In vitro og silico indsigt i tyrosinasehæmmere

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a

Abstrakt

Tyrosinase er et nøgleenzym, der er ansvarlig for melaninbiosyntese og er effektivt til at beskytte hudskader forårsaget af ultraviolet stråling. Som en del af igangværende bestræbelser på at opdage potente tyrosinasehæmmere har vi systematisk designet og syntetiseret tretten (E)-benzyliden-1-indanonderivater (BID1-13) og bestemt deres hæmmende aktiviteter mod tyrosinase. Blandt de evaluerede forbindelser var BID3 den mest potente inhibitor af svampetyrosinase (IC50=0.034 mM, mycophenolataktivitet; IC50=1.39 mM,diphenolaktivitet). Kinetiske undersøgelser viste, at BID3 viste en blandet type tyrosinaseinhibering med en Ki-værdi på 2,4 mM under anvendelse af L-DOPA som et substrat. Molecular docking-simuleringer i silico viste, at BID3 kan binde til de katalytiske og allosteriske steder af tyrosinase for at hæmme enzymaktivitet, hvilket bekræftede in vitro eksperimentelle undersøgelser mellem BID3 og tyrosinase. Endvidere faldt melaninindholdet, og cellulær tyrosinaseaktivitet blev hæmmet efter BID3-behandling. Disse observationer afslørede, at BID3 er en potent tyrosinaseinhibitor og potentielt kunne bruges som et blegemiddel til behandling af pigmenteringsrelaterede lidelser.

Cistanche: hudblegemiddel urt

1. Introduktion

Melanin syntetiseres af melanocytter i vasallaget af epidermis refererer generelt til familien af ​​pigmenter, der er almindeligt kendt for at beskytte pattedyrs hud mod skader forårsaget af skadelig UV-stråling ved at fjerne frie radikaler eller sprede indkommende UV-lys [1]. Imidlertid kan rigelig generering af melanin forårsage synlig hyperpigmentering af epidermis, hvilket kan være tydeligt som melasma, fregner, alderspletter eller senile lentiginer[2].

Tyrosinase (EC 1.14.18.1), et kobberholdigt metalloenzym, er et nøgleenzym involveret i melanogene processer. Tyrosinase katalyserer de to hastighedsbegrænsende trin i melanogenese; hydroxylering af tyrosin (cresolase- eller mycophenolataktivitet) for at producere 3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) og den efterfølgende oxidation af L-DOPA (catecholase- eller diphenolaktivitet) til den tilsvarende DOPA-quinon. Når L-tyrosin er substratet, er produktet af tyrosinase-katalyseret reaktion DOPA-quinon, som derefter omdannes til melanin [3]. Disse trin er afgørende for beskyttelsen af ​​huden mod UV-skader. Mushroom Agaricus er vant til sin kommercielt tilgængelige og høje homologi med mammaliantyrosinase-enzym, hvilket gør den velegnet som model til undersøgelse af melanogenese [4]. Hos mennesker hjælper melanin med at beskytte huden mod skader forårsaget af UV [5]. Imidlertid kan det overskydende niveau af melanin forårsage forskellige dermatologiske lidelser, herunder hyperpigmenteringer, melasma, fregner og alderspletter [6]. Derfor er newtyrosinasehæmmere, der udviser lægemiddellignende og hudblegende egenskaber, nødvendige for at hæmme overdreven hudpigmentering.

1-Indanon, med et benzoyl-cyclopentanon-skelet, betragtes som chalconernes stive fætre, der inkorporerer det umættede ketonsystem af chalconer, der danner en cyklisk 5-leddet ring, som er en naturligt forekommende komponent, der findes i forskellige spiselige plantekilder [7 ]. Adskillige undersøgelser har vist, at forbindelser med en 1-indanon-del har farmakologisk betydning, da de udviser forskellige gavnlige biologiske aktiviteter, herunder anti-inflammatorisk [8-10], anticancer [11,12], antioxidant [13], anti-Parkinsons sygdom [14], anti-Alzheimer sygdom[15-17], antimikrobielle [18], anti-immunundertrykkende [19], og anti-tyrosinase [20] egenskaber.

