Interaktioner mellem polyphenoliske antioxidanter Quercetin og Naringenin dikterer den karakteristiske redox-relaterede kemiske og biologiske adfærd af deres blandinger Del 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Q ved koncentration svarende til 1 μM havde også en tendens til at reducere ekspression af ALOX12 og MT3 (0.05<><0.09) as="" well="" as="" sod2="" and=""><><0.09).the latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" that="" belongs="" to="" the="" family="" of="" thioredoxins="" and="" acts="" as="" an="" endogenous="" antioxidant="" facilitating="" the="" reduction="" of="" other="" proteins8.in="" contrast,="" to="" n-,o="" at="" 1="" um="" up-regulated="" gtf2i=""><0.05).the other="" genes="" whose="" expression="" was="" significantly="" elevated="" by="" q="" at="" l="" μm="" were="" gsr,="" hspa1a,="" ptgsi,="" and="" txnrd1;="" all="" play="" key="" roles="" in="" building="" cellular="" defenses="" against="" oxidants.="" up-regulation="" of="" gsr="" is="" crucial="" for="" maintaining="" redox="">homøostasei celler, fordi det kodede protein opretholder høje niveauer af reduceret glutathion i cytosolen39. Til gengæld er HSPAlA-chaperone nødvendig for at korrigere enhver forekommende fejlfoldning, også dem som følge af eksponering forantioxidanter. Sidstnævnte kan flytte redoxbalancen mod en reduceret tilstand, hvilket fører til den mere sandsynlige reduktion af disulfidbroer tilsulfhydryl

grupper og derved ændre proteinstrukturen og dermed funktionen0.PTGS1-genet koder for et protein, der er vet et andet medlem af antioxidantenzymfamilien, nemlig prostaglandinsyntase-241, Det fjerde nævnte gen-TXNRD{{4 }}koder for thioredoxinreduktase, der holder thioredoxin (TXN) i reduceret tilstand2.

Klik venligst her for at vide mere

På samme måde som 1 μM reducerede Q ved højere koncentration (10 μM) også ekspression af TXN (p)<0.05） and="" sod2=""><><0.09). furthermore,="" a="" drop="" in="" expression="" was="" observed="" for="" sod1=""><><0.09). the="" investigated="" flavonol="" at="" 10μm="" influenced="" the="" expression="" of="" also="" 4="" genes="" up-regulated="" by="" its="" lower="" concentration∶="" gsr,="" hspa1a,="" ptgs1,="" and="" txnrd2=""><0.05). the="" additional="" up-regulated="" genes="" by="" the="" higher="" q="" concentration="" included="" gstz1="" and="" stk25=""><0.05) as="" well="" as="" gpx4="" and="" sirt2=""><><0.09). the="" protein="" encoded="" by="" gstz1="" is="" a="" member="" of="" the="" glutathione="" s-transferase="" family="" that="" are="" key="" enzymes="" implicated="" in="" the="" detoxification="" of="" electrophilic="" molecules="" by="" conjugation="" with="" gsh4,="" while="" stk25="" codes="" for="" serine/threonine="" kinase="" 25,="" a="" protein="" activated="" by="" oxidative="" stress="" that="" induces="" apoptotic="" cell="" death.="" in="" turn,="" gpx4="" codes="" for="" glutathione="" peroxidase="" 4,="" which="" supports="" the="" antioxidant="" barrier="" of="" the="" cell="" by="" catalyzing="" the="" reduction="" of="" peroxides="" by="" glutathione="" the="" up-regulation="" of="" sirt2,="" encoding="" nad-dependent="" protein="">deacetylase, som deacetylerer interne lysiner til stede i f.eks. histoner eller transkriptionsfaktorer, spiller en rolle i moduleringen af ​​vigtige biologiske processer, såsom cellecykluskontrol, celledifferentiering eller genomisk integritet46.

