Hæmning af amyloid beta aggregation og aflejring af Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt

1. Introduktion

Demens er en af ​​de mest almindelige kroniske ældningssygdomme. I 2015 anslog World Alzheimer Report, at omkring 46,8 millioner mennesker led af demens, og tallet forventes at være 74,7 millioner i 2030 og 131,5 millioner i 2050. Den globale demensbefolkning vil stige år for år og blive ude af kontrol i fremtiden . De globale sundhedsudgifter til behandling af demens var næsten 604 milliarder amerikanske dollars i 2010, og beløbet forventes at være 1000 milliarder i 2030. Demenspatienter har større risiko for at dø ved uheld og kræver derfor mere medicinsk behandling. Dette er en stor belastning for demenspatienter pårørende. Indvirkningen af ​​demens på omsorgspersoner, familie og samfund kan forårsage stor fysisk, psykologisk, livs- og økonomisk stress. Der er to hovedformer for demens, Alzheimers sygdom (AD) og vaskulær demens. AD er den mest almindelige demens og er en irreversibel og progressiv neurodegenerativ lidelse. AD var den sjette hyppigste dødsårsag i USA i 2015.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FOREBYGGELSE AF AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nylige undersøgelser understøtter, at neurontoksiciteten induceret af amyloid peptid (A) (plaques) og protein tau (tangles) aggregering er tæt forbundet med AD patogenese. Ophobningen af ​​A og protein tau i hjernen kan føre til neuronskade og hukommelsestab. Uopløselige A-oligomerer aggregerer i ekstracellulære plaques og blev rapporteret at føre til synaptisk dysfunktion, neurontoksicitet og celledød. Desværre er der indtil videre ingen effektiv behandling tilgængelig for at fjerne A og protein tau, hæmme dannelsen eller oligomeriseringen af ​​A og suspendere eller helbrede den irreversible neuronskade. De nuværende terapeutiske midler, såsom galantamin og donepezil, som er acetylcholinesterasehæmmere, kan kun midlertidigt forbedre hukommelsestab ved at hæve neurotransmitterniveauet. I 2012 var ingen lægemiddelkandidater i stand til at reducere A-effekten i store kliniske undersøgelser af AD-patienter. Derfor er der et presserende behov for forskning for en ny behandling til at undertrykke forekomsten af ​​Alzheimers sygdom. Metalioner blev for nylig betragtet som en nøglefaktor, der er tæt forbundet med A-aggregation. Metalchelatorer, der betragtes som potentielle blyforbindelser, giver en helt ny strategi for anti-AD-tilgangen.

Den tørrede stilk af Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, høstes bredt i Xhinjang, Kinas ørken. Det er en vigtig traditionel kinesisk medicin, der hører til tonic kinesisk medicin, der er indekseret i China Pharmacopeia og brugt i tusinder af år til behandling af fysisk svaghed, nyremangel, infertilitet, glemsomhed, impotens og senil forstoppelse.C. tubulosa vandig ekstrakt (CTE)kapsler er blevet godkendt som et botanisk lægemiddel mod vaskulær demens i Kina. Ifølge et klinisk forsøg med 18 patienter diagnosticeret med mild til moderat AD, gav CTE-kapsler patienterne en mere stabil hukommelsestilstand sammenlignet med acetylkolinesterasehæmmere. I vores tidligere undersøgelse reducerede CTE amyloid peptid (A) aflejring og forbedrede hukommelsestab hos Alzheimers sygdom-lignende rotter. Phenylethanoidglycosider, echinacosid (1), acteosid (2) og isoacteosid (3) betragtes som hovedkomponenterne i CTE. Forbindelse 1 har neurobeskyttende aktivitet mod toksiciteten af ​​1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), 1-methyl{{13 }}phenylpyridiniumion (MPP+) og 6-Hydroxydopamin (6-OHDA). Vores tidligere rapport viste, at 1 undertrykte A-oligomerisering og toksicitet i en in vitro-undersøgelse og hæmmede A-aflejring, forbedret nedsat hukommelse og kognitiv dysfunktion hos A-inducerede rotter. Forbindelser 2 og 3 øgede A-nedbrydning og reducerede A-oligomerisering in vitro. Forbindelse 3 reducerede A-aflejring i A-inducerede rotter. Baseret på disse undersøgelser har C. tubulosa allerede bevist, at den har potentiale til at behandle AD. CTE er tæt forbundet med anti-A-aggregering og aflejring. For bedre at forstå CTE-mekanismen er vi nødt til at have en praktisk og effektiv metode til at identificere den aktive komponent såvel som indholdet i hjernevævsprøver. De fleste undersøgelser var designet til kvantitativ bestemmelse afechinacosid, acteosid og isoacteosid i urtereller fødevarer ved højtydende væskekromatografi (HPLC), men kun to undersøgelser var til bestemmelse i serum eller væv. Der er dog ingen rapport om den samtidige analyse af 1-3 i hjernevæv efter CTE oral administration. Derudover er det stadig uklart fra nyere undersøgelser, om de aktive CTE-komponenter eller deres metabolitter med succes passerede gennem blod-hjerne-barrieren og virkede på hjerneneuroner. Derfor giver denne forskning en avanceret og følsom metode med overbevisende beviser, der tydeligt illustrerer den underliggende mekanisme af CTE mod A-aggregering og aflejring.