Chalconer (1,3-diaryl-2-egentlige-1-oner) er aromatiske ketoner, der består af to aromatiske ringe forbundet til et tre-carbon a,b-umættet carbonylsystem som en central kerne [21, 22]. Disse er naturligt forekommende komponenter, der findes i forskellige spiselige naturlige planter og betragtes som forløberforbindelser for en syntetisk rute af flavonoider og isoflavonoider, såsom pyrazoliner, pyrimidin, flavanol, flavoner, flavanoner, isoflavoner, auroner, anthocyanidin, dihydroflavanol5 og dihydrochylsyre [23–225]. Det a,b umættede carbonylsystem er altafgørende for typen af ​​biologisk aktivitet, da disse systemer er fordelt i mange naturlige produkter som chalconer såvel som indanon, hvor molekylerne er relativt mere plane, og transmissionen af ​​de elektroniske effekter af arylsubstituenterne er rettet. til carbonylgruppen [7]. Tidligere rapporterede mange forskere, at chalconer blev fremhævet som en ny klasse af tyrosinasehæmmere i flere publikationer [26-29]. For nylig designet og syntetiserede Kim og kolleger [30,31] serier af chalconderivater og evaluerede dem for deres in vitro anti- tyrosinase og anti-melanogene aktiviteter mod murine melanocytter.

Ifølge vores tidligere rapporterede data viste derivater med an(E)-b-phenyl-a,b-umættet carbonylstillads potenttyrosinasehæmning [32-34]. (E)-Benzyliden-1-indanoner kan være et attraktivt anti-melanogene middel, da forbindelserne har det (E)-b-phenyl-a,b-umættede carbonylstillads i deres kemiske struktur. Navnlig Radhakrishnan et al. (2015) [20]designede og syntetiserede en række benzyliden-1-indanonderivater med en (Z)-konfiguration og evaluerede dem for anti-tyrosinase-aktivitet. Selvom disse (Z)-benzyliden-1-indanonderivater er blevet undersøgt, er anti-tyrosinase og anti-melanogene aktiviteter af (E)-benzyliden-1-indanonderivater endnu ikke blevet undersøgt.

Derfor designede og syntetiserede vi tretten forbindelser (BID1-13) af 1-indanonskelettet, der bærer en (E)-form benzyliden. Blandt disse syntetiske forbindelser udviste en 2,4-dihydroxygruppe på B-ringen af ​​1-indanon den største tyrosinaseinhibering (ca. 400-fold mere effektiv end kojinsyre, positiv kontrol). Desuden evaluerer vi yderligere BID3 tyrosinaseinhiberende aktivitet samt at karakterisere dens regulerende rolle i melaninsyntese ved hjælp af B16F10 melanomceller. I udvidede eksperimenter evaluerede vi det anti-melanogene potentiale af BID3 og søgte at identificere enzymkinetikken og molekylære dockingstudier. I successive eksperimenter blev BID3-cellulært tyrosinasepotentiale og melaninproduktion i a-MSH- og IBMX-inducerede B16F10-melanomceller også undersøgt.

ANTI-OXIDATION OG HUDBEHANDLING: CISTANCHE EXTARCT

2. Materialer og metoder

2.1. Reagenser

Svampetyrosinase (EC 1.14.18.1), alfa-melanocytstimulerende hormon (a-MSH), 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), L-tyrosin, L-3,{{ 11}}dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), dimethylsulfoxid (DMSO), kojinsyre, phthalsyre og transkanelsyre blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS), streptomycin og amphotericin blev købt fra WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Sydkorea). Alle andre reagenser blev købt fra Sigma-Aldrich.

cistanche tubulosa ekstrakt

2.2. Kemi

2.2.1. Generelle metoder

Alle reagenser blev opnået kommercielt og anvendt uden yderligere oprensning. Tyndtlagskromatografi (TLC) og søjlekromatografi blev udført på henholdsvis Merck præcoatede 60F245-plader og MP Silica 40-63, 60 Å. Massespektroskopidata med høj opløsning (HR) blev opnået på et Agilent AccurateMass quadruple-time of flight (Q-TOF) væskekromatografi (LC) massespektrometer (Agilent, Santa Clara, CA, USA) i ESI positiv tilstand. Kernemagnetisk resonans (NMR) spektre blev optaget på et Varian Unity INOVA 400 spektrometer eller et Varian UnityAS500 spektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) for 1H NMR (400 og 500 MHz) og for 13C NMR (hhv. 100 MHz), . DMSO d6, CD3OD og CDCl3 blev brugt som NMR-opløsningsmidler til NMR-prøver. Koblingskonstant (J) og kemiske skiftværdier blev målt i henholdsvis hertz (Hz) og dele pr. million (ppm). Forkortelserne anvendt i analysen af ​​1H NMR-data er som følger: s (singlet), bs (bred singlet), d (dublet), dd (dublet af dubletter), t (triplet), TD (triplet af dubletter), q ( kvartet), andm (flere).

