Interferens af phenylethanoidglycosider fra Cistanche Tubulosa med MTT-analysen

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu og Yu-Qi Gao

Abstrakt:

MTT-assayet, som en screeningsmetode, er blevet brugt i vid udstrækning til at måle levedygtigheden og proliferationen af ​​celler. Det skal dog bemærkes, at MTT-analysen muligvis ikke nøjagtigt afspejler effekten afCistanche tubulosaethanolekstrakt på EA.hy926-cellers levedygtighed. For at undersøge og identificere de komponenter, der er ansvarlige for de modstridende observationer af MTT-assayet, echinacoside og acteosid, blev to primære phenylethanoid-glycosider fra C. tubulosa ethanolekstrakt isoleret. Dataene afledt af CCK-8, Hoechst 33342 og annexin V-FITC/PI-assays tyder på, at caffeoylgruppen til stede i begge isolerede forbindelser var ansvarlig for de modstridende resultater af MTT-analysen. Disse data understreger behovet for at bruge en række forskellige metoder til at bestemme virkningen af ​​medicinske midler på cellelevedygtighed for at undgå at generere vildledende resultater.

Nøgleord: MTT-assay;phenylethanoid glycosid; koffeinsyre; cellelevedygtighed; interferens

Introduktion

Den parasitære planteCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae-familien) er vidt udbredt i nordafrikanske, arabiske og asiatiske lande [1]. De stammer fraCistanche tubulosaogCistanche deserticolaer vigtige i traditionel kinesisk medicin, da de er blevet brugt til behandling af impotens, sterilitet, lumbago og forstoppelse på grund af koloninerti [2]. Derudover har det ethanoliske ekstrakt af Cistanche tubulosa vist sig at have en signifikant beskyttende effekt mod cerebral hypoxi hos mus [3].

Endotelceller spiller en afgørende rolle i patogenesen af ​​hypoxisk pulmonal hypertension. EA.hy926-endotelcellelinjen ligner betydeligt primære endotelceller. Under vores egen undersøgelse af den antihypoxiske effekt afCistanche tubulosaethanolekstrakt på EA.hy926 endotelcelle, bemærkede vi, at 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, som almindeligvis bruges til at vurdere cellelevedygtighed i undersøgelser af cytotoksicitet og cytostatisk aktivitet, genererede modstridende resultater ved at vise øget EA.hy926-cellelevedygtighed efter behandling.

Nøjagtig vurdering af cellelevedygtighed er afgørende for at identificere potentielle cytotoksiske eller cytobeskyttende virkninger af et lægemiddel. Vi undersøgte derfor, hvilke komponenter der er til stede i C. tubulosa ethanolekstrakt, der kan være ansvarlige for de modstridende resultater observeret med MTT-assayet. Vi isolerede to hovedphenylethanoidglycosider (PhG'er) fra C. tubulosa ethanolekstrakt, echinacosid (herefter forbindelse 1) og acteosid (herefter forbindelse 2), og bestemte deres effekt på EA.hy926-cellelevedygtighed ved hjælp af en række forskellige metoder. For yderligere at afklare, hvilken substituent af forbindelse 1 og 2, der kan være ansvarlig for de modstridende resultater, testede vi deres aglyconer, koffeinsyre (herefter forbindelse 3) og 3,4-dihydroxylphenylethanol (herefter forbindelse 4), på EA.hy926-cellelevedygtighed under anvendelse af de samme metoder.

Resultater og diskussion

Identifikation af forbindelser

Strukturerne af de to forbindelser isoleret fra C. tubulosa ethanolekstrakt blev identificeret ved nuklear magnetisk resonans (NMR) og massespektrometri (MS) analyser og er vist i figur 1. Forbindelse 1 blev identificeret som echinacosid ved sammenligning med tidligere rapporteret NMR (tabel) 1) og MS (m/z 785 [M-H]-) data [4]. Forbindelse 2 NMR-spektre var meget lig dem for forbindelse 1, bortset fra fraværet af en -D-glucopyranosylgruppe (tabel 1). Forbindelse 2 (m/z 623 [M-H]- ) blev identificeret som acteosid [5]. Det er vigtigt, at begge forbindelser har den samme aglycon, som inkluderer koffeinsyre (forbindelse 3) og 3,4-dihydroxyphenylethanol (forbindelse 4).

