Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang og Hang-Ching Lin

Abstrakt

Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt(CTE) bruges allerede som et botanisk receptpligtigt lægemiddel til behandling af demens i Kina. Vores tidligere undersøgelser rapporterede, at phenylethanoidglykosider af CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt) har anti-Alzheimers sygdom (AD) aktivitet ved at hæmme amyloid peptid (A) aggregering og aflejring. Nylige undersøgelser vurderede imidlertid, at phenylethanoidglykosiderne kan metaboliseres af tarmbakterier, fordi alle analyseresultater viste, at biotilgængeligheden af ​​phenylethanoidglykosider er ekstremt lav. I denne undersøgelse demonstrerer vi, hvordan jernkelering spiller en afgørende rolle i A-aggregations- og aflejringshæmningsmekanismen.phenylethanoid glycosideraf CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt). Derudover beviste vi yderligere, at phenylethanoidglykosider (1-3) kunne nå hjernen. Aktiv CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)Bekræftelse af komponent og virkningsmekanisme vil være en stor hjælp til produktkvalitetskontrol og biotilgængelighedsundersøgelser i fremtiden. Samtidig leverer vi en ny analysemetode, der er nyttig til bestemmelse af phenylethanoidglykosider (1-3) i planter, fødevarer, blod og væv til kemisk fingeraftryk og farmakokinetisk forskning.

Nøgleord: Cistanche tubulosa; phenylethanoidglycosider; Alzheimers sygdom; jernkelering

Cistanche tubulosa

1. Introduktion

Demens er en af ​​de mest almindelige kroniske ældningssygdomme. I 2015 anslog World Alzheimer Report, at omkring 46,8 millioner mennesker led af demens, og tallet forventes at være 74,7 millioner i 2030 og 131,5 millioner i 2050 [1]. Den globale demenspopulation vil stige år for år og komme ud af kontrol i fremtiden. De globale sundhedsudgifter til behandling af demens var næsten 604 milliarder amerikanske dollars i 2010, og beløbet forventes at være 1000 milliarder i 2030 [2]. Demenspatienter har større risiko for utilsigtet død [3] og kræver derfor mere lægehjælp. Dette er en stor belastning for demenspatienter pårørende. Indvirkningen af ​​demens på omsorgspersoner, familie og samfund kan forårsage stor fysisk, psykologisk, livs- og økonomisk stress. Der er to hovedformer for demens, Alzheimers sygdom (AD) og vaskulær demens [4,5]. AD er den mest almindelige demens og er en irreversibel og progressiv neurodegenerativ lidelse [4-6]. AD var den sjette hyppigste dødsårsag i USA i 2015 [6].

Nylige undersøgelser understøtter, at neurontoksiciteten induceret af amyloid peptid (A) (plaques) og protein tau (tangles) aggregering er tæt forbundet med AD patogenese. Ophobningen af ​​A og protein tau i hjernen kan føre til neuronskade og hukommelsestab [7]. Uopløselige A-oligomerer aggregerer i ekstracellulære plaques og blev rapporteret at føre til synaptisk dysfunktion, neurontoksicitet og celledød [8]. Desværre er der ingen effektiv behandling tilgængelig indtil videre til at fjerne A og protein tau eller hæmme dannelsen eller oligomeriseringen af ​​A og suspendere eller helbrede den irreversible neuronskade. De nuværende terapeutiske midler, såsom galantamin og donepezil, som er acetylcholinesterasehæmmere, kan kun midlertidigt forbedre hukommelsestab ved at hæve neurotransmitterniveauet. I 2012 var ingen lægemiddelkandidater i stand til at reducere A-effekten i store kliniske undersøgelser af AD-patienter [9]. Derfor er der et presserende behov for forskning for en ny behandling til at undertrykke forekomsten af ​​Alzheimers sygdom. Metalioner blev for nylig betragtet som en nøglefaktor, der er tæt forbundet med A-aggregering [10]. Metalchelatorer, der betragtes som potentielle blyforbindelser, giver en helt ny strategi for anti-AD-tilgangen [9,11-15].