2.2.2. Procedure for syntese af BID1–13

En opløsning af benzaldehyd (1,1-1,2 ækv.) og 1-indanon (100 mg, 0,76 mmol) i 1 M i HCl-eddikesyre (0,4 ml) blev omrørt ved stuetemperatur i 4-48 timer. Efter tilsætning af vand blev bundfaldet filtreret og vasket med vand og hexan: ethylacetat (1:1), hexan: dichlormethan (4:1-1:1) eller en blanding af dichlormethan og methanol, afhængigt af egenskaberne af de resterende benzaldehyder for at give (E)-benzyliden-1-indanoner (BID1-13) i udbytter på 32,8-99,1 procent. Strukturel karakterisering (1H og 13C NMR og massedata for alle BID'er) af syntetiserede forbindelser er angivet i Supplerende oplysninger.

2.2.2.1. (E)-2-(4-Hydroxybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on(BID1).

Gult fast stof; udbytte 93,4%; reaktionstid, 6 timer; molekylformel, C16H12O2; smp. 224,7-225,9 C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,64-7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinyl H), 7,39 (t,1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3,99 (s, 2H, CH2); 13c NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193,9, 160,1, 150,4, 138,3,135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 126,7, 124,1, 116,7, 32,6; Hrms (Esi Plus) M/Z C16H13O (M Plus H) plus beregnet 237,0910, observeret 237,0911.

2.2.2.2. (E)-2-(3,4-dihydroxybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID2).

Gult fast stof; udbytte, {{0}},6 procent ; reaktionstid, 5 timer; molekylformel, C16H12O3; smp. 251,2-252,4°C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7 ,6 Hz, 7-H), 7,66-7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35 }},2 Hz, 6-H), 7,35 (s, 1H, vinylisk H), 7,19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3, 138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 127,1, 127,1, 127,1, 127,1, 127,0, 127,1, 127,0, 127,0, 127,1, 127,0 HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus beregnet 253,0859, observeret 253,0857.

2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihydroxybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID3).

Gult fast stof; udbytte, 5{{20}},9 procent ; reaktionstid, 10 timer; molekylformel, C16H12O3; smp. 198,5-199,9°C (dek.); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinyl H), 7,82 (d, 1 H, J=8,0 Hz, 60-H), 7,67-7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 127,2, 127,2, 127,2, 127,2, 127,9, 127,2, 127,2, 127,2, 127,2, 127,2, 127,1 HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus beregnet 253,0859, observeret 253,0858.

2.2.2.4. (E)-2-(4-Hydroxy-3-methoxybenzyliden)-2,3-dihydro-1Hinden-1-on (BID4).

Gult fast stof; udbytte, 52.0 procent ; reaktionstid, 4 timer; molekylformel, C17H14O3; smp. 186,9-187,4°C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,67-7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43(t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinylisk H), 7,24 (dd, 1H, J=8,0,2,0 Hz, 60-H), 6,87 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 4,05 (s, 2H, CH2 3,84 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 127,1, 12,5, 127,1, 127,3, 127,1,12. HRMS (ESI plus) m/z C17H15O3(M plus H) plus beregnet 267,1016, observeret 267,1016.

2.3. Biologisk vurdering

2.3.1. Svampe tyrosinaseinhiberende assay

Tyrosinaseinhiberende aktivitetsassay blev udført under anvendelse af svampe-tyrosinase som beskrevet tidligere, med mindre modifikation[35,36]. Kort fortalt blev 10 mL af en specificeret koncentration af hver forbindelse (0,0005-50 mM) og 20 mL svampetyrosinase (1000 enheder/mL) i en 50 mM fosfatbuffer (pH 6,5) tilsat til en 170 mL reaktion blanding i en 96-brønd mikroplade (Corning, USA). Forholdet mellem 1 mM L-tyrosin eller L-DOPA opløsning, 50 mM kaliumphosphatbuffer (pH 6,5) og destilleret vand var 10:10:9. Reaktionsblandingerne blev inkuberet ved 37°C i 30 min. Derefter blev mængden af ​​produceret dopakrom i hver brønd målt ved spektrofotometrisk analyse ved 492 nm (OD492) under anvendelse af en mikropladelæser. Tyrosinaseinhiberingsraten (procent) blev beregnet som (1 absprøve/abskontrol) 100 pct. Graden af ​​prøveinhibering blev udtrykt som den nødvendige koncentration for 50 procent inhibering (IC50).

