celler, der blev transficeret i 24 timer med enten vektor eller FLAG-MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg og derefter spotbehandlet eller inficeret med DENV (MOI=5) i 48 timer , vurderet af FACS under anvendelse af anti-flavivirus E (4G2). SSC, sidespredning. c, ZIKV-titre i supernatanten af MDA5 KO SVGA'er, der blev transficeret i 30 timer med vektor- eller FLAG-mærket MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg eller Ser88Glu og derefter inficeret med ZIKV (MOI=0.1) i de angivne tidspunkter bestemt ved plakassay. pfu, plakdannende enheder; hpi, timer efter infektion. d, SCoV2-titre i supernatanten af HEK293T-hACE2-celler, der blev transficeret i 24 timer med enten tom vektor eller FLAG-MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg og derefter inficeret med SCoV2 (MOI=0.5) i 24 h, bestemt ved plakassay. e, Skematisk af den eksperimentelle tilgang til at 'afkoble' rollen som ISG15 i MDA5-medieret IFN-induktion fra dens rolle i at dæmpe IFNAR-signalering. sup. supernatant. f, NHLF-"donor"-celler blev transficeret i 40 timer med de angivne siRNA'er og derefter inficeret med mutEMCV (MOI=0.1) i 16 timer. Cellesupernatanter blev UV-inaktiveret og overført til Vero-"recipient"-celler. Efter 24 timer blev celler inficeret med ZIKV (MOI=0.002-2) i 72 timer, og ZIKV-positive celler blev bestemt ved immunfarvning med anti-flavivirus E (4G2) og TrueBlue peroxidase-substrat. g, RIG-I KO HEK293 'donor' celler blev transficeret med si. C eller si.ISG15 sammen med enten vektor eller FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, i 24 timer, efterfulgt af EMCV-infektion (MOI=0.001) i 16 timer. UV-inaktiverede cellesupernatanter blev overført til Vero 'recipient' celler i 24 timer efterfulgt af infektion med EMCV (MOI=0.001-0.1) i 40 timer. EMCV-inducerede cytopatiske effekter blev visualiseret ved Coomassie Blue-farvning. Data repræsenterer mindst to uafhængige eksperimenter med lignende resultater (gennemsnit ± sd af n=3 biologiske replikater i a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Vi bestemte derefter virkningen af ISG15-silencing på MDA5's evne til at inhibere virusreplikation. Selvom MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg ikke kunne undertrykke EMCV-replikation uanset ISG15-silencing, begrænsede WT MDA5 effektivt EMCV-replikation i si. C-transficerede celler og, uventet, også i ISG15-depleterede celler (Udvidet Data Fig. 5a). I en udforskning af den underliggende mekanisme for disse uventede resultater fandt vi, at de EMCV-inficerede celler, der udtrykte WT MDA5, havde markant forhøjede niveauer af ISG-proteinekspression, når ISG15 blev tavset sammenlignet med inficerede celler transficeret med WT MDA5 og si. C (Udvidede data, fig. 5b). Tilsvarende blev forhøjet ISG-transkript og proteinekspression observeret i ISG-15--mangelfulde celler, der var transficeret med EMCV-RNA eller inficeret med mutEMCV, på trods af ophævelse af IFN-induktion (udvidede data, fig. 5c,d). I modsætning hertil ophævede MDA5-knockdown både IFN- og ISG-proteinekspression som forventet (Udvidede data, fig. 5d). Vi bemærkede, at proteinoverfloden af USP18, et deubiquitinerende enzym, der negativt regulerer IFNAR-signalering31, var stærkt formindsket i ISG15-depleterede celler efter EMCV-infektion sammenlignet med inficerede celler, der var transficeret med si. C- eller MDA5--specifikt siRNA (Udvidet Data Fig. 5b,d), som er i overensstemmelse med ISG15's rapporterede rolle i at forhindre USP18-nedbrydning32. Tilsammen tyder disse data på, at i eksperimentelle indstillinger for ISG15-genmålretning (det vil sige silencing eller KO) maskeres den antivirale effekt af MDA5 ISGylering af afvigende ISG-opregulering på grund af ablationen af ISG15's hæmmende effekt på IFNAR-signalering.