Den tørrede stilk af Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, høstes bredt i Xinjiang, Kinas ørken. Det er en vigtig traditionel kinesisk medicin, der hører til tonic kinesisk medicin, der er indekseret i China Pharmacopeia og brugt i tusinder af år til behandling af fysisk svaghed, nyremangel, infertilitet, glemsomhed, impotens og senil obstipation [16,17].Cistanche tubulosa vandig ekstrakt(CTE) kapsler er blevet godkendt som et botanisk lægemiddel mod vaskulær demens i Kina. Ifølge et klinisk forsøg med 18 patienter diagnosticeret med mild til moderat AD, CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)kapsler gav patienterne en mere stabil hukommelsestilstand sammenlignet med acetylkolinesterasehæmmere [18]. I vores tidligere undersøgelse, CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)nedsat amyloid peptid (A) aflejring og forbedret hukommelsestab hos Alzheimers sygdom-lignende rotter [19]. Phenylethanoidglycosider, echinacoside (1), acteosid (2) og iso-acteosid (3) betragtes som hovedkomponenterne i CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)[20]. Forbindelse 1 har neurobeskyttende aktivitet mod toksiciteten af ​​1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) [21], 1-methyl -4-phenylpyridiniumion (MPP plus ) [22] og 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) [23]. Vores tidligere rapport viste, at 1 undertrykte A-oligomerisering og toksicitet i et in vitro-studie og hæmmede A-aflejring, hvilket forbedrede svækket hukommelse og kognitiv dysfunktion hos A-inducerede rotter [24]. Forbindelser 2 og 3 øgede A-nedbrydning og reducerede A-oligomerisering in vitro [25]. Forbindelse 3 reducerede A-aflejring i A-inducerede rotter [25]. Baseret på disse undersøgelser har C. tubulosa allerede bevist, at den har potentiale til at behandle AD. CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)er tæt forbundet med anti-A-aggregering og aflejring [24,25]. For bedre at forstå CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)mekanisme, skal vi have en bekvem og effektiv metode til at identificere den aktive komponent såvel som indholdet i hjernevævsprøver. De fleste undersøgelser var designet til kvantitativ bestemmelse af echinacosid, acteosid og iso-acteosid i urter eller fødevarer ved højtydende væskekromatografi (HPLC) [26-28], men kun to undersøgelser var til bestemmelse i serum eller væv [29, 30]. Der er dog ingen rapport om den samtidige analyse af 1-3 i hjernevæv efter CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)oral administration. Derudover er det stadig uklart fra nyere undersøgelser, om CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)aktive komponenter eller deres metabolitter passerede gennem blod-hjerne-barrieren og virkede på hjerneneuroner. Derfor giver denne forskning en avanceret og følsom metode med overbevisende beviser, der tydeligt illustrerer den underliggende mekanisme af CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)mod A-sammenlægning og aflejring.

Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt

2. Resultater

2.1. Isolering og identifikation af tre hovedforbindelser (1-3)

Tørrede stilke af C. tubulosa blev ekstraheret med 75% EtOH ved stuetemperatur. Den kondenserede 75% EtOH-ekstrakt blev underkastet harpiks- og C18-søjlekromatografi for at give tre hovedforbindelser, echinacosid (1), acteosid (2) og iso-acteosid (3). Deres strukturer blev belyst ved analyse af NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spektroskopi og ESI-MS (Electrospray ioniseringsmasse) og ved sammenligning med litteraturdata [31-33] (Figur 1, Supplerende materialer, figurer S3-S11).