Cellelevedygtighedsanalyser

MTT- og CCK{{0}}-assays blev brugt til at analysere virkningen af ​​forbindelser 1-4 på EA.hy926-cellelevedygtighed. MTT-assayet viste, at levedygtigheden af ​​EA.hy926-celler steg signifikant efter behandling med 25 og 50 μM forbindelse 1, 2 eller 3 (166,3 procent og 174,1 procent for forbindelse 1, 205,8 procent og 224,3 procent for forbindelsen 2 og 164,8 procent og 189,6 procent for forbindelse 3, henholdsvis p < 0,05,="" sammenlignet="" med="" kontrolceller="" (figur="" 2a).="" endvidere="" viste="" en="" morfologisk="" inspektion="" af="" cellerne,="" at="" behandling="" med="" 50="" μm="" forbindelse="" 1,="" 2="" eller="" 3="" øgede="" dannelsen="" af="" ​​lilla="" formazan-krystaller,="" som="" anses="" for="" at="" være="" en="" direkte="" indikation="" af="" andelen="" af="" ​​levende="" celler="" (figur="" 3).="" omvendt="" antydede="" cck-8-assayet,="" at="" cellelevedygtighed="" faldt="" signifikant="" efter="" behandling="" med="" 12,5,="" 25="" og="" 50="" μm="" forbindelse="" 1,="" 2="" eller="" 3="" (75,5="" procent,="" 45,1="" procent="" og="" 43,7="" procent="" for="" forbindelse="" 1,="" 85,5="" procent,="" 51,8="" procent="" og="" 34,3="" procent="" for="" forbindelse="" 2,="" og="" 64,5="" procent,="" 48,2="" procent="" og="" 36,4="" procent="" for="" forbindelse="" 3,="" henholdsvis="" p="">< 0,05,="" sammenlignet="" med="" kontrolceller="" (figur="" 2b).="" forbindelse="" 4="" påvirkede="" ikke="" cellelevedygtighed="" i="" hverken="" mtt-="" eller="" cck-8-assayet.="" uoverensstemmelsen="" mellem="" resultaterne="" opnået="" med="" de="" to="" assays="" tyder="" på,="" at="" en="" af="" ​​de="" to="" assays="" muligvis="" ikke="" nøjagtigt="" afspejler="" virkningerne="" af="" forbindelser="" 1="" og="" 2="" på="">

Apoptosevurdering af Hoechst Staining

Hoechst 33342 er en cellegennemtrængelig DNA-farvning, der exciteres af ultraviolet lys og udsender blå fluorescens ved 460 til 490 nm. Det kondenserede kromatin fra apoptotiske celler farves klarere end kromatinet fra normale celler [6]. Mens kontrolceller udviste ensartet dispergeret kromatin, normale organeller og intakte cellemembraner, viste celler inkuberet med 50 μM forbindelser 1, 2 eller 3 i 48 timer den typiske farvning af apoptotiske celler (figur 4A). Omvendt øgede eksponering af celler for 50 μM af forbindelse 4 ikke antallet af apoptotiske kerner sammenlignet med kontrolbehandlingen.

Flowcytometrisk analyse af apoptotiske celler

Annexin V-FITC/PI dobbeltfarvningsassay identificerer apoptotiske celler ved højaffinitetsbinding af annexin V-FITC til phosphatidylserin, som er eksternaliseret i celler, der gennemgår apoptose [7]. I dette assay binder levedygtige celler sig hverken til annexin V eller PI og farves derfor ikke (nedre venstre kvadrant), tidlige apoptotiske celler farves grønne ved bindingen af ​​annexin V-FITC (nederste højre kvadrant) og sene apoptotiske celler farves grønne og røde ved binding af annexin V-FITC til henholdsvis phosphatidylserin og PI til nekrotiske celler (øverste højre kvadrant). Som vist i figur 4B, celler inkuberet med 50 μM forbindelser 1, 2 eller 3 i 48 timer, steg procentdelen af ​​apoptotiske celler fra 3,74 procent (kontrolceller) til henholdsvis 10,32 procent, 12,95 procent og 11,30 procent. Sammenlignet med kontrolceller øgede forbindelse 4 ikke procentdelen af ​​apoptotiske EA.hy926-celler.

I overensstemmelse med resultaterne opnået med CCK-8-assayet og Hoechst 33342-farvning viste flowcytometri-assayet, at forbindelser 1, 2 og 3 inducerede apoptose i EA.hy926-celler. Alt i alt tyder disse observationer på, at stigningen i EA.hy926-cellelevedygtighed observeret med MTT-assayet efter behandling med forbindelser 1-3 repræsenterede et falsk-positivt resultat.