2. Resultater

2.1. Isolering og identifikation af tre hovedforbindelser (1-3)

Tørrede stilke af C. tubulosa blev ekstraheret med 75 % EtOH ved stuetemperatur. Den kondenserede 75% EtOH-ekstrakt blev underkastet harpiks og C18-søjlekromatografi for at give tre hovedforbindelser, echinacoside (1),acteosid (2) og isoacteosid(3). Deres strukturer blev belyst ved analyse af NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spektroskopi og ESI-MS (Electrospray ioniseringsmasse) og ved sammenligning med litteraturdata (figur 1, Supplerende materialer figurer S3-S11).

2.2. Phenylethanoid Glycosider (1–3) indholdsanalyse fra CTE

Analysemetoden blev valideret til analyse af phenylethanoidglykosider. Forbindelser 1-3 (5,0 mg) blev nøjagtigt vejet og blandet med 50% methanol (40 ml). Blandingerne blev sonikeret i 5 min. Tre phenylethanoidglycosider (1-3) standardopløsning blev blandet som standardstamopløsningen (100 ug/ml). Standardstamopløsningen blev brugt til at fremstille fem forskellige koncentrationer (5, 10, 25, 50 og 100 ug/ml) af henholdsvis de angivne opløsninger ved fortynding med serievolumener på 50 % methanol. Phenylethanoid glycoside (1-3) kurverne blev etableret ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi (UPLC) fra 5-100 ug/mL og var lineære henholdsvis (1, r2= 0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2= 0.9998). Intra-dag og inter-dag præcision [% RSD (relativ standardafvigelse) var fra 0,1 til 1,8%], og nøjagtighed (95,6-104,2%) var acceptabel af UPLC for 1-3. UPLC kvantificerede 1, 2 og 3 af CTE-indhold til henholdsvis 254, 38 og 41 mg/g (figur S2).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING AF AD PATIENTER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. UPLC/MS/MS-validering

Phenylethanoid-glykosiderne (1-3) blev blandet og tilsat rottehjernevævshomogenat og analyseret ved hjælp af Ultra Performance væskekromatografi-tandem massespektrometer (UPLC/MS/MS) med fastfaseekstraktion. Den nedre detektionsgrænse (LLOQ) på 1-3 var 0,2 ng/mL. Genvindingen af ​​phenylethanoidglycosider tilsat hjernevævshomogenat (10 ng/ml) ved henholdsvis 91,39 % for 1, 89,54 % for 2 og 96,81 % for 3 (figur 2).