Fig. 5|SCoV2 PLpro binder til og de-ISGylerer MDA5–2CARD. en båndrepræsentation af krystalstrukturen af SCoV2 PLpro: ISG15-komplekset (Protein Data Bank, accessionsnr. 6YVA). Nøglerester, der medierer sted 1-interaktion (Asn156 og Arg166/Glu167) eller sted 2-interaktion (Phe69) i PLpro, såvel som dets katalytisk aktive sted (Cys111), er angivet. b, ISGylering af GST–MDA5–2CARD i HEK293T-celler, der blev co-transficeret i 20 timer med vektor eller V5-mærket SCoV2 PLpro WT eller mutanter, sammen med FLAG–ISG15, HA–Ube1L og FLAG–UbcH8, bestemt af GST PD og IB med anti-FLAG og anti-GST. WCL'er blev probet af IB med anti-V5, anti-HA, anti-FLAG og anti-actin. c, Binding af HA-mærket MDA5 eller RIG-I til V5-mærket SCoV2– PLpro eller FLAG-mærket MeV-V (positiv kontrol) i forbigående transficerede HEK293T-celler, bestemt af HA PD og IB med anti-V5 eller anti-FLAG og anti-HA. WCL'er blev probet af IB med anti-V5 og anti-FLAG. d, Oligomerisering af FLAG-MDA5-2CARD i HEK293T-celler, der var co-transficeret med vektor, eller V5-mærket SCoV2 PLpro WT eller Cys111Ala i 24 timer, vurderet ved NativePAGE og IB med anti-FLAG. WCL'er blev yderligere analyseret ved SDS-PAGE og probet af IB med anti-FLAG, anti-V5 og anti-actin. e, ISGylering af GST-MDA5-2CARD i HEK293T-celler, der også udtrykte FLAG-ISG15, HA-Ube1L og FLAG-UbcH8, og blev co-transficeret i 40 timer med vektor eller det angivne V5-mærkede coronavirale PLpro proteiner, bestemt af GST PD og IB med anti-FLAG, anti-V5 og anti-GST. Data repræsenterer mindst to uafhængige eksperimenter med lignende resultater.
Vi anvendte derefter et virusbeskyttelsesassay, der eksperimentelt afkobler MDA5-signalering i virusinficerede celler fra nedstrøms IFNAR-signalering i de samme celler (fig. 4e). Supernatanter fra mutEMCV-inficerede 'donor'-celler, der enten var si. C transficeret, eller udtømt for enten ISG15 eller MDA5, blev ultraviolet (UV) inaktiveret og derefter overført til uinficerede "modtager"-celler. 'Primede' modtagerceller blev derefter inficeret med ZIKV for direkte at overvåge den antivirale effekt af MDA5-medieret IFN-produktion af donorceller. Hvorimod supernatanterne fra si. C-transficerede "donor"-celler hæmmede kraftigt ZIKV-replikation, og supernatanterne fra ISG15- eller MDA5-knockdown-celler begrænsede ZIKV-infektionen minimalt (fig. 4f). Tilsvarende blev kultursupernatanterne fra EMCV-inficerede donorceller transficeret med WT MDA5 sammen med si. C førte til større beskyttelse af modtagerceller mod den virale udfordring end den fra celler, der udtrykker WT MDA5 og udtømt for ISG15 (fig. 4g). Samlet viser disse data, at ISGylering er vigtig for MDA5-medieret begrænsning af en række RNA-vira.