Diskussion

I 1983 udviklede Mosmann en kolorimetrisk MTT mikropladeanalyse til måling af celleproliferation og cytotoksicitet [8]. Denne enkle analyse og modifikationer af den bruges nu i vid udstrækning i cellebiologiske laboratorier rundt om i verden. Fraktioneringsundersøgelser i pattedyrsceller indikerede, at den reducerede pyridinnukleotid-cofaktor, NADH, er ansvarlig for den meste MTT-reduktion. Dette blev understøttet af undersøgelser med hele celler [9]. MTT-reduktion er derfor forbundet med metabolisk aktive celler og er ikke kun koblet med mitokondriel respiration, men også med cytoplasma og ikke-mitokondrielle membraner inklusive endosom/lysosom-kompartment og plasmamembran [10]. Den positive nettoladning på MTT-molekylet er den primære faktor for dets cellulære optagelse via plasmamembranpotentialet.

Det er bemærkelsesværdigt, at MTT-analysen nogle gange ikke nøjagtigt afspejler den faktiske effekt, som en testet forbindelse har på specifikke celler. De kemiske strukturer eller grupper, der kan forårsage modstridende resultater i MTT-analysen, er dog ikke blevet identificeret. Nylige undersøgelser har vist, at MTT-assayet kunne undervurdere den anti-proliferative effekt af (−)-epigallocatechin-3-gallat, den mest udbredte polyphenol i grøn te [11]. I undersøgelser, der brugte MTT-assayet til at påvise tumor-kemosensitivitet, viste anti-cancer-kemoterapeutiske midler, såsom epirubicin, paclitaxel, docetaxel og imatinibmesylat (Gleevec), øget cellelevedygtighed [12,13]. Desuden har en række undersøgelser rapporteret, at visse planteekstrakter og redoxaktive polyphenoler kunne interferere med MTT-assayet, da de direkte reducerer MTT-tetrazoliumsaltet i fravær af celler [14].

Behovet for at solubilisere MTT-formazan-krystallerne forud for spektrofotometrisk analyse i en mikropladelæser og reaktionens iboende endepunktskarakter begrænser brugen af ​​MTT-analysen til visse anvendelser. Dette førte til udviklingen af ​​tetrazoliumanaloger, hvor phenyldelene var dekoreret med negativt ladede sulfonatgrupper, såsom 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5- sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxamid (XTT), et negativt ladet indre salt [15] og 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), et svagt surt indre salt tæt beslægtet med MTT [16] . Disse modifikationer resulterede i produktionen af ​​kulturmediumopløselige formazanprodukter, der eliminerede kravet om et solubiliseringstrin forud for kvantificering. Tilsvarende, da den øgede negative ladning på disse molekyler reducerede deres evne til at bevæge sig over cellemembraner [17], mellemliggende elektronacceptorer (IEA), såsom 1-methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat ({{25 }}methoxy PMS) var påkrævet for at lette reduktion af tetrazolfarvestof eller for at øge reduktionshastigheden.

For nylig er der udviklet en ny generation af vandopløselige tetrazoliumsalte, hvoraf WST-1 er prototypen [18]. WST-1, et negativt ladet disulfoneret indre salt, der indeholder en iodrest, er mere stabil end XTT og MTS i nærværelse af 1-methoxy PMS, dets obligatoriske IEA. Dette førte til markedsføringen af ​​WST-1/1-methoxy PMS som et praktisk enkelt reagenscelleproliferationskit. Adskillige andre tetrazoliumsalte i WST-serien er blevet udviklet, hvoraf den mest nyttige måske er WST-8 [19]. WST-8 ser ud til at have meget lignende cellulære reduktionsegenskaber til WST-1 og markedsføres uafhængigt som CCK-8-analysen. WST-8 er celleuigennemtrængelig og reduceres derfor ekstracellulært via elektrontransport fra intracellulær NADH til WST-8 over plasmamembranen medieret af 1-methoxy PMS. Selvom både MTT og WST-8/1-methoxy PMS-reduktion er drevet af intracellulær NADH, ser kilden til NADH ud til at være forskellig inden for disse to metoder. WST-8/1-methoxy PMS-reduktion er mere afhængig af malat/aspartat-shuttlen, der forbinder mitokondriel tricarboxylsyrecyklus-NADH med det ekstramitokondrielle rum [20].

