Identifikation og funktionel analyse af en bifavon som en ny hæmmer af transient receptorpotentiale vanilloide 4-afhængige aterogene processer

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comat vide mere

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman

Aterosklerose, en fremadskridende inflammatorisk sygdom i store arterier, er den største bidragyder til den voksende byrde af hjertekarsygdomsrelateret dødelighed og sygelighed globalt1. Den afgørende initierende begivenhed, der fører til åreforkalkning, involverer tilbageholdelse af modificerede low-density lipoprotein (oxLDL) partikler i de subendoteliale aorta intimalrum, primært i arterielle forgreningspunkter2. Under tidlig aterogenese, efter endothelial dysfunktion, transmigrerer cirkulerende blodmonocytter til intima-områderne og differentierer til vævsmakrofager3. I aorta-intimalrum skaber binding og optagelse af oxLDL af makrofager hjulpet af scavenger-receptorer som SRA og CD36 en feedforward athero-inflammatorisk loop, der resulterer i udviklingen af ​​lipid-ladede skumceller, en kritisk proces i aterosklerose2-8. Kaskaderne af de inflammatoriske hændelser fremkaldt af skumceller fører til dannelsen af ​​en tidlig fedtstribe og til sidst fremkomsten af ​​fremskredne åreforkalkningslæsioner karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​fibrøs hætte, forkalket væv, immunceller, matrixproteiner og lipider2-10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) fra TRPV-underfamilien, en ikke-selektiv, polymodal kationkanal, der er permeabel for Ca2 plus, udtrykkes allestedsnærværende i forskellige celletyper, herunder makrofager11-24. Tidligere kendt som en osmosensor, TRPV4 er nu kendt for at reagere på mangfoldige biokemiske og biomekaniske stimuli, herunder varme, matrixstivhed, osmolaritet, vækstfaktorer, pH og 4 phorbolestere11-24. TRPV4 er rapporteret at mediere adskillige fysiologiske funktioner såsom smertefornemmelse ved inflammation og neuropatier18,22,23, myofibroblastdifferentiering og migration 17,25,26 og osteoklastdifferentiering i knoglen27. TRPV4-mutationer er blevet forbundet med flere kanalopatier28-31. Nylige undersøgelser fra vores gruppe og andre har impliceret en mulig rolle af denne kanal i utallige patologiske tilstande som lungeskader22,32, skumcelledannelse14,16, vævsfbrose17,33, fremmedlegemerespons13 og cancer34,35. Tidligere blev en aterobeskyttende rolle af TRPV4 vist, hvor kemisk agonist-induceret TRPV4-funktion i endotelceller blev vist at være forbundet med aktivering af eNOS og hæmning af monocytadhæsion til endotelceller36. I modsætning hertil er mangler i TRPV4-funktioner blevet forbundet med adskillige atheroinflammatoriske reaktioner, herunder endothelial dysfunktion, reduceret makrofagskumcelledannelse og vaskulære sygdomme14,16,37-39. Vores laboratorium har for nylig identificeret en proatherogen rolle af TRPV4, hvorved den regulerer oxLDL-induceret makrofagskumcelledannelse. Mekanistisk viste vi, at TRPV4 påvirker optagelsen, men ikke bindingen af ​​oxLDL i makrofager på en CD-36-uafhængig måde14. I en anden undersøgelse rapporterede vi en TRPV4-afhængig forværring af oxLDL-induceret skumcelledannelse i nærværelse af lipopolysaccharid og øget matrixstivhed, hvilket giver en sammenhæng mellem mekanosensing og risiko for åreforkalkning16. Betragtet alt sammen tyder disse resultater på TRPV4 som et attraktivt mål i åreforkalkning og andre sygdomme, hvilket inciterer til opdagelsen af ​​små molekyle-hæmmere af TRPV4, der kan oversættes til klinisk effektive terapier. Anvendelsen af ​​naturlige forbindelser i terapeutika har vundet fremtræden, primært drevet af behovet for omkostningseffektive og biokompatible forbindelser sammenlignet med de aktuelt eksisterende syntetiske lægemidler. Naturlige forbindelser som f.eksflavonoider, alkaloider,polyfenoler, og curcuminoider, påvirker hjerte-kar-sygdomme via forskellige mekanismer såsom hæmning afproinflammatorisksignaler, insulinsensibilisering og forbedring af blodlipidprofiler ved at målrette AMPK-, COX1/2-, eNOS- og Nrf2-vejene40-45. Nylige undersøgelser af flere grupper har identificeret to flavonoider, berberin og apigenin, som potentielle modulatorer af TRPV4-aktivitet46,47. Vi har udviklet og brugt en semi high-throughput screeningsmetode til at identificere potentielle antagonister af TRPV4 fra et bibliotek af naturlige forbindelser ved hjælp af en Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR)-baseret Ca2 plus influx assay. Heri rapporterer vi identifikation og funktionel analyse af Linkedin, en flavon, som en ny hæmmer af TRPV4-afhængige aterogene processer i makrofager, og lægger således et grundlag for yderligere undersøgelser af denne naturlige forbindelse som en naturlig anti-aterosklerotisk lille molekyleforbindelse. Linkedin er blevet rapporteret at vise neurobeskyttende,anti-kræftfremkaldende, oganti-inflammatoriskroller 48,49. Vi rapporterer virkningsmekanismen af ​​Linkedin mod TRPV4 i indstillingen af ​​makrofagskumcelledannelse ved hjælp af adskillige biokemiske og cellulære assays.