Fig. 6|SCoV2 PLpro hæmmer ISG15-medieret MDA5-signalering via dets de-ISGylase-aktivitet. a, RT-qPCR-analyse af IFNB1-, IFNL1-, ISG15-, MDA5- og RIG-I-transkripter i NHLF'er, der blev transficeret med de angivne siRNA'er i 40 timer og derefter transficeret med mock-RNA eller SCoV2-RNA (0,4 µg ml −1) i 24 timer. b, binding af SCoV2 Nsp3 til endogen MDA5 i A549-hACE2-celler, der var inficeret med SCoV2 (MOI=0.5) i 24 timer, bestemt ved IP med anti-MDA5 (eller en IgG-isotypekontrol) efterfulgt af IB med anti-Nsp3 og anti-MDA5. WCL'er blev probet af IB med anti-Nsp3 og anti-actin. c, Endogen MDA5 ISGylering i A549-hACE2-celler, der var falske inficerede eller inficerede med SCoV2 (MOI=0.5) i 40 timer i nærværelse af PLpro-hæmmer (GRL-0617; 50 µM) eller vehikel kontrol (dimethylsulfoxid), bestemt ved IP med anti-MDA5 (eller en IgG isotype kontrol), efterfulgt af IB med anti-ISG15 og anti-MDA5. Proteinoverflod af IFIT1, RSAD2, ISG15 og actin i WCL'erne blev undersøgt af IB. Effektiv virusreplikation blev verificeret af IB med anti-Nsp3 og anti-Spike (S). d, RT-qPCR-analyse af IFNB1-, CCL5- og IFIT1-transkripter og EMCV genomisk RNA (gRNA), i HeLa-celler, der var forbigående transficeret i 24 timer med vektor eller V5-SCoV2 PLpro WT eller mutanter og derefter inficeret med mutEMCV (MOI=0.5) i 12 timer. e, EMCV-titere i supernatanten af RIG-I KO HEK293-celler, der var forbigående transficeret i 24 timer med vektor eller FLAG-MDA5, sammen med V5-mærket SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala eller Arg166Ser/Glu167Arg og derefter inficeret, med EMCV (MOI=0.001) i 16 timer, bestemt ved plakassay. f, Proteinoverflod af de angivne ISG'er i WCL'erne fra eksperimentet i e, bestemt ved IB med de angivne antistoffer. Data repræsenterer mindst to uafhængige eksperimenter med lignende resultater (gennemsnit ± sd af n=3 biologiske replikater i a, d og e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro retter sig mod MDA5 til de-ISGylering.
Coronaviruss såsom SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV og det nyligt opståede SCoV2 koder for en PLpro, der medierer viral polyproteinspaltning33. Derudover har PLpro deubiquitinerende og de-ISGylerende aktiviteter. SCoV2 PLpro blev for nylig vist at modulere antivirale responser primært via dets de-ISGylase-aktivitet15. Da MDA5 er kendt for at være en vigtig sensor til påvisning af coronavirus34,35, og fordi vores data viste, at ISGylering er påkrævet for MDA{10}}medieret virusrestriktion, undersøgte vi, om SCoV2 PLpro enzymatisk fjerner MDA5 ISGylering for at antagonisere medfødt immunitet. SCoV2 PLpro WT, men ikke dens katalytisk inaktive mutant (PLpro Cys111Ala)15, afskaffede ISGyleringen af GST-MDA5-2CARD og FLAG-MDA5 (fig. 5a, b og udvidede data fig. 6a). PLpro Asn156Glu- og Arg166Ser/Glu167Arg-mutanterne, som er marginalt og alvorligt svækket i ISG15-binding ved 'site 1'-grænsefladen, henholdsvis14,36, påvirkede ISGylering en smule eller ej. I modsætning hertil er PLpro Phe69Ala, hvor 'sted 2'-grænsefladen, der fortrinsvis bestemmer binding til ubiquitin, men ikke ISG15, afbrudt14,36, formindsket MDA5 ISGylering lige så kraftigt som WT PLpro (fig. 5a,b og udvidede data fig. 6a) ). SCoV2 PLpro undertrykte dog ikke RIG-I–2CARD ubiquitinering (Udvidede data Fig. 6b). Vi fandt ud af, at PLpro interagerede specifikt med MDA5, men ikke RIG-I, ligesom MeV-V, der binder MDA5 og fungerede som en kontrol37 (fig. 5c). Lave mængder af PLpro hæmmede signalering af MDA5, men ikke RIG-I, hvorimod højere mængder af PLpro undertrykte antiviral signalering af begge RLR'er (udvidede data, fig. 6c). Dette styrker MDA5 som et direkte mål for PLpro. De-ISGylering af IRF3 er sandsynligvis årsag til den hæmmende effekt, som højere doser af PLpro har på RLR-signalering15,38. Når man undersøgte effekten af PLpro på MDA5-2CARD-oligomerisering, blokerede PLpro WT, men ikke Cys111Ala, effektivt MDA5-2CARD-oligomeriseringen (fig. 5d), hvilket indikerer, at SCoV2 PLpro hæmmer den ISGyleringsafhængige MDA5-oligomer-dannelse via dens enzymaktivitet. PLpro-enzymerne fra de beslægtede -coronavirus, SCoV, MERS–CoV og murine hepatitisvirus (MHV) såvel som af -coronavirus HCoV-NL63 (NL63) bandt også til og reducerede effektivt MDA5–2CARD ISGylering (fig. 5e). , hvilket tyder på, at MDA5-antagonisme af PLpro kan være vidt bevaret blandt coronavirus.