I foreløbige eksperimenter bekræftede vi, at forbindelser 1, 2, 3 og 4 ikke direkte kunne reducere MTT-tetrazoliumsaltet (ikke vist). I den foreliggende undersøgelse blev den direkte indflydelse af selve forbindelserne med reagenset elimineret ved omhyggeligt at vaske mikropladerne med fosfatpufret saltvand (PBS), før MTT- eller CCK-8-opløsning blev tilsat, som angivet i producentens protokoller. Ikke desto mindre var resultaterne opnået ved brug af de to metoder stadig modstridende (figur 2). Som forventet øgede inkubation af celler med forbindelser 1, 2 og 3 reduktionen af ​​tetrazoliumsaltet til lilla formazan sammenlignet med kontrolgruppen (figur 3), hvilket tyder på, at den blotte reduktion af tetrazoliumsaltet i nærvær af en specifik forbindelse er ikke tilstrækkeligt til at bedømme forbindelsens evne til at interferere med MTT-analysen.

For at bestemme, om forbindelser 1, 2, 3 og 4 kunne inducere apoptose i EA.hy926-celler, blev cellulære morfologiske ændringer og phosphatidylserin-eksternisering vurderet. I overensstemmelse med faldet i cellulær levedygtighed observeret med CCK-8-assayet, antydede resultaterne af Hoechst-farvning og flowcytometrianalyse ved anvendelse af annexin V-FITC/PI, at væksthæmningen observeret efter behandling med forbindelse 1, 2 og 3 var skyldes, i det mindste delvist, EA.hy926-celleapoptose. Vores resultater understøttede også ideen om, at caffeoylgruppen til stede i både forbindelser 1 og 2 var ansvarlig for de modstridende resultater opnået med MTT-assayet.

I lighed med vores resultater udviste Rottlerin, en potent kaliumkanalåbner med stor ledningsevne, ikke reaktivitet over for MTT in vitro. Det forstærkede imidlertid kraftigt dannelsen af ​​formazankrystaller inde i celler, et resultat der var i åbenlys konflikt med Rottlerin-hæmning af NF-KB og celleproliferation observeret ved analyse af [3H]-thymidin-inkorporering i DNA [21]. Mekanismen, hvorved Rottlerin forbedrede MTT-reduktion, blev tilskrevet dets mitokondrielle afkoblingseffekt [22]. Rottlerin har en cinnamoylsyresubstituentgruppe. Sammenlignet med cinnamoylsyre har forbindelse 3 to yderligere hydroxylrester, som er placeret ved C-3 og C-4. Derfor spekulerer vi i, at den mekanisme, hvorved forbindelser 1 og 2 forårsager modstridende resultater i MTT-assayet, også kan være forbundet med deres mitokondrielle afkoblingseffekter. For at teste denne hypotese er der behov for sammenlignende undersøgelser blandt forbindelser 1, 2 og en kemisk adskiller, såsom trifluorcarbonylcyanid phenylhydrazon (FCCP).

forsøgssektionen

Reagenser og kemikalier

Forbindelse 3 (koffeinsyre-pulver, renhed=98,6 procent) blev købt fra Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Forbindelse 4 (3,4-dihydroxyphenylethanol-olie, renhed=98,5 procent) blev opnået fra Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). MTT og dimethylsulfoxid (DMSO) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). CCK-8-analysen blev købt fra Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Hoechst 33342 og annexin V-FITC/PI apoptose detektionssæt blev købt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kina)

Plantemateriale

C. tubulosa-stængler blev indsamlet fra Yutian-præfekturet, Xinjiang Uygur Autonome Region, Kina. Kuponprøver blev deponeret i Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Kina) og godkendt af Yi Zhang fra Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, Kina)

Udvinding og isolering af plantemateriale

Lufttørrede C. tubulosa (0,6 kg) stilke blev pulveriseret og ekstraheret med 50 procent ethanol i 2 timer ved 70 grader. Efter fjernelse af opløsningsmidlet under reduceret tryk blev den ethanoliske ekstrakt (212,5 g) opløst og suspenderet i vand (2 L) og ekstraheret med n-butanol (2 L x 3). Den n-butanoliske ekstrakt (110 g) blev kromatograferet på en polyamidsøjle og elueret med ethanol/vand (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), hvilket gav fem fraktioner (A-E) . Fraktion B (65 g) blev fraktioneret på en ODS-søjle; eluering med ethanol: vand (1:9) udskilt forbindelse 1 (3 g). Fraktion D (10,5 g) blev fraktioneret på en ODS-søjle; eluering med ethanol/vand (1:4) separerede forbindelse 2 (1 g).

NMR-spektre blev optaget på et Bruker Avance 600-spektrometer i CD3OD med tetramethylsilan (TMS) som intern standard. Massespektre blev udført på et BioTOF-Q massespektrometer.