Klik venligst her for at vide mere

Materialer og metoder Dyre- og cellekultur

Vi købte medfødte C57BL/6 vildtype (WT) mus fra Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). University of Maryland Animal Care and Use Committees retningslinjer blev fulgt for alle dyreforsøg, og forfatterne overholdt ARRIVE-retningslinjerne. Til isolering af thioglycolatinducerede murine residente makrofager (MRM) blev peritoneal lavage opsamlet efter 4 dages intraperitoneal thioglycolatinjektion, og cellerne blev holdt i 10 procent føtalt bovint serum (FBS) indeholdende DMEM7,14,16. En murin makrofagcellelinje (RAW264.7) og humane dermale fibroblaster (HDF) blev købt fra ATCC (Manassas, VA) og blev dyrket med henholdsvis DMEM eller MEM (Gibco, Waltham, MA). Murine knoglemarvs-afledte makrofager (BMDM'er) blev høstet fra 6- til 7-uge gamle mus, som tidligere beskrevet14,50,51. Kort fortalt blev lårben fra WT- og TRPV4 KO-mus opsamlet, og knoglemarv fra lårben blev skyllet ud med komplet DMEM-medie med 10 procent FBS. De suspenderede knoglemarvsceller blev filtreret gennem en 70 µm si (BD bioscience), centrifugeret og holdt i DMEM-medium suppleret med M-CSF (25 ng/ml) i 7-8 dage ved 37 grader for at tillade differentiering til makrofager.

Reagenser

Linkedin og GSK1016790A (GSK101) blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og FLIPR Calcium 6 assaykittet blev opnået fra Molecular Device (Sunnyvale, CA). Humant nativt LDL (VLDL) blev købt fra Stemcell Technologies (Vancouver, Canada). Vi inkuberede LDL med 5 µM CuSO4 i 12 timer ved 37 grader for at fremstille kobberoxideret LDL (oxLDL) 7,14,16. Fluorescerende farvestof-mærket, DiI-oxLDL, blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA) og MCSF fra R&D (Minneapolis, MN). Antistoffer til FACS-analyse var: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 og TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugerede sekundære antistoffer var fra R&D (Minneapolis, MN), og PE-konjugerede isotypekontroller var fra BD (Franklin Lake, NJ). Til kvantitativ polymerasekædereaktion (qRT-PCR) brugte vi RNeasy-sættet fra QIAGEN (Redwood City, CA). Alle primere blev købt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Cellekulturmedier, cellekulturrelaterede produkter og western blot-reagenser blev opnået fra Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche til anti-træthed

Semi high-throughput screening

Vi foretog en semi-high-throughput-screening for antagonister af Trpv4 fra et bibliotek af 2000 naturlige forbindelser (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) ved hjælp af en fluorometrisk billedbehandlingspladelæser (FLIPR)-baseret calciuminflux-assay14,17. Vi identificerede ginkgetin (GGT) som en ny antagonist til TRPV4. Den primære og sekundære screening blev udført med RAW264.7, HDF og BMDM'er for at vurdere Linkedins og andre kandidaters evne til at hæmme TRPV{10}}fremkaldt Ca2 plus infux14,17. Som kontroller brugte vi A23187, en calciumionophor, TRPV4 null BMDM'er og GSK219, en selektiv TRPV4-antagonist17. Efter den sekundære screening identificerede vi seks forbindelser, der viste mere end tredobbelt hæmning af TRPV4-medieret Ca2 plus tilstrømning sammenlignet med vehikelkontrol. Linkedin blev identificeret som den mest potente hæmmer af TRPV4-aktivitet. BMDM'er (5 x 104 celler/brønd) blev udsået i kollagenovertrukne (10 µg/ml) 96- sorte plader med brønd med klar bund og inkuberet ved 37 grader, 5 procent CO2. På dagen for eksperimentet blev celler fyldt med calcium 6 farvestof i HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecid og inkuberet i 45 minutter ved 37 grader. Efter inkubation blev biblioteksforbindelser tilsat til hver brønd til en slutkoncentration på 2 µM. Pladerne blev inkuberet i yderligere 45 minutter ved 37 grader. Ca2 plus-tilstrømning blev induceret ved tilsætning af 10 nM TRPV4-agonist GSK1016790A i vehikel- eller forbindelsesforbehandlede celler og registreret ved at måle ΔF/F (Max-Min), som tidligere beskrevet17. Data er vist som relative fluorescensenheder (RFU).