2.4. Analyse af AD-lignende rottehjernevæv

Efter 14 dages CTE oral administration (200 mg/kg/dag) blev AD-lignende rottehjernevæv opsamlet og delt i to dele, hippocampus og striatum, og begge blev homogeniseret. Fordi hippocampus- og striatum-homogenaterne fra hver rotte var for få til at blive indlæst i fastfase-ekstraktion og for at undgå overdrevne eksperimentelle fejl, blev hippocampus- og striatum-homogenaterne fra fire individuelle rotter blandet i en analyseret prøve for UPLC/MS/MS under anvendelse af det faste stof. faseekstraktionsmetode (figur 3A, B). Phenylethanoidglykosiderne (1-3) blev observeret i hippocampus (figur 3A) og striatum (figur 3B). Der var ingen signifikant top i tomme hjernevæv (figur 3C). I hippocampus var echinacosidindholdet 11,97 ± 0,34 ng/mL, acteosidindholdet var 1,25 ± 0,16 ng/mL, og isoacteosidindholdet var 1,38 ± 0,08 ng /ml. I striatum var echinacosidindholdet 22,60 ± 1,69 ng/ml, acteosidindholdet var 2,03 ± 0,61 ng/ml, og isoacteosidindholdet var 4,90 ± 0,64 ng/ml. Som vist i figur 4 ville CTE passere gennem blod-hjerne-barrieren i overensstemmelse med de signifikante påviselige mængder på 1-3 i hippocampus og striatum. Indholdet af 1 er meget højere end 2 og 3 i CTE ved UPLC-analyse (figur S2). Derfor er det rimeligt at observere, at 1 er det højeste i hjernevæv efter oral CTE-administration.

2.5. Phenylethanoid Glycosider (1-3) Metalchelaterende aktivitet

I litteraturen blev bestemmelsen af ​​de fri for forbindelser og deres metalkompleks udført ved anvendelse af HPLC. Målingen af ​​chelationsaktivitet blev analyseret ved UPLC i denne undersøgelse. De 50 µg/mL opløsninger af hver af phenylethanoidglycosiderne (1-3) blev tilsat til en 10 µg/mL opløsning af kobber (Cu), calcium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), jern (Fe) ) eller henholdsvis rotteserum. Hver forbindelse med hver metalopløsning eller serum blev analyseret ved UPLC. Phenylethanoidglycosiderne (1-3) udviste metalchelaterende aktivitet med jern og serum (Figur 5, Supplerende Materialer Figur S1).

2.6. Analyse af Echinacoside (1) i rotteserum in Vivo

For at forstå fordelingen af ​​echinacosid i rotteserum blev serumet opsamlet fra den indledende tid til 720 minutter efter echinacosid (1) oral administration (100 mg/kg) og analyseret ved UPLC. Figur 6 viser koncentration versus tidsprofiler af echinacosid i rotteserum.

3. Diskussion

Demens, især AD, er en irreversibel aldring og kronisk sygdom, der fører til en gordisk knude af spørgsmål. Denne uoverstigelige sygdom fører til alvorlige økonomiske problemer med en enorm og stigende økonomisk byrde. På verdensplan har AD-forskere gjort en stor indsats for at undersøgenye anti-AD lægemidlermen mislykkedes i flere store kliniske forsøg rettet mod A i 2012. Bortset fra direkte rettet mod A, betragtes metalion-homeostase i hjernen som den vigtigste årsag relateret til A-aggregation og aflejring, som fører til AD-dannelse. Derfor spiller metalioner en væsentlig rolle i patogenesen af ​​AD, og ​​metalchelationshypotesen er blevet en vigtig forskningsretning.