Cistanche kan forbedre immuniteten

Blandingen af ​​aglyconer ved 1 μM reducerede ekspressionen af ​​APOE, CCL5, MT3 og MSRA i det omfang, den nåede statistisk signifikans (p<0.05). the="" apolipoprotein="" encoded="" by="" apoe="" is="" a="" core="" component="" of="" plasma="" lipoproteins="" and="" is="" involved="" in="" their="" production,="" conversion,="" and="" clearance47.="" the="" protein="" encoded="" by="" msra="" carries="" out="" the="">enzymatiskereduktion af methioninsulfoxid til methionin, således fungerer dette protein i reparationen af ​​oxidativt beskadigede proteiner for at genoprette biologisk aktivitet8. Blandingen QN ved 10 μM, i lighed med lavere dosis, reducerede ekspression af APOE, MT3 og MSRA(p)<0.05). however="" at="" a="" higher="" concentration.="" the="" set="" of="" down-regulated="" genes="" was="" extended="" to="" incorporate="" cygb="" and=""><0.05). the="" latter="" gene="" sepp1="" encodes="" selenoprotein="" p="" the="" extracellular="">glykoproteinsom har en antioxidantrolle og ser ud til at være forbundet med endotelceller49. Blandingen QN-forstærkede kun en smule ekspressionen af ​​PRDX5-genet, der koder for et medlem af peroxiredoxinfamilien af ​​antioxidantenzymer, hvis rolle er at reducere hydrogenperoxid og alkylhydroperoxider50.

Diskussion

Det videnskabelige grundlag for epidemiologiske observationer, der indikerer, at hele frugter og grøntsager er mere effektive til at forebygge kroniske ikke-infektionssygdomme end bioaktive forbindelser isoleret fra dem, er dårligt forstået. Fødevaresynergikonceptet, som forudsætter den additive eller endda synergistiske indflydelse af forskellige fødevareingredienser på menneskers sundhed, er blevet foreslået som en mulig forklaring. Et sådant ræsonnement blev dog til en vis grad undermineret af vores tidligere forskning, hvor vi sammenlignede bioaktivitet af forskelligt pigmenterede grøntsager (brassicas) samt bærfrugter, hvide vs anthocyaniner indeholdende, og fandt intet aktivitetsmønster, der kunne tilskrives farvede varianter, med med undtagelse af højere antioxidantaktivitet i kemiske test51. De biologiske virkninger blev heller ikke matchet med dem af isoleret cyanidin-3-O-glucosid undersøgt ved den koncentration, der forekommer i undersøgt plantemateriale12. Yderligere mekanistiske undersøgelser af kakao-rekonstitution viste heller ingen additive/synergistiske biologiske effekter af blandinger af komponenter som forudsagt af fødevaresynergikonceptet, men snarere fuldstændig ændret bioaktivitet3. De efterfølgende blandinger af kakaopolyfenoler så ud til at opføre sig som nye stoffer. Vi antog, at interaktionerne mellem individuelle komponenter i blandingen kunne skabe en ny enhed, der viser modificerede fysisk-kemiske egenskaber, hvilket resulterer i nye biologiske aktiviteter. Faktisk viste de mange mulige interaktioner mellem polyphenoler (hydrogen, n, hydrofobe, chelaterende, kovalente og elektrostatiske), opdaget under undersøgelser af deres anvendelse som stabilisatorer af selvsamlede nanopartikler, en række strukturer, der adskiller sig i funktionalitet. Det blev også observeret, at disse fytokemikalier normalt udøver mere end én type stabiliserende tiltrækningskræfter. I den nuværende forskning undersøgte vi, hvordan samspillet mellem ofte at konkurrere om interaktioner i en blanding af kun to polyfenoliske antioxidanter påvirkede dets redox-relaterede aktiviteter sammenlignet med individuelle komponenter.