2.3.2. Enzym kinetisk analyse med tyrosinase

For at bestemme de kinetiske mekanismer for inhibering blev to komplementære kinetikmetoder brugt: Lineweaver-Burk og Dixonplots [37-39]. Ved at bruge Lineweaver-Burk-plot (dobbelte reciproke plots) blev inhiberingstypen af ​​BID3 bestemt under anvendelse af forskellige koncentrationer af L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 og 1 mM), som substrater, i fravær og tilstedeværelse af forskellige koncentrationer af BID3 (1, 2 og 4 lM). Et Dixon-plot (enkelt gensidigt plot) fortyrosinase-hæmning blev opnået i nærværelse af forskellige koncentrationer af L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 og 1 mM ). Koncentrationerne af BID3 var 1, 2 og 4 mM. De enzymatiske procedurer bestod af de tidligere beskrevne tyrosinase-assaymetoder. Inhiberingskonstanten (Ki) blev bestemt ud fra fortolkningen af ​​Dixon-plot.

2.3.3. Tyrosinase molekylære dockingsimuleringer

For at bestemme strukturen af ​​enzym-hæmmerkomplekset og sikre nøjagtighed, repeterbarhed og pålidelighed af dockingresultaterne, brugte vi AutoDock4.2-software. Til dicking-undersøgelser blev krystalstrukturerne af svampetyrosinaseproteinmål opnået fra proteinsekvensjusteringen (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Automatiserede docking-simuleringer blev udført mellem tyrosinase og kojinsyre, phthalsyre, kanelsyre eller BID3. Til docking-proceduren: omdannet 2D til 3D-strukturer, beregnede ladninger og tilsatte hydrogenatomer ved hjælp af ChemOffice-programmet (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5 blev brugt til forudsigelse af mulige interaktioner mellem ligander og tyrosinase og identifikation af farmakoforer.

2.3.4. Cellekultur og cellelevedygtighedsanalyse

Murine melanom B16F10-celler blev købt fra Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) og dyrket i DMEM suppleret med 10 procent FBS og 1 procent streptomycin og derefter inkuberet ved 37 C, befugtet med 5 procent atmosfærisk CO2. Cellelevedygtighedsanalyser blev udført som tidligere beskrevet [42]. Kort fortalt blev celler podet med en tæthed på 1 104 celler/brønd i en 96-brøndsplade i 24 timer. Den følgende dag blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af BID3 og inkuberet i henholdsvis 24 eller 48 timer. Derefter blev 10 ml EZ-Cytox-opløsning tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 2-4 timer. Absorbans blev bestemt ved anvendelse af ELISA ved en bølgelængde på 450 nm. Hvert assay blev udført i tre eksemplarer.

2.3.5. Melaninindholdsanalyse

Melaninindholdet blev bestemt som beskrevet tidligere [43]. B16F10 melanomceller (2 105 celler/brønd) blev podet i 6-brøndskulturplader. For at bestemme den inhiberende effekt af BID3 på melanogenese blev frisk medium erstattet med medium indeholdende BID3 (1, 5 og 10 lM) eller kojinsyre (10 mM) som en positiv kontrol i 1 time og derefter stimuleret med a-MSH (5 lM) ) og IBMX (200 mM) i 48 timer. Efter at være blevet vasket to gange med PBS, blev cellerne adskilt ved inkubation i trypsin/EDTA, og pellets blev opløst i 100 ml 1 N NaOH og derefter inkuberet ved 60 C i 1 håndblandet for at solubilisere melaninet. Melaninindholdet blev bestemt ved at måle absorbans ved 405 nm ved hjælp af ELISA-læseren (TECAN, Sunrise, Østrig). Melaninindholdet blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: (prøve/kontrol) - 100 procent. Alle bestemmelser blev udført i tre eksemplarer.