Ifølge vores tidligere undersøgelser,CTE viste potentiel anti-demens aktivitet. Selv i humane kliniske studier, efter 1 års behandling med CTE-kapsler til moderate AD-patienter, ville Alzheimers Disease Assessment Scale-cognitive subscale (ADAS-cog)-score ikke vise signifikant forringelse sammenlignet med før behandling. CTE holdt ADAS-cog-scoren for AD-patienter stabil, men andre receptpligtige lægemidler gjorde det ikke. Det eneste valg af receptpligtig medicin licens tilAD behandlinger acetylkolinesterasehæmmere (AChEI'er) såsom donepezil og galanthamin, der forbedrer AD-symptomer på kort sigt, men forværring sker efter 1 års behandling. Baseret på kliniske studier har CTE mulighed for at være en potentiel behandling for udvikling af anti-AD-middel. Baseret på vores tidligere rapporter ville echinacosid (1), acteosid (2) og isoacteosid (3) beskytte neuroner mod beskadigelse af A, mindske A-oligomerisering in vitro og signifikant forbedre kognitiv dysfunktion induceret af A in vivo. In vitro-undersøgelsen viste, at de aktive doser på 1-3 var op til 5{{10}} µg/mL. Tidligere undersøgelser mente dog, at den orale biotilgængelighed af 1 og 2 var meget lav (0,83 % for 1 og 0,12 % for 2) hos rotter. Forbindelse 1 kunne ikke engang identificeres i humant serum efter oral echinacea-tabletadministration. Aktuelle undersøgelser viser, at 1-3 havde dårlig membranpermeabilitet og absorption i tarmceller, og det meste af 1 ville blive metaboliseret i mave-tarmkanaler. Indholdet af forbindelse 2 i rotteserum var kun ca. 4,5 µg/ml efter 15 minutters intravenøs injektion med en dosis på 10 mg/kg acteosid. Imidlertid viser denne undersøgelse, at 1-3 ville blive detekteret i hippocampus og striatum af rottehjernevæv efter CTE oral administration (figur 3 og 4). Derudover viste figur 6, at indholdet af forbindelse 1 i rotteserum steg ca. 5 gange fra 15 minutter til 720 minutter efter oral administration af forbindelse 1 (100 mg/kg). Vi overvejede, at phenylethanoidglykosider af CTE ville passere gennem blod-hjerne-barrieren, og der ville være chelationsvirkning mellem CTE og metallet. Chelation er en reversibel kemisk reaktion. Jern er et væsentligt element i serumet og hjernen [10,40]. Figur 5 viser, at tre phenylethanoidglycosider ville have metalchelaterende aktivitet med jern og serum. Jern og serum ændrer det maksimale retentionstidsareal for tre phenylethanoidglycosider. Jernchelat kan være den afgørende årsag, der fører til fejlidentifikation af den meget lave biotilgængelighed af phenylethanoidglycosider. Derfor bør metalchelateringsaktiviteten overvejes i blodserum- og hjerneanalyse af de tre CTE-phenylethanoidglycosider for at genvinde den reelle biotilgængelighed og farmakokinetik. Derudover viste resultaterne, at tre phenylethanoidglykosider (1-3) ville passere gennem blod-hjerne-barrieren og ankomme til hjernevæv gennem kropscirkulationen. Denne undersøgelse udviklede en meget hurtig og følsom metode til 1-3-analyse ved hjælp af UPLC/MS/MS og gav kraftfulde beviser for at bevise, at phenylethanoidglycosider (1-3) er de vigtigste bioaktive bestanddele af CTE.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FOREBYGGELSE AF ALZHEIMERS SYGDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materialer og metoder

4.1. Plantemateriale

Stængler af C. tubulosa blev indsamlet i maj 2016 fra Hangzhou, Kina. Planten blev identificeret af Dr. Lin HC Voucher-prøver (nr. 20016CT), der er blevet deponeret hos Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina.

4.2. Isolation og rensning

Den tørrede C. tubulosa-stængel blev formalet til pulver og derefter ekstraheret fem gange med 75 % EtOH. Efter opløsningsmiddelfordampning under reduceret tryk blev råekstrakten underkastet makroporøs harpiks AB-8-søjlekromatografi med H2O/EtOH-gradientopløsningsmiddelsystemer fra 20% EtOH op til 100% EtOH. Ifølge tyndtlagskromatografien blev fire fraktioner (Fr.1~Fr.4) opsamlet til yderligere adskillelse. Fr. 2 blev underkastet præparativ højtydende væskekromatografi (HPLC) på en COSMOSIL® 5C18-AR-II-søjle (250 mm × 20 mm id, 5 µm) under anvendelse af 18 % acetonitril som det mobile fasesystem. Strømningshastigheden var 15 ml/min. Tre hovedtoppe af interesse blev selektivt indsamlet. Fraktionerne indeholdende målforbindelserne blev yderligere kondenseret til tørhed og producerede henholdsvis 1, 2 og 3.