Immunoblots

Thioglycolat-fremkaldte peritoneale makrofager blev podet i 10% FBS indeholdende DMEM og inkuberet natten over. Ikke-adhærerede celler blev vasket af, og 1 procent bovint serumalbumin (BSA) indeholdende DMEM blev tilsat til pladen og inkuberet i 3 timer før Linkedin-behandling. For at bestemme ekspressionen af ​​CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 og GAPDH proteiner blev helcellelysater fremstillet fra celler behandlet natten over med Linkedin (1 og 5 µM) eller vehikel i nærvær eller fravær af oxLDL (25 µg/ml) ). For at bestemme ekspressionsniveauerne af LPS-udløst p-JNK og JNK blev celler forbehandlet med Linkedin (5 og 10 µM) i 3 timer og derefter stimuleret med E. coli LPS i 30 minutter. Helcellelysater blev fremstillet ud fra to gange vaskede celler (iskold PBS) under anvendelse af RIPA-buffer med tilsat proteaseinhibitorcocktail (Thermo Scientific, MA). Blots blev probet med kanin anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel), anti-mus CD36 (R&D, Minneapolis, MN), kanin anti-TLR4, kanin anti-TLR6, kanin anti-JNK og kanin anti-p- JNK primære antistoffer (Cell Signaling, Danvers, MA) efterfulgt af anti-kanin og anti-mus HRP-konjugerede sekundære antistoffer (R&D, Minneapolis, MN). Blots blev strippet og re-probet med anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) til ladningskontrol.

Dannelse af skumceller.Thioglycolat-udløst MRM blev podet på glasdækglas i en 12-brønds plade med DMEM, 10 procent FBS og inkuberet ved 37 grader, 5 procent CO2 i 2 timer. GGT (1 eller 10 µM) blev tilsat til cellerne, og efter 3 timers inkubation blev oxLDL (50 µg/ml) tilsat, og kulturer blev inkuberet natten over ved 37 grader. Nativt LDL (50 ug/ml) blev tilsat til kontrolgruppebrønde og inkuberet natten over. Celler blev fikseret i 4 procent paraformaldehyd efterfulgt af Oil Red O-farvning for at kvantificere skumcelledannelse.

Adenovirus vektor transduktion.Vi indsamlede adenovirus-konstruktioner til at udtrykke Ad(RGD)-muse TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) og adenovirus blank vektor, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), fra Vector Biolabs, Malvern, PA. Vi brugte 1 × 108 pfu/ml til alle eksperimenter. Til skumcellegenereringsundersøgelser blev muse-peritoneale makrofager inkuberet med Ade-TRPV4 eller Ade-Vec i DMEM-medier i 72 timer før tilsætning af oxLDL for at generere makrofagskumceller.

Binding og optagelse af ox-LDL.For at vurdere binding blev peritoneale makrofager behandlet med to doser (1 eller 10 µM) Linkedin eller vehikel i 3 timer og inkuberet med DiI-oxLDL ved 4 grader i en time. Efter forbehandling med Linkedin eller vehikel blev celler inkuberet med DiI-oxLDL ved 37 grader i 30 minutter for at vurdere optagelsen. Billeder blev optaget ved fluorescensmikroskopi (63x), og billede J blev brugt til at kvantificere resultater.