2.3.6. Cellulær tyrosinaseaktivitet

Cellulær tyrosinaseaktivitet blev vurderet som tidligere beskrevet med små modifikationer [44,45]. Kort fortalt blev 2 105/celler udpladet i 6-brøndskåle og inkuberet natten over. Cellerne blev udsat for forskellige koncentrationer af BID3 (1, 5 og 10 mM) orkojinsyre (10 mM) i 1 time og efterfølgende stimuleret med a-MSH (5 mM) og IBMX (200 mM) i 48 timer. Efter at være blevet skyllet to gange med PBS, blev cellerne lyseret med 100 ml lyseringsopløsning indeholdende 50 mM phosphatbuffer (pH 6,5), 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 procent Triton X-100 og frosset ved 80°C i 30 min. Lysater blev optøet og centrifugeret ved 12, 000 rpm i 30 minutter ved 4 C. Derefter blev supernatanten (80 ml) kombineret med 2 mg/ml L-DOPA (20 ml) i en 96-brøndsplade . Efter inkubation ved 37°C i 30 minutter blev den optiske tæthed ved 492 nm målt ved hjælp af en ELISA-læser (TECAN, Salzburg, Østrig). Proteinkoncentrationen blev bestemt under anvendelse af et BCA-proteinassay-reagens under anvendelse af BCA som standard (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Cistanche ekstrakt fordel: hæmmer tyrosinase.

2.3.7. Statistisk analyse

Alle data præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdien (SEM). Dataene blev analyseret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) for at bestemme forskelle mellem behandlinger, efterfulgt af Bonferroni posthoc testen. En værdi på p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

3. Resultater og diskussioner

3.1. Kemi

(E)-benzyliden-1-indanonderivaterne (BID1-13) blev syntetiseret i overensstemmelse med det generelle skema 1. I denne nuværende undersøgelse blev tretten (E)-2-benzyliden-1-indanonderivater syntetiseret og deres tyrosinaseinhiberende egenskaber blev undersøgt. Target (E)-2-benzyliden-1-indanonderivater blev syntetiseret under anvendelse af sure (1 M HCl i eddikesyre) betingelser. Disse reaktioner genererede target (E)-2-benzyliden-1- indanonderivater i udbytter på 32,8-99,1 procent . Det ser ud til, at kun E-isomererne af 2-benzyliden-1-indanoner blev genereret på grund af A-stammen kendt som 1,3-allylstammen. A-stammen (sterichindrance) mellem phenylringen og carbonylgruppen i Z-isomeren er tilsyneladende større end den mellem phenylringen og methylengruppen i E-isomeren. Strukturerne af syntetiske forbindelser blev verificeret ved 1H og 13C NMR og massespektrometri som beskrevet i det eksperimentelle afsnit (fig. S1-S38). Især er det kemiske skift af olefinisk proton afskærmet i E-isomeren af ​​2- benzyliden på grund af den anisotrope virkning af carbonylgruppen og vises downfield (over 7 ppm) sammenlignet med Z-isomeren (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">

Skema 1. Syntese af (E)-2-benzyliden-1-indanoner.

3.2. Tyrosinaseinhiberende egenskaber af forbindelser

Det tyrosinaseinhiberende potentiale af (E)-benzyliden-1-indanon-derivaterne blev undersøgt ved hjælp af svampetyrosinase. Mycophenolatet (L-tyrosin) og diphenolerne (L-DOPA) blev brugt som substrater til disse eksperimenter [35]. Enzymreaktioner blev udført med tyrosinase, substrat og testhæmmere. Alle testede forbindelser viste en koncentrationsafhængig inhibering. IC50-værdierne for (E)-benzyliden-1-indanonderivaterne er vist i tabel 1.

I både L-tyrosin- og L-DOPA-substrater udviste BID3 stærk inhiberende aktivitet med IC50-værdier på 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM og 1,39 ± 0.0 henholdsvis 0004 mM sammenlignet med den positive kontrol kojinsyre, som havde IC50-værdier på henholdsvis 13,77 ± 0,20 mM og 33,14 ± 0,93 mM (Fig. 1A). Ydermere viste BID6 potent aktivitet over for L-tyrosin og L-DOPA med IC50-værdier på henholdsvis 5,00 ± 0,91 mM og 53,11 ± 2,79 mM. BID1 viste signifikant hæmning mod tyrosinase via L-tyrosin- og L-DOPA-veje med IC50-værdier på henholdsvis 39,74 ± 3,71 mM og 130,0 ± 5,39 mM. BID4 og BID11 viste moderatetyrosinaseinhiberende aktivitet. Andre derivater var inaktive. Ligeledes udviste BID2 signifikant aktivitet over for L-tyrosin og L-DOPA med IC50-værdier på 41,27 ± 3,03 mM og 52,93 ± 2,62 mM. Desuden viste rapporterede blandede inhibitorer, phthalsyre og ikke-inhibitorisk syre effekt ved koncentrationen på 200 mm [47].