Den første række eksperimenter koncentrerede sig om kemiske og elektrokemiske bestemmelser af parametre, der karakteriserer oxidation af individuelle og 1:1 blandede flavonoider (repræsentanter for flavonol- og flavanongruppen), separat i en aglycon(Q N-) og glycosid(R, N plus )form . Korrelationerne mellem resultaterne af disse målinger er angivet i fig. De indledende vurderinger udført af den mest populære DPPH batch-test viste, at selvom begge flavanoner (N-, N plus) virkede meget svage antioxidanter, øgede de antioxidantaktiviteten af ​​blandinger, både QN og RN plus, på en synergistisk måde (fig. 2A). DPV-analyse gav en dybere forklaring på denne effekt og pegede på den afgørende indvirkning af reaktionens kinetik. Det viste sig, at de undersøgte flavanoner let frigiver elektroner i henhold til den høje værdi af den termodynamiske parameter E,(Fig.2C). Alligevel var kinetikken af ​​denne proces for langsom til at kunne observeres ved DPPH- og PT-tests. Flavanolerne, stærke antioxidanter i DPPH-testen og PT, udviste i DPV de modsatte egenskaber - ugunstig termodynamik for elektronfrigivelse, men en høj hastighed af oxidationsprocessen. Sammenligningen af ​​strukturer af mellemradikaler tyder på, at flavonol semiquinon radikal er mere stabil end flavanon phenoxyl radikal på grund af de adskillige stabiliserende mekanismer (fig. 1). Det følger heraf, at stabiliseringen af ​​radikalmellemproduktet er af afgørende betydning for kinetikken af ​​oxidationsreaktionen og følgelig for den reduktive aktivitet af de undersøgte forbindelser.

Den endelige antioxidantaktivitet af de undersøgte blandinger forstørres via de termodynamiske faktorer, hvilket påvirker oxidationsprocessen positivt, hvilket efterfølgende forbedrede reaktionskinetikken (fig. 2B-F). En mere detaljeret mekanisme for denne forbedring forbliver i øjeblikket uforklarlig, højst sandsynligt involverer den specifikke flavonol/flavanon-interaktioner. Denne forbedring blev observeret ikke kun i et reagensglas, men også under cellulære forhold, som vist ved CAA-assay, hvor antioxidantaktiviteten af ​​begge blandinger, ON og RN plus, fortrængte antioxidantaktivitet højere end individuelle komponenters (fig. 4). Den kemiske del af vores undersøgelser afslørede uoverensstemmelsen i antioxidantaktivitet mellem individuelle forbindelser og deres blandinger. Man kan

pege på betydningen af ​​kinetikken af ​​oxidationsreaktionen for den overordnede antioxidantaktivitet og antyde, at interaktioner mellem individuelle komponenter påvirker blandingens redoxegenskaber. Det skal være korrekt i det mindste i dette tilfælde, når tilstedeværelsen af ​​flavonoler (Q, R) i blandingen øgede flavanonernes (N-, N plus ) evne til at donere elektroner.