2.2. Phenylethanoid Glycosider (1–3) indholdsanalyse fra CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)

Analysemetoden blev valideret til analyse af phenylethanoidglykosider. Forbindelser 1-3 (5,0 mg) blev nøjagtigt vejet og blandet med 50 procent methanol (40 ml). Blandingerne blev sonikeret i 5 min. Tre phenylethanoidglycosider (1-3) standardopløsning blev blandet som standardstamopløsningen (100 µg/ml). Standardstamopløsningen blev brugt til at fremstille fem forskellige koncentrationer (5, 10, 25, 50 og 100 µg/ml) af henholdsvis de angivne opløsninger ved at fortynde med serievolumener på 50 procent methanol. Phenylethanoid glycoside (1-3) kurver blev etableret ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi (UPLC) fra 5-100 µg/mL og var lineære henholdsvis (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Intra-dag- og inter-dag-præcisionen [procent RSD (relativ standardafvigelse) var fra 0,1 til 1,8 procent] og nøjagtighed (95,6-104,2 procent) var acceptabel af UPLC for 1-3. UPLC kvantificerede 1, 2 og 3 for CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)indholdet skal være henholdsvis 254, 38 og 41 mg/g (figur S2)

2.3. UPLC/MS/MS-validering

Phenylethanoid-glykosiderne (1-3) blev blandet og tilsat rottehjernevævshomogenat og analyseret ved hjælp af Ultra Performance væskekromatografi-tandem massespektrometer (UPLC/MS/MS) med fastfaseekstraktion. Den nedre detektionsgrænse (LLOQ) på 1-3 var 0,2 ng/mL. Genvindingen af ​​phenylethanoidglykosider tilsat hjernevævshomogenat (10 ng/ml) ved henholdsvis 91,39 procent for 1, 89,54 procent for 2 og 96,81 procent for 3 (figur 2).

2.4. Analyse af AD-lignende rottehjernevæv

Efter 14 dages CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)oral administration (200 mg/kg/dag), AD-lignende rottehjernevæv blev opsamlet og opdelt i to dele, hippocampus og striatum, og blev begge homogeniseret [19]. Fordi hippocampus- og striatum-homogenaterne fra hver rotte var for få til at blive indlæst i fastfase-ekstraktion og for at undgå for store eksperimentelle fejl, blev hippocampus- og striatum-homogenaterne fra fire individuelle rotter blandet i en analyseret prøve for UPLC/MS/MS ved hjælp af fastfaseekstraktionsmetode (figur 3A, B). Phenylethanoidglykosiderne (1-3) blev observeret i hippocampus (figur 3A) og striatum (figur 3B). Der var ingen signifikant top i tomme hjernevæv (figur 3C). I hippocampus var echinacosidindholdet 11,97 ± {{20}},34 ng/mL, acteosidindholdet var 1,25 ± 0,16 ng/mL, og isoacteosidindholdet var 1,38 ± 0,08 ng/ ml. I striatum var echinacosidindholdet 22,60 ± 1,69 ng/ml, acteosidindholdet var 2,03 ± 0,61 ng/ml, og isoacteosidindholdet var 4,90 ± 0,64 ng/ml. Som vist i figur 4 er CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)ville passere gennem blod-hjerne-barrieren ifølge de signifikante påviselige mængder af 1-3 i hippocampus og striatum. Indholdet af 1 er meget højere end 2 og 3 i CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)ved UPLC-analyse (figur S2). Derfor er det rimeligt at observere, at 1 er det højeste i hjernevæv efter oral CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)administration. Molecules 2019, 24, x FOR PEER REVIEW 4 af 12 2.4. Analyse af AD-lignende rottehjernevæv efter 14 dages CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)oral administration (200 mg/kg/dag), AD-lignende rottehjernevæv blev opsamlet og opdelt i to dele, hippocampus og striatum, og blev begge homogeniseret [19]. Fordi hippocampus- og striatum-homogenaterne fra hver rotte var for få til at blive indlæst i fastfase-ekstraktion og for at undgå for store eksperimentelle fejl, blev hippocampus- og striatum-homogenaterne fra fire individuelle rotter blandet i en analyseret prøve for UPLC/MS/MS ved hjælp af fastfaseekstraktionsmetode (figur 3A, B). Phenylethanoidglykosiderne (1-3) blev observeret i hippocampus (figur 3A) og striatum (figur 3B). Der var ingen signifikant top i tomme hjernevæv (figur 3C). I hippocampus var echinacosidindholdet 11,97 ± {{20}},34 ng/mL, acteosidindholdet var 1,25 ± 0,16 ng/mL, og isoacteosidindholdet var 1,38 ± 0,08 ng/ ml. I striatum var echinacosidindholdet 22,60 ± 1,69 ng/ml, acteosidindholdet var 2,03 ± 0,61 ng/ml, og isoacteosidindholdet var 4,90 ± 0,64 ng/ml. Som vist i figur 4 er CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)ville passere gennem blod-hjerne-barrieren ifølge de signifikante påviselige mængder af 1-3 i hippocampus og striatum. Indholdet af 1 er meget højere end 2 og 3 i CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)ved UPLC-analyse. Derfor er det rimeligt at observere, at 1 er det højeste i hjernevæv efter oral CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)administrator.