cistanche planteforøgende immunsystem
SCoV2 PLpro antagoniserer ISG15-afhængig MDA5-signalering.
Vi bestemte derefter relevansen af ISG15-afhængig MDA5-signalering for antiviral cytokininduktion fremkaldt af SCoV2. Da SCoV2-infektion er kendt for minimalt at inducere type I IFN'er på grund af effektive virale antagonismer39, isolerede vi totalt RNA fra SCoV2-inficerede celler og gentransficerede det derefter ind i celler for at stimulere medfødt immunsignalering. SCoV2-RNA, men ikke RNA fra falske-behandlede celler, inducerede robust IFN-transkripter; denne induktion blev dog markant formindsket, når ISG15 eller MDA5 blev dæmpet (fig. 6a). RIG-I knockdown påvirkede ikke negativt den antivirale genekspression fremkaldt af SCoV2 RNA, hvilket indikerer, at SCoV2 RNA-PAMP'er primært registreres af ISG15-MDA5 aksen (fig. 6a).
Vi fandt, at SCoV2 ikke-strukturelt protein 3 (Nsp3), hvori PLpro ligger, let interagerede med endogen MDA5 under autentisk SCoV2-infektion (fig. 6b). Endogen MDA5 ISGylering var ikke-detekterbar i SCoV2-inficerede celler, selvom virussen udløste ISG15-ekspression; I inficerede celler behandlet med en specifik PLpro-inhibitor15 var MDA5 ISGylering og nedstrøms ISG-induktion imidlertid stærkt forbedret (fig. 6c), hvilket understøtter forslaget om, at PLpro effektivt undertrykker MDA5 ISGylering og signalering under levende SCoV2-infektion. Vi undersøgte derefter effekten af WT og mutant PLpro på aktiveringen af endogen MDA5 under mutEMCV-infektion. I overensstemmelse med deres effekt på MDA5 ISGylering (fig. 5b og udvidede data fig. 6a), forhindrede SCoV2 PLpro WT og Phe69Ala antiviral transkriptinduktion, hvorimod MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, svarende til Cys111Ala-antivirusgenet, ikke påvirkede (antivirusgenet Cys111Fig. 6d). I overensstemmelse med dette blev mutEMCV-replikation forøget i celler, der udtrykker PLpro WT eller Phe69Ala, men ikke i celler, der udtrykker PLpro Cys111Ala eller Arg166Ser/Glu167Arg (fig. 6d). Ligeledes blokerede WT PLpro, men ikke Arg166Ser/Glu167Arg- eller Cys111Ala-mutanten, EMCV-restriktion af FLAG-MDA5 (fig. 6e); effekten på virusreplikation korrelerede med inducerede ISG-proteiner (fig. 6f). Samlet etablerer dette SCoV2 PLpro som en IFN-antagonist, der aktivt de-ISGylerer MDA5.
Diskussion
ISG15-konjugation er kendt for at give antiviral aktivitet til et væld af vira; dog er der kun identificeret nogle få ægte substrater12. På den anden side virker ISG15 i sin ukonjugerede form proviralt ved at forstærke USP18-medieret IFNAR-signalhæmning31,32,40. Denne undersøgelse identificerer en nøglerolle for ISGylering i MDA5-medieret IFN-induktion. Vores arbejde understreger også vigtigheden af eksperimentelt design, hvor afkobling af ISG15's rolle i MDA5-aktivering fra den i dæmpning af IFNAR-signalering er afgørende for at afsløre ISG15's potente antivirale aktivitet. I en inficeret organisme er det sandsynligvis summen af flere ISGyleringshændelser (som påvirker både værts- og virale proteiner), der bestemmer resultatet af infektion og patogenese, som kan være kontekstafhængig12.
Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet
Vores resultater indikerer, at ISGylering af MDA5 virker analogt med den Lys63-koblede ubiquitinering af RIG-I5: begge PTM'er (1) reguleres af PP1-induceret dephosphorylering og (2) fremmer CARD-oligomerisering og RLR højere -bestil samlinger. Men hvor ubiquitin er rigeligt i både uinficerede og inficerede celler, øges ISG15-ekspression kraftigt ved IFN-stimulering. Ikke desto mindre, selv på basale niveauer, er ISG15 konjugeret til mange værtsproteiner20, inklusive MDA5, som vores arbejde viste, hvilket kan være tilstrækkeligt til initial MDA5-aktivering. Under virusinfektioner, der registreres af flere PRR'er, kan MDA5 ISGylering være en 'priming'-mekanisme, hvorved ISG15-opregulering af en øjeblikkelig medfødt sensor (f.eks. RIG-I)41 primer MDA5 til at gå ind i en 'kick-start'-tilstand. Da ISG15 negativt regulerer RIG-I16,17, kan ISGylering udløse 'sensorskift', hvor MDA5-aktivering fremmes, når ISG15-niveauerne stiger, mens RIG-I-aktiviteten dæmpes. Vi identificerede, at SCoV2 PLpro antagoniserer MDA5 ISGylering via dens enzymatiske aktivitet efter binding til sensoren; denne strategi er sandsynligvis bevaret blandt coronavirus, hvilket kræver yderligere undersøgelse. Kryo-elektronmikroskopi-analyser afslørede, at coronaviral Nsp3 er en del af et porekompleks, der spænder over endoplasmatiske retikulum-afledte dobbeltmembran-vesikler og eksporterer nysyntetiseret viral RNA42. MDA5 kan således placere sig i umiddelbar nærhed af stedet for viral RNA-eksport for at lette PAMP-detektion; PLpro-domænet af Nsp3 (som er på den cytoplasmatiske side) blokerer imidlertid MDA5-signalering gennem direkte de-ISGylering. Nogle vira kan også hæmme MDA5 ISGylering gennem dysregulering af MDA5 phosphorylering, som vist for MeV-V. Sammenfattende afslører vores undersøgelse en fremtrædende rolle for ISGylering i aktivering af MDA5-medieret immunitet såvel som dens hæmning af SCoV2, hvilket afslører et potentielt molekylært mål for design af terapeutiske midler mod COVID-19.
Referencer
1. Liu, G. & Gack, MU Distinkte og orkestrerede funktioner af RNA-sensorer i medfødte. Immunity 53, 26-42 (2020).
2. Wu, J. & Chen, ZJ Medfødt immunfornemmelse og signalering af cytosoliske nukleinsyrer. Annu. Rev. Immunol. 32, 461-488 (2014).
3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I og andre RNA-sensorer i antiviral immunitet. Annu. Rev. Immunol. 36, 667-694 (2018).
4. Schlee, M. Master sensorer af patogene RNA-RIG-I-lignende receptorer. Immunobiologi 218, 1322-1335 (2013).
5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-lignende receptorer: deres regulering og roller i RNA-sensing. Nat. Rev. Immunol. 20, 537-551 (2020).
6. Wies, E. et al. Dephosphorylering af RNA-sensorerne RIG-I og MDA5 af phosphatasen PP1 er afgørende for medfødt immunsignalering. Immunity 38, 437-449 (2013).
7. Gack, MU et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase er afgørende for RIG-I-medieret antiviral aktivitet. Nature 446, 916-920 (2007).
8. Chiang, C. & Gack, MU Post-translationel kontrol af intracellulære patogensansningsveje. Trends Immunol. 38, 39-52 (2017).