Den efterfølgende del af forskningen koncentrerede sig om sammenligning af redox-relaterede biologiske egenskaber udvist af individuelle flavonoider (O, R, N-, N plus ) og deres blandinger (ON- og RN plus ). HT29 humane tyktarmskræftceller tjente som en anbefalet model til ernæringsundersøgelser af human fordøjelseskanal3, men i denne undersøgelse henviser nogle datafortolkninger også til den neoplastiske natur af denne cellelinje. Det har været almindeligt accepteret i dag, at redoxbalance er afgørende for cellernes overlevelse og funktion; således kan eksponering for eksogene antioxidanter såvel som ROS modulere mange cellulære processer. Ved reduktiv stress kan utilstrækkelig ROS-overflod ændre cellesignalering via redoxafhængige veje6. Overskuddet af ROS fører på den anden side til oxidativt stress og øget risiko for oxidativ skade på cellulære komponenter. Det biologiske udgangspunkt for denne stud var vurderingen af ​​virkningen af ​​antioxidanter, individuelle og i blandingen, på cellulær vækst; aktiviteten, der er afhængig af cellulær redox-homeostase, da den korrekte koncentration af ROS er nøglen til aktivering af signalering, der udløser celleproliferation. Resultaterne af MTT-cellelevedygtighedstesten afslørede væsentlige forskelle mellem behandlinger. Rene forbindelser påvirkede ikke celleproliferation signifikant sammenlignet med ikke-behandlede kontrolceller; cellevækst nåede et konstant niveau ved det brede koncentrationsområde. I modsætning hertil stimulerede begge blandinger (QN-, RN plus) celleproliferation signifikant. Denne sidstnævnte effekt er muligvis ikke nødvendigvis udelukkende relateret til antioxidantegenskaber af blandinger, fordi CAA-analyseresultater for O svarede til dem for ON-blanding. Ikke desto mindre understøttede blandingerne, men ikke individuelle komponenter, tilsyneladende bedre HT29-celler til at håndtere det resterende oxidative stress, f.eks. ved at genoprette den optimale redoxstatus; den effekt, der tidligere er observeret for så stærke antioxidanter som katekiner55. Selvom den synergistiske forøgelse af antioxidantaktivitet observeret for blandinger kan opfattes som en gavnlig virkning, er det ikke ønskeligt, at sådanne kombinationer af antioxidanter stimulerer væksten af ​​cancerceller. Fordele og ulemper ved antioxidanter og ROS i kræft har været genstand for debat i nogen tid og førte til den konklusion, at antioxidanter kan fremme kræft gennem komplekse mekanismer56, hvilket også ses her.

Et andet interessant fund var, at de uønskede virkninger af behandlinger, såsom den pro-oxidative aktivitet af N-afsløret ved CAA-assay samt genotoksicitet af Q observeret i kometassay blev udjævnet for blandingerne. Sidstnævnte assay afslørede, at DNA-skader forårsaget af den højeste undersøgte koncentration (100 uM) af ren O blev reduceret til kontrolniveau for den ækvimolære koncentration af blandingen QN-(fig. 5), der kan være forbundet med den forbedrede antioxidantaktivitet af ON -observeret i elektrokemiske tests. I tilfælde af vurdering af cellulær antioxidantaktivitet udviste aglyconer mere tydelige antioxidant- (O) eller prooxidant- (N-) egenskaber end tilsvarende glycosider (fig. 4). N- ved fysiologiske koncentrationer tilsidesatte ikke redoxbufferkapaciteten af ​​normoxiske HT29-celler, mens de ved højere koncentrationer end dem, der blev fundet i humant plasma, udviste en koncentrationsafhængig pro-oxidativ effekt, der faldt med eksponeringstiden. Generelt faldt aglyconer deres indledende indvirkning på cellulær redoxstatus i løbet af tidsforløbet (fig. 4). Begge blandinger udviste øget antioxidantaktivitet, tilsyneladende ikke påvirket af den pro-oxidative effekt set for individuelle forbindelser.