I overensstemmelse med resultaterne af struktur-aktivitetsforhold (SAR) undersøgelser, påvirkede derivater indeholdende (E)-benzyliden-1-indanonsubstituenter på phenylringen mærkbart den potentielle tyrosinasehæmning. BID3, som hæmmede tyrosinase med den højeste styrke, bærer en 2-hydroxygruppe i nærværelse af en 4-hydroxygruppe og kraftigt hæmmet tyrosinaseaktivitet (BID1 vsBID3). Disse resultater antydede, at 2,4--dihydroxygruppen (resorcinol-del) i phenylringstrukturen kan være ansvarlig for den øgede hæmning af tyrosinase. Interessant nok viste vi i en tidligere undersøgelse af potentielle syntetiske tyrosinasehæmmere, at 2,4-dihydroxysubstitutionen kraftigt hæmmede tyrosinaseaktivitet [48,49]. Derudover indikerede vores SAR-data også, at introduktionen af ​​en 3-hydroxygruppe i nærværelse af en 4-hydroxygruppe påvirker tyrosinasehæmningen. Disse fænomener blev demonstreret ved opdagelsen af, at en 4-methoxy-3-hydroxyphenylring øgede den inhiberende aktivitet mod tyrosinase, hvorimod introduktionen af ​​en 3,4-dihydroxygruppe (catechol-del) nedsatte den tyrosinaseinhiberende aktivitet ( BID2 vs. BID6) [35]. Disse resultater tyder på, at 3-hydroxy-4-methoxygruppen også er ansvarlig for fortyrosinaseinhiberende aktivitet. Ikke desto mindre viste BID9 og BID11, som indeholder 2,4-dimethoxyphenyl- eller 3,5-dimethoxyphenylgrupper, moderat tyrosinaseinhiberende aktivitet i vores nuværende undersøgelse. Baseret på IC50-værdier via L-tyrosin- og L-DOPA-vejen viste BID3 den mest potente tyrosinaseinhiberende aktivitet, derfor undersøgte vi yderligere mekanismen bag denne hæmmende effekt. Radhakrishnan et al. (2015) [20] rapporterede, at hydroxylsubstituerede (Z)-benzyliden-1-indanonforbindelsespotente tyrosinaseinhibitorer. Selvom tidligere undersøgelser har vist, at hydroxyl-substitueret (Z)-benzyliden-1-indanonderivater besidder anti-tyrosinase-aktivitet, har der efter vores bedste overbevisning ikke været rapporter om tyrosinaseinhibering af (E)-benzyliden-1- indanonderivater ved hjælp af cellebaserede eksperimenter.

Tabel 1. Svampe-tyrosinaseinhiberingspotentiale af den substituerede 2,3-dihydro-1H-inden-1-one (1-indanon) chalcon-lignende

derivater (BID1–13).

Fig. 1. Koncentrationsafhængig inhibering af svampetyrosinaseaktivitet med BID3 og kojinsyre (positiv kontrol) (n=3).

3.3. Enzymkinetisk analyse af tyrosinasehæmning

Da BID3 var den mest potente inhibitor, undersøgte vi yderligere mekanismen bag dens hæmmende virkning. I et forsøg på at forklare enzymhæmningsmåden blev kinetiske analyser udført ved forskellige koncentrationer af L-DOPA og forskellige BID3-koncentrationer. Dixon- og Lineweaver-Burk-plot blev tegnet under anvendelse af data opnået fra de kinetiske undersøgelser for at bekræfte inhiberingsmønsteret, og inhiberingskonstanterne (Ki) blev bestemt ved fortolkning af Dixon-plot (fig. 2A og B). Koncentrationen af ​​L-DOPA er angivet som følger: 1, 2, 4 mM. Skæringspunktet ligger på venstre side, hvilket indikerer inhibering af blandet type mod tyrosinase med en Ki-værdi på 2,4 mM (fig. 2B). Ki-værdien repræsenterer de koncentrationer, der kræves for at danne et enzym-inhibitorkompleks, så en inhibitor med en lavere Ki-værdi indikerer større tyrosinaseinhiberingsaktivitet.