2.5. Phenylethanoid Glycosider (1-3) Metalchelaterende aktivitet

I litteraturen blev bestemmelsen af ​​de fri for forbindelser og deres metalkompleks udført ved anvendelse af HPLC [34,35]. Målingen af ​​chelationsaktivitet blev analyseret ved UPLC i denne undersøgelse. De 50 µg/mL opløsninger af hvert phenylethanoid glycosid (1-3) blev tilsat til en 10 µg/mL opløsning af kobber (Cu), calcium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), jern (Fe) eller henholdsvis rotteserum. Hver forbindelse med hver metalopløsning eller serum blev analyseret ved UPLC. Phenylethanoidglycosiderne (1-3) udviste metalchelaterende aktivitet med jern og serum (figur 5, supplerende materialer figur S1). Molecules 2019, 24, x FOR PEER REVIEW 5 af 12 prøver fra AD-lignende rotter efter CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)oral administration (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 min), 2 (tR= 5.13 min) og 3 (tR= 5.68 min)] . (c) Blankt hjernevæv. Figur 4. Phenylethanoidglykosiderne (1-3) kunne påvises i rottehjernevæv [19] ved hjælp af UPLC/MS/MS. Dataene repræsenterede middelværdi ± SD, n=3 for hver gruppe. 2.5. Phenylethanoid Glycosider (1-3) metalchelaterende aktivitet. I litteraturen blev bestemmelsen af ​​de fri for forbindelser og deres metalkompleks udført ved anvendelse af HPLC [34,35]. Målingen af ​​chelationsaktivitet blev analyseret ved UPLC i denne undersøgelse. De 50 ug/mL opløsninger af hvert phenylethanoid glycosid (1-3) blev tilsat til en 10 ug/mL opløsning af kobber (Cu), calcium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), jern (Fe) eller henholdsvis rotteserum. Hver forbindelse med hver metalopløsning eller serum blev analyseret ved UPLC. Phenylethanoid-glykosiderne (1-3)

2.6. Analyse af Echinacoside (1) i rotteserum in Vivo

For at forstå fordelingen af ​​echinacosid i rotteserum blev serumet opsamlet fra det indledende tidspunkt til 720 minutter efter echinacosid (1) oral administration (100 mg/kg), og serumet blev opsamlet fra det indledende tidspunkt til 720 minutter efter echinacosid. (1) oral administration (100 mg/kg) og analyseret ved UPLC. Figur 6 viste koncentration versus tidsprofiler af echinacosid i rotteserum.

3. Diskussion

Demens, især AD, er en irreversibel aldring og kronisk sygdom, der fører til en gordisk knude af spørgsmål. Denne uoverstigelige sygdom fører til alvorlige økonomiske problemer med en enorm og stigende økonomisk byrde. På verdensplan bruger AD-forskere mange kræfter på at undersøge nye anti-AD-lægemidler, men mislykkedes i flere store kliniske forsøg rettet mod A i 2012 [9]. Bortset fra direkte målretning mod A, betragtes metalion-homeostase i hjernen som den vigtigste årsag relateret til A-aggregation og aflejring, som fører til AD-dannelse [9,10]. Derfor spiller metalioner en væsentlig rolle i patogenesen af ​​AD, og ​​metalchelationshypotesen er blevet en vigtig forskningsretning [9,13-15].