9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Fælles og særskilte funktioner af type I og type III interferoner. Immunity 50, 907-923 (2019).
10. Schoggins, JW Interferon-stimulerede gener: hvad gør de alle sammen? Annu. Rev. Virol. 6, 567-584 (2019).
11. Zhang, D. & Zhang, DE Interferon-stimuleret gen 15 og protein-ISGyleringssystemet. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119-130 (2011).
12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 i antiviral immunitet og videre. Nat. Rev. Microbiol. 16, 423-439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Nedsat type I interferonaktivitet og inflammatoriske reaktioner hos alvorlige COVID-19 patienter. Science 369, 718-724 (2020).
14. Klemm, T. et al. Mekanisme og hæmning af den papainlignende protease, PLpro, af SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).
15. Shin, D. et al. Papain-lignende protease regulerer SARS-CoV-2 viral spredning og medfødt immunitet. Nature 587, 657–662 (2020).
16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Negativ feedbackregulering af RIG-I-medieret antiviral signalering ved interferon-induceret ISG15-konjugation. J. Virol. 82, 1474-1483 (2008).
17. Du, Y. et al. LRRC25 hæmmer type I IFN-signalering ved at målrette ISG15-associeret RIG-I til autofagisk nedbrydning. EMBO J. 37, 351-366 (2018).
18. Hato, SV et al. Te mengovirus lederprotein blokerer interferon-alfa/beta-gentransskription og hæmmer aktivering af interferon regulatorisk faktor 3. Cellemikrobiol. 9, 2921-2930 (2007).
19. Deddouche, S. et al. Identifikation af en LGP2-associeret MDA5-agonist i picornavirus-inficerede celler. eLife 3, e01535 (2014).
20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15-konjugationssystem retter sig bredt mod nyligt syntetiserede proteiner: implikationer for den antivirale funktion af ISG15. Mol. Cell 38, 722-732 (2010).
21. Lenschow, DJ et al. Identifikation af interferon-stimuleret gen 15 som et antiviralt molekyle under Sindbis-virusinfektion in vivo. J. Virol. 79, 13974-13983 (2005).
22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Fosforyleringsmedieret negativ regulering af RIG-I antiviral aktivitet. J. Virol. 84, 3220-3229 (2010).
23. Nistal-Villan, E. et al. Negativ rolle af RIG-I serin 8-phosphorylering i reguleringen af interferon-beta-produktion. J. Biol. Chem. 285, 20252-20261 (2010).
24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Konventionel proteinkinase C-alfa (PKC-alpha) og PKC-beta regulerer negativt RIG-I antiviral signaltransduktion. J. Virol. 86, 1358-1371 (2012).
25. Davis, ME et al. Antagonisme af phosphatase PP1 af mæslingevirus V-protein er nødvendig for medfødt immunudslip af MDA5. Cell Host Microbe 16, 19-30 (2014).
26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone-protein fremmer antiviral medfødt immunitet ved at lette MDA5-oligomerisering og intracellulær omfordeling. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).
27. Wu, B. et al. Strukturelt grundlag for dsRNA-genkendelse, filamentdannelse og antiviral signalaktivering ved MDA5. Celle 152, 276-289 (2013).
28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM-strukturer af MDA5-dsRNA-filamenter på forskellige stadier af ATP-hydrolyse. Mol. Cell 72, 999-1012 (2018).
29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Den medfødte immunsensor LGP2 aktiverer antiviral signalering ved at regulere MDA5-RNA-interaktion og filamentsamling. Mol. Cell 55, 771-781 (2014).
30. Uchikawa, E. et al. Strukturel analyse af dsRNA-binding til antivirale mønstergenkendelsesreceptorer LGP2 og MDA5. Mol. Cell 62, 586-602 (2016).
31. Malakhova, OA et al. UBP43 er en ny regulator af interferonsignalering uafhængig af dets ISG15-isopeptidaseaktivitet. EMBO J. 25, 2358-2367 (2006).
32. Zhang, X. et al. Human intracellulær ISG15 forhindrer interferon-alfa/beta-overamplifikation og auto-inflammation. Nature 517, 89–93 (2015).