Molekylær docking har bidraget med vigtig indsigt i lægemiddelopdagelse gennem mange år. Dog sigter docking-procedurer mod at identificere de korrekte positioner af ligander i bindingslommen af ​​et protein og at forudsige affiniteten mellem ligand og protein. Med andre ord beskriver docking en proces, hvorigennem to molekyler passer sammen i et tredimensionelt rum. For at bestemme, om BID3 binder til det aktive sted for tyrosinase, blev der udført molekylærdockningsanalyse for at identificere de mulige bindingspositioner for BID3 i krystalstrukturen af ​​svampetyrosinase (PDB ID: 2Y9X) (fig. 3A). Disse resultater blev beregnet ved hjælp af AutoDock4.2. program. Den mest stabile bindingsposition var den med den laveste score [50]. For nylig har Hassani et al. [47] rapporterede, at kanelsyre og phthalsyre var mixed-mode tyrosinaseinhibitorer. Hjælpemidler, kanelsyre og phthalsyre blev således brugt til at validere docking-resultater [51]. De molekylære docking-modeller af BID3 og kojinsyre (velkendt kompetitiv type inhibitor) i det katalytiske sted af tyrosinase er illustreret i Fig. 3B [52 ]. Tyrosinase-BID3-hæmmerkomplekset præsenterede 6,28 kcal/mol bindingsenergi inklusive tohydrogenbindinger med ASN260- og MET280-resten af ​​tyrosinase, og hydrofobe interaktioner blev observeret mellem BID3 og tyrosinase-resterne VAL248, PHE264 og VAL283-stedet yderligere stabiliserede interaktionen for kat. champignontyrosinase (tabel 2 og fig. 3E og H). Desuden er molekylære docking-modeller af BID3, phthalsyre (allosterisk inhibitor 1) og kanelsyre (allosterisk inhibitor 2) i de to allosteriske steder illustreret i fig. 3C og 3D. Phthalsyre og kanelsyre blev taget som referenceligander på henholdsvis allosteriske steder 1 og 2[47,51]. Som vist i fig. 3F og I udviste BID3 og phthalsyre en hydrogenbinding med TRY140-resten af ​​tyrosinase og tre hydrofobe interaktionsrester med LEU24, PHE147 og ILE148 af tyrosinase på allosterisk sted 1. De tilsvarende BIDmic og cinna-syreinteraktioner i det allosteriske sted2 af tyrosinase inkluderede hydrogenbindinger mellem ASP312 og LYS376 af tyrosinase, hvorimod THR308 interagerede hydrofobisk på allosterisk sted 2 (fig. 3G og J). Ydermere blev BID3-tyrosinasebinding fundet at udøve bindingsenergi i begge allosteriske steder af tyrosinase (henholdsvis 4,38 og 5,68 kcal/mol), hvilket indikerer høj bindingsaffinitet med begge allosteriske steder. Baseret på enzymekinetiske undersøgelser udøvede BID3 en hæmning af blandet type, bindingsevnen af ​​BID3 med både det katalytiske sted og to allosteriske steder bekræftede dets hæmning af blandet type af tyrosinase.

Fig. 2. Lineweaver-Burk (A) og Dixon plots (B) til inhibering af svampetyrosinase med BID3 ved anvendelse af L-DOPA som substrat.

3.4. Biologisk aktivitet

For at udnytte anti-tyrosinase-virkningerne af BID3 i cellekulturmodellen undersøgte vi dens cytotoksiske virkninger på B16F10-celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BID3 (1-20 mM) i 48 timer og vurderet ved hjælp af EZ-Cytox-assayet. Resultaterne indikerede, at BID3 ikke havde nogen signifikant cytotoksisk effekt i B16F10 melanomceller op til 20 mM (fig. 4A og B). Derfor blev efterfølgende eksperimenter udført med BID3 op til 20 mM.

Tabel 2 Bindingssteder og docking-score for BID3 i svampetyrosinase (PDB ID: 2Y9X) som bestemt ved hjælp af AutoDock4.2-programmet.