Cellekultur

EA.hy926-cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium, suppleret med 10 procent (v/v) føtalt bovint serum og 1 procent (v/v) penicillin-streptomycin i et fugtigt miljø med 5 procent CO2 ved 37 grader.

Cellelevedygtighed

Cellelevedygtighed blev vurderet ved hjælp af MTT- og CCK{{0}}-assays. Forbindelser 1 og 2 og deres aglyconer, koffeinsyre (3) og 3,4-dihydroxylphenylethanol (4) blev opløst i DMSO til den endelige DMSO-koncentration < 0,1="" procent="" (v/v)="" i="">

EA.hy926-celler blev podet på 96-brøndsplader med 4 x 103 celler/brønd. Efter inkubation i 24 timer blev celler behandlet med 6,25-50 μM forbindelse 1, 2, 3 eller 4 i 24 timer. Dyrkningsmediet blev fjernet, og cellerne blev vasket to gange med phosphatpufret saltvand (PBS). Alikvoter (10 μL) MTT-stamopløsning (5 mg·mL−1) blev tilsat til hver brønd indeholdende 100 μL medium og inkuberet med celler i 4 timer. Efter inkubation blev mediet fjernet, og 150 μL alikvoter af DMSO blev tilsat til hver brønd for at solubilisere formazan-krystallerne. Absorbans blev målt ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Cellelevedygtighed blev udtrykt som procentdelen af ​​MTT-reduktion, idet 100 procent værdien blev tildelt kontrolcellernes absorbans. Alle eksperimenter blev udført tre gange og præsenteret som middel ± standardafvigelse (SD).

CCK-8-analysen blev udført efter litteraturen med små modifikationer [23]. Specifikt blev celler behandlet med 6,25-50 μM forbindelser 1, 2, 3 eller 4 i 24 timer og vasket to gange med PBS før tilsætning af 10 μL CCK-8-opløsning og 100 μL dyrkningsmedier. Efter inkubation af mikropladen ved 37 grader i 2 timer blev absorbansen målt ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Cellelevedygtighed blev udtrykt som procentdelen af ​​levedygtige celler i forhold til kontrolceller (100 procent). Alle eksperimenter blev udført tre gange og udtrykt som middelværdi ± SD.

Apoptosevurdering af Hoechst 33342 Farvning

Apoptotiske morfologiske ændringer blev observeret ved Hoechst 33342-farvning. Kort fortalt blev EA.hy926-celler podet på 48-brøndsplader (2 × 104 celler/brønd) og behandlet med 50 μM forbindelse 1, 2, 3 eller 4 i 48 timer ved 37 grader, vasket to gange med PBS, og fikseret med 4% (v/v) paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter skylning to gange med PBS blev celler farvet med Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) i 5 minutter ved stuetemperatur og vasket to gange med PBS. Hoechst-farvede kerner blev visualiseret ved anvendelse af et fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Apoptoseanalyse ved flowcytometri

Apoptotiske celler blev påvist ved annexin V-FITC/PI dobbeltfarvning og flowcytometrianalyse. Kort fortalt, efter behandling med 50 μM forbindelse 1, 2, 3 eller 4 i 48 timer, blev celler høstet og resuspenderet i PBS ved 1 × 105 celler·mL−1. Efter centrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 25 grader blev 195 μL annexin V-FITC bindingsbuffer og 5 μL annexin V-FITC tilsat. Efter forsigtig vortex-blanding blev blandingen inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter centrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 25 grader blev 190 μL FITC-konjugeret annexin V-bindingsbuffer og 10 μL PI tilsat. Efter forsigtig vortex-blanding blev prøver analyseret ved hjælp af et FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) inden for 30 min.

Statistisk analyse

Alle eksperimentelle data blev udtrykt som middel ± SD. Betydningen af ​​forskellene mellem eksperimentelle prøver og den tilsvarende kontrol blev vurderet ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) ved brug af SPSS-softwaren (version 11.5). Statistisk signifikans blev sat til p <>

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at overvurderingen af ​​antallet af levedygtige celler observeret i MTT-assayet kunne maskere cytotoksiciteten af ​​visse forbindelser. Derfor anbefaler vi under lægemiddelscreeningsprocesser at bruge en række forskellige metoder til at bestemme effekten af ​​den specifikke forbindelse i cellelevedygtighed (såsom CCK-8 og 3 H-TdR-assays) for at undgå at generere vildledende resultater.