Ifølge vores tidligere undersøgelser [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)udvist potentiel anti-demens aktivitet. Selv i humane kliniske undersøgelser, efter 1 års behandling med CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)kapsler til moderate AD-patienter, ville Alzheimers Disease Assessment Scale-cognitive subscale (ADAS-cog)-score ikke vise signifikant forringelse sammenlignet med før behandling [18]. CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)holdt ADAS-tandscoren for AD-patienter stabil, men andre receptpligtige lægemidler gjorde det ikke. Det eneste valg af receptpligtige lægemidler godkendt til AD-behandling er acetylcholinesterasehæmmere (AChEI'er) såsom donepezil og galanthamin, der forbedrer AD-symptomer på kort sigt, men forværring sker efter 1 års behandling [36]. Baseret på kliniske undersøgelser, CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)har mulighed for at være en potentiel behandling for udvikling af anti-AD-middel. Baseret på vores tidligere rapporter [24,25], ville echinacosid (1), acteosid (2) og iso-acteosid (3) beskytte neuroner mod beskadigelse af A, mindske A-oligomerisering in vitro og signifikant forbedre kognitiv dysfunktion induceret af A in vivo. In vitro-undersøgelsen viste, at de aktive doser på 1-3 var op til 50 ug/ml [24,25]. Men tidligere undersøgelser vurderede, at den orale biotilgængelighed af 1 og 2 var meget lav (0,83 procent for 1 og 0,12 procent for 2) hos rotter [29,30]. Forbindelse 1 kunne ikke engang identificeres i humant serum efter oral administration af echinacea-tablet [37]. Nuværende undersøgelser viser, at 1-3 havde dårlig membranpermeabilitet og absorption i tarmceller [38], og det meste af 1 ville blive metaboliseret i mave-tarmkanaler [39]. Indholdet af forbindelse 2 i rotteserum var kun omkring 4,5 ug/ml efter 15 minutters intravenøs injektion med en dosis på 10 mg/kg acteosid [30]. Imidlertid viser denne undersøgelse, at 1-3 ville blive påvist i hippocampus og striatum af rottehjernevæv efter CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)oral administration (figur 3 og 4). Derudover viste figur 6, at indholdet af forbindelse 1 i rotteserum steg ca. 5 gange fra 15 minutter til 720 minutter efter oral administration af forbindelse 1 (100 mg/kg). Vi overvejede phenylethanoidglykosider af CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)ville passere gennem blod-hjerne-barrieren, og der ville være chelationsvirkning mellem CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)og metallet. Chelation er en reversibel kemisk reaktion. Jern er det væsentlige element i serum og hjernen [10,40]. Figur 5 viser, at tre phenylethanoidglycosider ville have metalchelaterende aktivitet med jern og serum. Jern og serum ændrer tydeligvis peak-retentionstidsområdet for tre phenylethanoidglycosider. Jernchelat kan være den afgørende årsag, der fører til fejlidentifikation af den meget lave biotilgængelighed af phenylethanoidglykosider. Derfor bør metalchelateringsaktiviteten overvejes i blodserum- og hjerneanalyse af de tre CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt)phenylethanoid glycosider for at genvinde den reelle biotilgængelighed og farmakokinetik. Derudover viste resultaterne, at tre phenylethanoidglykosider (1-3) ville passere gennem blod-hjerne-barrieren og ankom til hjernevæv gennem kropscirkulationen. Denne undersøgelse udviklede en meget hurtig og følsom metode til 1-3-analyse ved hjælp af UPLC/MS/MS og gav kraftfulde beviser for at bevise, at phenylethanoidglykosider (1-3) er de vigtigste bioaktive bestanddele af CTE(Cistanche tubulosa vandigt ekstrakt).

Cistanche tubulosa ekstrakt

4. Materialer og metoder

4.1. Plantemateriale

Stængler af C. tubulosa blev indsamlet i maj 2016 fra Hangzhou, Kina. Planten blev identificeret af Dr. Lin HC. Kuponprøver (nr. 20016CT) er blevet deponeret hos Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina.