Den differentierede virkning af blandinger sammenlignet med individuelle komponenter blev også set i den epigenetiske version af kometassayet, der blev brugt til at overvåge ændringer i DNA-methylering. Individuelle flavonoider viste tendensen til at reducere global DNA-methylering på en koncentrationsafhængig måde, med undtagelse af R, som ikke påvirkede denne epigenetiske modifikation (fig. 6). Begge blandinger reducerede også det globale DNA-methyleringsniveau, men der blev ikke bemærket nogen sammenhæng med koncentrationen. Det er værd at bemærke, at redoxstatus ikke kun kan spille en rolle i kombinationen af ​​polyphenoler, da virkningen af ​​undersøgte flavonoider i tilfælde af DNA-methylering heller ikke syntes at være forbundet med deres reducerende egenskaber. Aktiv demethylering er kendt for at involvere iterativ oxidation af methylgruppe i 5-methylcytosin til carboxyform5758, så antioxidanter forventes at blokere denne proces. I vores eksperimenter observerede vi den modsatte virkning. Derfor var der højst sandsynligt en anden mekanisme involveret her, som er inhiberingen af ​​DNA-methyltransferase (DNMT1) - enzymet, der katalyserer overførslen af ​​methylgrupper til dinukleotid-CpG-strukturer i DNA. Blokaden af ​​methyleringsmønstervedligeholdelse fører til passiv demethylering over på hinanden følgende runder af DNA-replikation. Vores resultater er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der viste DNMT1-hæmning af quercetin9. Også nogle flavanoner, herunder N- blev vist at hæmme DNMT1-aktivitet i nukleare ekstrakter af humane esophageal pladecellecarcinom KYSE-510-celler. Vores undersøgelse viste også, at blanding af Q med N forårsagede et bemærkelsesværdigt fald i DNA-methyleringsniveau ved alle testede koncentrationer af denne blanding. Et lignende resultat blev observeret for RN plus; dog skete hypomethyleringen af ​​DNA i mindre grad. Alle disse observationer kan være af interesse fra et terapeutisk synspunkt. DNA-methyleringsmønsteret i cancer er på den ene side karakteriseret ved det globale tab af methylering ved genlegemer og intergene regioner, hvilket fører til svækkelse af genomets stabilitet!, på den anden side af hypermethylering af CpG-rige regioner i promotorer og transkriptionel silencing af ekspression af tumorsuppressorgener (TSG'er)! DNA-hypomethylering induceret af polyphenoler kan således genoprette ekspressionen af ​​tavsde TSGs-gener og også gradvist øge cancergenomets ustabilitet til det punkt, der fører til celledød.

De beskrevne cellulære virkninger af polyphenoler undersøgte viste, at ikke kun indhold eller sammensætning eller biotilgængelighed, men også interaktioner mellem komponenter modulerer elektrokemiske såvel som biologiske egenskaber af blandinger. Denne konklusion blev også klart understøttet af den sidste aktivitet, der blev analyseret i denne undersøgelse, dvs. modulering af ekspression af et bredt spektrum af gener forbundet med antioxidantforsvaret og oxidativ stressrespons. Venn-diagrammet (fig. 7C) opsummerer virkningen af ​​undersøgte flavonoidaglyconer på moduleringen af ​​genekspression. I tilfælde af rene forbindelser (O, N-) ved 1 uM, blev kun ét gen (GTFZI) fundet at være påvirket af begge flavonoider. Imidlertid forårsagede N nedregulering af dette gen, mens Q øgede dets ekspression. Denne påvirkning blev ikke opretholdt ved højere koncentrationer af rene forbindelser og blev heller ikke set for deres blanding ved nogen dosis. N og blandingen QN-nedregulerede også to andre gener, CCL5 og MT3, ved 1 μM og tre gener, der omfatter CYGB, MT3 og MSRA ved 10 uM. Mest overraskende blev der ikke fundet nogen ligheder i regulering af ekspression af gener mellem Q og QN- og heller ikke mellem Q, N- og QN- ved nogen af ​​de undersøgte koncentrationer. Desuden ændrede blandingen QN signifikant ekspressionen af ​​tre andre gener (APOE og SEPPI nedregulering, PRDX5 opregulering), hvis transkriptionelle aktivitet ikke blev påvirket af nogen af ​​de individuelle komponenter. Som konklusion viser vores undersøgelse, at de biologiske egenskaber af polyphenolblandinger ikke kun er kombinationen af ​​forbedrede eller svækkede aktiviteter udvist af individuelle komponenter. Disse observationer indikerer, at bioaktiviteten af ​​fytokemikalier i blandinger skal være et resultat af interaktioner mellem komponenter, der fører til fremkomsten af ​​et nyt stof med nye kemiske og biologiske egenskaber, som er vanskelige at forudsige. Resultaterne af bestemmelser udført i vores undersøgelse understøtter ikke blot , men faktisk udvide idéen om fødevaresynergi-konceptet ved at understrege det faktum, at selv mindre ændringer i sammensætningen af ​​en blanding af fødevarebårne fytokemikalier (sandsynligvis også fødevareingredienser af anden oprindelse) skaber en ny enhed, hvis indvirkning på menneskers sundhed ikke nødvendigvis ligner den af de enkelte komponenter. Denne opfattelse underminerer den nuværende måde, kosttilskud er designet på, som bygger på sundhedsanprisninger etableret fra forskning i isolerede forbindelser. Fra et kemopræventionsperspektiv forklarer den præsenterede undersøgelse, hvorfor den nuværende tilgang, der lægger vægt på brugen af ​​isolerede bioaktive fødevarekomponenter, ikke var i stand til at matche de epidemiologiske observationer, der blev foretaget for de hele fødevarer, folk indtager. Hvis kosttilskud skal tilbyde ægte langsigtede sundhedsmæssige fordele for individer, er det afgørende, at kombinationer af formodede midler studeres sammen og i en biologisk kontekst.