Melanogenese reguleres af en tyrosinase-enzymatisk kaskade. Af denne grund er der udviklet adskillige hudblegende forbindelser til at nedsætte tyrosinaseaktiviteten. Kojic acid, en tyrosinaseinhibitor, blev brugt som en positiv kontrol [53]. For at undersøge virkningerne af BID3 på cAMP-forhøjelse induceret hyperpigmentering blev B16F10-celler således behandlet med a-MSH og IBMX i nærværelse af BID3 (1, 5 og 2{{20}} mM) i 48 timer, og melaninindhold og cellulære tyrosinaseaktiviteter blev bestemt (fig. 4C og D). Behandling med a-MSH og IBMX inducerede en signifikant stigning (P < 0,001#)="" i="" melaninindholdet="" (fig.="" 4c)="" og="" cellulær="" tyrosinaseaktivitet="" (fig.="" 4d)="" i="" b16f10-celler="" sammenlignet="" med="" den="" ubehandlede="" kontrol.="" bid3-behandlingen="" var="" dog="" signifikant="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" og="" koncentrationsafhængigt="" nedsat="" melaninindhold="" og="" cellulær="" tyrosinaseaktivitet="" af="" b16f10-celler="" sammenlignet="" med="" a-msh-="" eller="" ibmx-behandlede="" celler,="" hvilket="" indikerer,="" at="" faldet="" i="" cellulær="" melanin="" kan="" skyldes="" hæmningen="" af="" ​​tyrosinaseaktivitet="" .="" disse="" resultater="" viser="" således="" klart,="" at="" bid3="" udøvede="" anti-melanogene="" virkninger,="" der="" hæmmer="" tyrosinaseaktivitet="" og="" melaninsyntese="" i="" b16f10-celler="" uden="" at="" inducere="">

Indanon er en af ​​de privilegerede strukturer inden for medicinsk kemi og er generelt forbundet med en række farmakologisk aktive forbindelser [54]. Indanondelen er til stede i en række fysiologisk aktive naturlige produkter. I lyset af dette rapporterede Okpekonet al., [55] en ny 1-indanonforbindelse, der er isoleret fra Uvaria-rødder. Denne forbindelse er det første 1-indanonderivat, der er isoleret fra planter. Nagle et al., [56] rapporterede, at et nyt methyleret indan-aldehyd blev isoleret fra marinecyanobacterium som en tumorangiogeneseregulator. Ligeledes siden den biologiske betydning af indanonkerne har forskere i de seneste år været fokuseret på at udvikle farmakologisk aktive indanonanaloger som terapeutiske midler. Den strukturelle mangfoldighed af 1-indanoner indebærer en række biologiske reaktioner, og disse forbindelser kan anvendes i landbrug og medicin. Forskellige indanonbaserede forbindelser er blevet udviklet som anti-Alzheimers sygdom [16,57-59], anticancer [60– 62], antimikrobielle [63,64] og antivirale midler [65,66]. På grund af det brede anvendelsespotentiale var 1-indanoner interessante objekter for yderligere forskning, og det er ønskeligt at designe nye klasser til deres syntese.

cistanche tubolosa: anti-aging

4. Konklusion

For at identificere nye potente tyrosinasehæmmere har vi designet og syntetiseret tretten (E)-benzyliden-1-indanonderivater. Blandt disse forbindelser er (E)-2-(2,4-dihydroxybenzyliden){ {6}},3-dihydro-1H-in-1-on (BID3) hæmmede kraftigt tyrosinaseaktivitet (IC50=0.034 og 1,39 mM, for L-tyrosin og henholdsvis L-DOPA), som var bedre end referenceforbindelsen, kojinsyre (henholdsvis IC50=13,77 mM og 33,14 mM). Struktur-aktivitetsforholdet afslørede, at tilstedeværelsen af ​​dihydroxylgruppen i 2- og 4-positionen af ​​(E)-benzyliden-1-indanonskelettet forbedrede aktiviteten mod tyrosinase. Enzymatinhiberingsmåden, bestemt ved Lineweaver-Burk- og Dixon-plot, indikerede, at BID3 er en inhibitor af blandet type. Molekylær docking-undersøgelser viser, at binding på det aktive sted og på allosteriske steder er vigtige mekanismer for tyrosinaseinhiberende aktivitet. Baseret på disse resultater syntes BID3 at være en potent tyrosinasehæmmer til behandling af hudlidelser såsom hyperpigmentering.

ørken cistanche fordele: hæmmer melanin dannelse