4.3. Eksperimentel Analyse

1H- og 13C NMR-spektre blev opnået under anvendelse af Bruker Avance DRX 500 MHz spektrometre (Billerica, MA, USA) med tetramethylsilan (TMS) som intern standard. Præparativ HPLC blev udført under anvendelse af en omvendt fase-søjle (Cosmosil C18-AR-II-søjle, 250 mm × 20 mm id; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) på en Shimadzu LC-6AD-serie apparat med Prominence HPLC UV-Vis detektorer (Kyoto, Japan).

Echinacoside (1): hvidt pulver; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{ {80}}}},9 Hz, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H-500), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H-200), δ 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 189}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (Figur S3-S5).

Acteosid (2): hvidt pulver; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94 (3H, d, J =5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H-100), 4,70 (1H, t , J=9.{{160}} Hz, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}}), 6,18 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H{{57} }), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz, H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60) , 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{95} } ), 69,2 (C-400), 70,3 (C-3000), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000), 70,6 (C{{110} } ), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{{125} }), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{{170} } ) (Figur S6-S8). Isoacteosid (3): hvidt pulver; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 1,07 (3H, d, J=6,1 Hz, H-6000), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H-1000), 6,27 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 ,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60), 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 ( 1H, d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9 (C-300), 100,7 (C-1000), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (Figur S9-S11).

4.4. Fremstilling af C. Tubulosa vandig ekstrakt (CTE)

Stænglen af ​​C. tubulosa-pulver blev ekstraheret to gange ved tilbagesvaling med vand i 1,5 time, og ekstraktopløsningen blev filtreret. Den filtrerede vandige ekstrakt (CTE) blev opbevaret ved 4 ◦C før brug.

4.5. Dyremodel og forsøgsskema

Den AD-lignende rottemodel og eksperimentelle tidsplan, der blev brugt i denne undersøgelse, var som foreskrevet i vores tidligere undersøgelse [19]. Efter infusion af A 1-42 (300 pmol/dag) i cerebral ventrikel i mindst to uger eller mere, fik de AD-lignende rotter CTE (200 mg/ml) ved oral administration den næste dag. Efter 14 dages administration blev rotter aflivet for at opsamle hjernevæv. For at undgå for store eksperimentelle fejl blev prøver fra fire individuelle rotter kombineret til én prøve. Der var tre prøver til hver gruppe.

4.6. Kemikalier og reagenser

Methanol (HPLC-kvalitet) blev købt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Myresyre (98 % til analyse, ACS) blev købt fra Panreac (Barcelona, ​​Spanien). Acetonitril (HPLC-kvalitet) blev købt fra JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Rent vand blev fremstillet under anvendelse af ELGA-systemet (Woodridge, UK). Hesperidin blev købt fra Chromadex og brugt som en intern standard (IS) til UPLC-analyse.

4.7. UPLC/MS/MS-apparat

Waters Acquity TQD ultra-performance væskekromatografi (UPLC)/MS/MS System (Milford, MA, USA) blev brugt til UPLC/MS/MS-analyse. De kromatografiske eksperimenter blev udført på en Acquity UPLC BEH C18-søjle (2,1 × 100 mm, 1,7 µm, Waters) under gradienteluering ved 0,4 ml/min flowhastighed. Den mobile fase var sammensat af myresyre-vand (1:1000, v/v) (A) og myresyre-acetonitril (1:1000, v/v) (B). Tidsprogrammet var som følger: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) ændret til A–B (62:38, v/v); 5-7 min, AB (62:38, v/v); 7-7.1 min, AB (62:38, v/v) ændret til A–B (92: 8, v/v); 7,1-9 ​​min. (92:8, v/v). Injektionsvolumenet var 5 µL i UPLC/MS/MS-systemet med en negativ elektrosprayionisering (ESI) ionkilde. De samlede ionkromatogrammer (TIC) for 1-3 blev udført ved hjælp af multipel-reaktionsovervågning (MRM) mode. Masseparametrene blev optimeret for at opnå de klareste højintensitetssignaler. Det bedste valg af parametre blev beskrevet som 3000 V kapillarspænding, 20 V keglespænding, 125 ◦C kildetemperatur, 400 ◦C desolvationstemperatur, 50 L/h keglegasflow, 900 L/h desolvationsgasflow og 38 eV kollision energi. Data blev behandlet af MassLynx 4.1 (Milford, MA, USA) software.