4.2. Isolation og renselse

Den tørrede C. tubulosa-stængel blev formalet til pulver og derefter ekstraheret fem gange med 75 procent EtOH. Efter opløsningsmiddelfordampning under reduceret tryk blev råekstrakten underkastet Macroporousresin AB-8-søjlekromatografi med H2O/EtOH-gradientopløsningsmiddelsystemer fra 20 procent EtOH op til 100 procent EtOH. Ifølge tyndtlagskromatografien blev fire fraktioner (Fr.1~Fr.4) opsamlet til yderligere adskillelse. Fr. 2 blev underkastet præparativ højtydende væskekromatografi (HPLC) på en COSMOSIL® 5C18-AR-II-søjle (250 mm × 20 mm id, 5 µm) under anvendelse af en 18 procent acetonitril som det mobile fasesystem. Fælleshastigheden var 15 ml/min. Tre hovedtoppe af interesse blev selektivt indsamlet. Fraktionerne indeholdende målforbindelserne blev yderligere kondenseret til tørhed og producerede henholdsvis 1, 2 og 3.

4.3. Eksperimentel Analyse

1H- og 13C NMR-spektre blev opnået under anvendelse af Bruker Avance DRX 500 MHz-spektrometre (Billerica, MA, USA) med tetramethylsilan (TMS) som intern standard. Præparativ HPLC blev udført under anvendelse af en omvendt fase-søjle (Cosmosil C18-AR-II-søjle, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japan) på en Shimadzu LC-6AD-serie apparat med Prominence HPLC UV-Visdetektorer (Kyoto, Japan).

Echinacoside (1):hvidt pulver; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H{{10} }), 2,79 (2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha{{20}}), 3,79 (1H, m, H-30),3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J=7,9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2.0 Hz,H-6), 6.67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H{ {86}} ), 6,94 (1H,dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}}), δ 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 124}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2),76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 188}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 203}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 218}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (Figur S3-S5)

Acteosid (2):hvidt pulver; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94(3H, d, J =5.9 Hz, H{{1{{ 156}}}}), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{20}}), 4,70 (1H, t, J=9,0 Hz, H-400), 5,01 (1H, s, H-1000), 6,18 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7.9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, d, J=7 ,1Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz , H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60), 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H , d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000), 35,1(C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{94} } ), 69,2 (C-400), 70,3 (C-3000), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000), 70,6 (C{{109} } ), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{{124} } ), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{{139} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{154} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6(C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{{169} } ) (Figur S6-S8).

Iso-acteosid (3):hvidt pulver; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz):δ 1.07 (3H, d, J=6.1 Hz, H{{10} }), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H{{ 24}} ),6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,73(1H, d, J=1,6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60) , 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9(C-300), 100,7 (C-1000), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6(C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (Figur S9-S11).

4.4. Fremstilling af Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt (CTE)

Stilken af ​​Cistanche tubulosa-pulver blev ekstraheret to gange ved tilbagesvaling med vand i 1,5 time, og ekstraktopløsningen blev filtreret. Den filtreredeCistanche tubulosavandigt ekstrakt(CTE) blev opbevaret ved 4 ◦C før brug.

5. Konklusioner

Denne undersøgelse viste, at 1-3 er den aktive komponent i CTE for anti-AD aktivitet. Jernchelering er blevet det nye koncept til at designe en ny generation af lægemidler til behandling af AD [41]. CTE er en potentiel botanisk anti-AD kinesisk medicin rettet mod jernchelationsinduceret A-aggregering og aflejring. Derudover beviste vi yderligere, at 1-3 ville nå hjernen gennem blod-hjerne-barrieren (BBB). Aktive komponenter og underliggende mekanisme bekræftelse af CTE vil i høj grad hjælpe med kvalitetskontrol og biotilgængeligheden af ​​produktundersøgelser i fremtiden. Samtidig vil den præsenterede avancerede og effektive analysemetode være nyttig til at bestemme 1-3 i planter, fødevarer, blod og hjernevæv til kemisk fingeraftryk og farmakokinetisk forskning.