Materialer og metoder

Kemikalier, reagenser. Følgende bioaktive forbindelser blev brugt til undersøgelsen: quercetin (Q), rutin (R), naringin (N plus) og naringenin (N-) fra Sigma-Aldrich (USA). Analytisk kvalitet methanol og methanol fra POCH (Polen) samt DMSO fra Sigma-Aldrich (USA) blev anvendt. QPLUS185 system fra Millipore (USA) blev brugt til at rense vand. Til vurdering af antioxidantaktivitet ved spektrofotometrisk test blev 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) fra Sigma-Aldrich (USA) påført.0.1 M natriumphosphatbuffer fremstillet ved at opløse Na, HPO12H , O og NaH, PO2H, O(Sigma-Aldrich, USA) i deioniseret vand blev brugt i elektrokemiske undersøgelser. Arbejdselektroden og den elektrokemiske celle blev renset med opløsningen af ​​10 mM kaliumpermanganat (Sigma-Aldrich, USA) i 95 procent H, SO, (år/år) (POCH, Polen). Referenceelektroden blev opbevaret i 3 M KCI (Sigma-Aldrich, USA) opløst i deioniseret vand. Alle reagenser anvendt i cellekulturen (PBS, McCoy's 5A-medium, trypsin, føtalt bovint serum, antibiotika) blev købt fra Sigma-Aldrich (USA). PBS-opløsning blev fremstillet ved at opløse en tablet i 200 ml renset vand, thiazolylblåt tetrazoliumbromid (MTT) fra Sigma-Aldrich (USA) blev anvendt i MTT-testen. OxiSelect Cellular Antioxidant Assay

Kit blev købt fra Cell Biolabs, Inc. (USA). Følgende reagenser blev brugt til kometanalyse: saltsyre (HCl), agarose med lavt smeltepunkt (LMP-agarose), natriumchlorid (NaCl, natriumhydroxid (NaOH), ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA),2-amino{{1 }}(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Trizma-Base), Sybr Green I nukleinsyregelfarvning og Triton X-100 fra Sigma-Aldrich(USA) samt normal smeltning punktagarose (NMP-agarose) fra Bioline (UK). Derudover blev der i den methyleringsfølsomme kometanalyse anvendt proteinase K (Merck, USA), restriktionsenzymer (HpalI/MspI) og Tango-buffer (Promega, UK). OIAshredder , RNeasy Mini Kit, RNase-frit DNase sæt, RT² First Strand Kit, RT²SybrGreen qPCR Mastermix, RT2Profiler PCR Arrays for Oxidative Stress(PAHS 0065) fra Qiagen (Tyskland) blev brugt i genomiske undersøgelser.

Denne artikel er hentet frawww.nature.com/scientificreports