33. Harcourt, BH et al. Identifikation af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus replikaseprodukter og karakterisering af papain-lignende proteaseaktivitet. J. Virol. 78, 13600-13612 (2004).
34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Murin coronavirus musehepatitisvirus genkendes af MDA5 og inducerer type I interferon i hjernemakrofager/mikroglia. J. Virol. 82, 9829-9838 (2008).
35. Menachery, VD et al. Dæmpning og genopretning af alvorlig akut respiratorisk syndrom coronavirus mutant, der mangler 2'-O-methyltransferase aktivitet. J. Virol. 88, 4251-4264 (2014).
36. Bekes, M. et al. Anerkendelse af Lys48-koblet di-ubiquitin og deubiquitinerende aktiviteter af SARS coronavirus papain-lignende protease. Mol. Cell 62, 572-585 (2016).
37. Childs, K. et al. mda-5, men ikke RIG-I, er et almindeligt mål for paramyxovirus V-proteiner. Virology 359, 190-200 (2007).
38. Shi, HX et al. Positiv regulering af interferon regulatorisk faktor 3 aktivering af Herc5 via ISG15 modifikation. Mol. Cell Biol. 30, 2424-2436 (2010).
39. Blanco-Melo, D. et al. Ubalanceret værtsrespons på SARS-CoV-2 driver udviklingen af COVID-19. Celle 181, 1036-1045 (2020).
40. Speer, SD et al. ISG15-mangel og øget virusresistens hos mennesker, men ikke mus. Nat. Commun. 7, 11496 (2016).
41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. RIG-I og MDA5 essentielle, ikke-overflødige roller i påvisning og kontrol af West Nile-virusinfektion. J. Virol. 87, 11416-11425 (2013).
42. Wolf, G. et al. En molekylær pore spænder over den dobbelte membran af coronavirus-replikationsorganellen. Science 369, 1395-1398 (2020).
43. Major, EO et al. Etablering af en linje af humane føtale gliaceller, der understøtter JC-virusformering. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 1257-1261 (1985).
44. Hertzog, J. et al. Infektion med et brasiliansk isolat af Zika-virus genererer RIG-I-stimulerende RNA, og det virale NS5-protein blokerer type I IFN-induktion og signalering. Eur. J. Immunol. 48, 1120-1136 (2018).
45. Cerikan, B. et al. Celle-iboende tilpasning som følge af kronisk ablation af en nøgle rho GTPase regulator. Dev. Celle 39, 28-43 (2016).
46. Chan, YK & Gack, MU En phosphomimetic-baseret mekanisme af dengue-virus til at antagonisere medfødt immunitet. Nat. Immunol. 17, 523-530 (2016).
47. Riedl, W. et al. Zika-virus NS3 efterligner et cellulært 14-3-3-bindingsmotiv for at antagonisere RIG-I- og MDA5--medieret medfødt immunitet. Cell Host Microbe 26, 493-503 (2019).
48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 ubiquitylering og nedbrydning af fåresygevirus undertrykker cytokin- og onkogensignalering. J. Virol. 77, 6385-6393 (2003).
49. Oudshoorn, D. et al. HERC6 er den vigtigste E3-ligase til global ISG15-konjugation i museceller. PLoS ONE 7, e29870 (2012).
50. Kim, DK et al. En omfattende, fleksibel samling af SARS-CoV-2 kodende regioner. G3 (Bethesda) 10, 3399-3402 (2020).
51. Chiang, C. et al. Det humane papillomavirus E6 oncoprotein målretter USP15 og TRIM25 for at undertrykke RIG-I-medieret medfødt immunsignalering. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).
52. Gack, MU et al. Roller af RIG-I N-terminal tandem CARD og splejsningsvariant i TRIM25-medieret antiviral signaltransduktion. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 16743-16748 (2008).
53. Chiang, JJ et al. Viral afmaskering af cellulære 5S rRNA pseudogene transkripter inducerer RIG-I-medieret immunitet. Nat. Immunol. 19, 53-62 (2018).
54. Sparrer, KMJ et al. TRIM23 medierer virus-induceret autofagi via aktivering af TBK1. Nat. Microbiol. 2, 1543-1557 (2017).