4.8. Prøveforberedelse

Rottehjernevæv brugte 50% methanol til homogenisering (1 g væv til 5 ml methanol). Homogenatet blev centrifugeret ved 10,000 rpm ved 4 ◦C i 10 min. Supernatanten (50 µL) med 10 µL IS (100 µg/ml) tilsatte rent vand til 1 ml. Blandingen blev forsigtigt sat på Oasis HLB (hydrofil-lipofil balanceret) patron (Waters, Milford, MA, USA), som allerede var blevet elueret med 1 ml methanol og derefter ækvilibreret med 1 ml vand under vakuumbetingelser. Efter at 1 mL 10% methanol var brugt til at vaske patronen, blev 1 mL methanol brugt til at eluere for at opnå den analyserede prøve, som blev overført til et andet 1,5 mL Eppendorf-rør med 10 μL 1% ascorbinsyreopløsning og tørret ved inddampning. Til sidst blev resten fra den analyserede prøve opløst i 200 µL 50% methanol til analyse.

4.9. Forberedelse af kalibreringsstandardkurven

Forbindelser 1-3 blev brugt til at fremstille kalibreringsstandarder, der blev tilsat henholdsvis hjernevævshomogenat og hesperidin som intern standard for at opnå de endelige kalibreringsstandardkoncentrationer, som var 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50,0 og 100,0 ng/ml.

4.10. Validering

Kalibreringsstandardkurven blev opnået ved hjælp af linearitetstesten med fem forskellige koncentrationer på 1-3 i intervallerne 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 og 100,0 ng/mL, henholdsvis og blev betragtet som lineær med over 0,99 bestemmelseskoefficient (R-kvadrat). Den nedre detektionsgrænse (LLOQ), defineret som ± 20 % af koncentrationen af ​​en testprøve, frembragte en signaltop frem for støj. Troværdigheden og nøjagtigheden af ​​analysemetoden blev evalueret ved hjælp af en genvindingstest ved 10 ng/mL på 1-3.

4.11. Metalchelaterende aktivitetsanalyse

UPLC blev brugt til at analysere metalchelateringseffekten ved hjælp af 50 µg/mL opløsning af CTE phenylethanoid glycosider 1-3 indeholdende 10 µg/mL af en metalopløsning af kobber, calcium, magnesium, zink, jern eller rotteserum. Hver forbindelse med hver metalopløsning eller serum blev analyseret ved UPLC. Metalchelateringseffekten ville ændre retentionstiden for 1-3 i væskekromatografi. Procentdelen af ​​metalchelaterende virkning blev beregnet som nedenfor, og dataene repræsenterede middelværdi ± SD (n=3).

5. Konklusioner

Denne undersøgelse viste, at 1-3 er de aktive komponenter i CTE for anti-AD aktivitet. Jernchelering er blevet det nye koncept til at designe en ny generation af lægemidler til behandling af AD.CTE er en potentiel botanisk anti-AD kinesisk medicinrettet mod jernchelationsinduceret A-aggregering og aflejring. Derudover beviste vi yderligere, at 1-3 ville nå hjernen gennem blod - blod-hjerne-barrieren (BBB). Aktive komponenter og underliggende mekanisme bekræftelse af CTE vil i høj grad hjælpe med kvalitetskontrol og biotilgængeligheden af ​​produktundersøgelser i fremtiden. Samtidig vil den præsenterede avancerede og effektive analysemetode være nyttig til at bestemme 1-3 i planter, fødevarer, blod og hjernevæv til kemisk fingeraftryk og farmakokinetisk forskning.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING AF ALZHEIMERS SYGDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%