Referencer

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et al. Den skiftende forekomst og forekomst af demens over tid - aktuelle beviser. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327-339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Demens: Rettidig diagnose og tidlig intervention. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Overlevelsen og karakteristika for ældre mennesker med og uden demens, der er indlagt efter forsætlig selvskade. Int. J. Geriatr. Psyk. 2017, 32, 892-900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Forekomst af Alzheimers sygdom og vaskulær demens: tilknytning til uddannelse. Rotterdam-undersøgelsen. BMJ 1995, 310, 970-973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Hall, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potocnik, F.; et al. Alzheimers sygdom og vaskulær demens i udviklingslande: prævalens, håndtering og risikofaktorer. Lancet. Neurol. 2008, 7, 812-826. [CrossRef]

6. Fakta og tal om Alzheimers sygdom 2018. Alzheimers demens. 2018, 14, 367-429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Amyloidhypotesen om Alzheimers sygdom: Fremskridt og problemer på vejen til terapi. Science 2002, 297, 353-356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM Alzheimers sygdom. N. Engl. J. Med. 2010, 362, 329-344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metallostase ved Alzheimers sygdom. Fri Radik. Biol. Med. 2013, 62, 76-89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Metalioneffekter på A- og Tau-aggregation. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Regulering af kobber- og jernhomeostase af metalchelatorer: En mulig kemoterapi for Alzheimers sygdom. A. Chem. Res. 2015, 48, 1332-1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Kobber(I)-chelatorer til Alzheimers sygdom. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304-11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Nylige fremskridt inden for multifunktionelle metalchelatorer som potentielle lægemidler til Alzheimers sygdom. Coord. Chem. Rev. 2016, 327-328, 287-303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metallomics til behandling af Alzheimers sygdom: Brug af en ny generation af chelatorer, der kombinerer metal-kation-binding og transportegenskaber. Eur. J. Med. Chem. 2018, 150, 140-155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Metal-involveret terapi: En ny strategi til bekæmpelse af Alzheimers sygdom. Coord. Chem. Rev. 2018, 362, 72-84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN kinesisk farmakopé; Kemisk og industriel udgiver: Beijing, Kina, 2005; s. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): En af de bedste farmaceutiske gaver inden for traditionel kinesisk medicin. Foran. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. En åben, ikke-placebokontrolleret undersøgelse af Cistanche tubulosa glycosidkapsler (memo regain (R)) til behandling af moderat Alzheimers sygdom. Er. J. Alzheimers Dis. Andre Demen. 2013, 28, 363-370. [CrossRef]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversering af vandige ekstrakter af Cistanche tubulosa fra adfærdsmæssige underskud i Alzheimers sygdomslignende rottemodel: Relevans for amyloidaflejring og central neurotransmitterfunktion. BMC komplement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Analyse af phenylethanoidglycosider i ekstraktet af herba Cistanchis ved LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839-842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Neuroprotektive virkninger af echinacosid i muse-MPTP-modellen af ​​Parkinsons sygdom. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66-74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Ja, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside beskytter mod MPP(plus)-induceret neuronal apoptose via ROS/ATF3/CHOP-vejregulering. Neurosci. Tyr. 2016, 32, 349-362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside beskytter mod 6-hydroxydopamin-induceret mitokondriel dysfunktion og inflammatoriske reaktioner i PC12-celler ved at reducere ROS-produktion. Evid. Baseret komplement. Alternativ. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside forbedrer hukommelsessvækkelsen og det kolinerge underskud induceret af amyloid-beta-peptider via hæmning af amyloidaflejring og toksikologi. Mad funktion. 2017, 8, 2283-2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Acteosid og iso-acteosid beskytter amyloid-beta-peptid-induceret cytotoksicitet, kognitivt underskud og neurokemiske forstyrrelser in vitro og in vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. [CrossRef]