Flowcytometrianalyse.Thioglycolat-fremkaldte peritoneale makrofager blev dyrket i DMEM, 10 procent FBS i 24 timer. Ikke-adhærerede celler blev vasket af, serumfrit medium blev tilsat, og celler blev inkuberet i 2 timer efterfulgt af tilsætning af 5 µM GGT eller vehikel, og inkubation blev fortsat i 3 timer. Behandlede celler blev skrabet af pladen og resuspenderet i PBS, 2% BSA. Celler blev inkuberet med primære antistoffer i 45 minutter efterfulgt af 30 minutters inkubation med PE-konjugeret sekundært antistof. Et FACSCantoII flowcytometer (BD Bioscience, Ontario, Canada) blev brugt til at indsamle data. Alle data blev behandlet ved hjælp af FlowJo-software.

qRT-PCR.Thioglycolat-inducerede makrofager blev behandlet med 5 µM Linkedin eller vehikel i 3 timer; 25 µg/ml oxLDL blev tilsat til bæreren eller de Linkedin-behandlede celler, og inkubationen blev fortsat natten over. RNeasy Micro Kit (#74.004) fra QIAGEN blev brugt til at ekstrahere totalt RNA, og et Universal SYBR Green One-Step Kit fra Bio-Rad blev brugt til at omvendt transskribere RNA'et. En C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) blev brugt til at indsamle data. Ekspression af et gen blev bestemt som mængden af ​​genspecifikt mRNA i forhold til GAPDH mRNA ved anvendelse af den sammenlignende CT-metode beskrevet i Bio-Rad qRT-PCR-systemets brugerbulletin.

Statistisk analyse.Data præsenteres som middel ± SEM af biologiske triplikater. GraphPad Prism 7.0 software blev brugt, og beregninger blev udført ved hjælp af Students t-test for to grupper eller envejs ANOVA for flere grupper.

Etisk godkendelse.Alle eksperimenter på mus blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og blev godkendt af University of Maryland-College Park Review Committee.

Resultater in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>tredobbelt; s<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Figur 1. Semi high-throughput screening-baseret identifikation af Linkedin som en ny TRPV4-hæmmer fra et bibliotek af naturlige forbindelser. (A) Flowdiagram, der viser arbejdsgangen, der resulterer i identifikation af ginkgetin som en potentiel TRPV4-hæmmer fra et bibliotek med 2000 naturlige forbindelser. (B) Repræsentativ FlexStation 3-optagelse, der viser den hæmmende virkning af 6 naturlige forbindelser på TRPV4-agonist (GSK1016790A)-induceret Ca2 plus tilstrømning i calcium 6 farvestof-fyldte BMDM'er under sekundær screening. Forbehandling med alle 6 forbindelser viste hæmmende virkninger på TRPV4-afhængig Ca2 plus tilstrømning sammenlignet med celler forbehandlet med vehikel (negativ kontrol; vehikel plus GSK1016790A (10 nM)) eller calciumionofor (A23187, 2 μM). Vi brugte selektiv TRPV4-antagonist, GSK2193874 (10 nM), som en negativ kontrol. Alle eksperimenter blev gentaget tre gange i firdobbelt. RFU: relativ fluorescensenhed.

TRPV4-hæmning af GGT ophæver oxLDL-induceret makrofagskumcelledannelse.Vores tidligere undersøgelser viste, at TRPV4-fremkaldt Ca2 plus influx er involveret i oxLDL-medieret skumcelledannelse 14,16. Derfor evaluerede vi muligheden for, at skumcelledannelse blev hæmmet af GGT-medieret antagonisering af TRPV4-aktivitet. Vildtype murine peritoneale makrofager blev inkuberet med oxLDL for at inducere skumcelledannelse i nærvær eller fravær af GGT og analyseret ved Oil Red O-farvning. Som forventet fandt vi, at dannelsen af ​​skumceller steg fem gange i oxLDL-behandlede makrofager sammenlignet med nativt LDL (fig. 2A, B). Imidlertid reducerede behandling af makrofagerne med GGT (1 eller 10 µM) før stimulering med oxLDL signifikant procentdelen af ​​skumceller (fig. 2A, B). Samlet tyder disse resultater på en hæmmende effekt af GGT på dannelse af makrofagskumceller, muligvis målrettet mod TRPV{12}}fremkaldt Ca2 plus tilstrømning. Desuden overudtrykte vi TRPV4 i TRPV4 null-makrofager ved at bruge adenoviruskonstruktion og inducerede derefter skumcelledannelse ved at bruge oxLDL i nærvær af GGT. Vi fandt, at overekspression af TRPV4 øgede skumcelledannelsen, som blev blokeret, da vi forbehandlede cellen med GGT, hvilket tyder på, at inhibering af den proatherogene skumcelledannelse af GGT er TRPV4-afhængig (fig. 2C, D).

GGT blokerer ikke det basale niveau af ekspression af TRPV4 og inflammatoriske receptorer.Scavenger-receptor CD36 spiller en stor rolle i optagelsen og bindingen af ​​oxLDL og skumcelledannelse, kritiske processer i åreforkalkning4-7,54,55. For nylig tyder en voksende mængde af beviser på involvering af toll-lignende receptorer i åreforkalkning2,4,56. For at undersøge, om GGT blokerede skumcelledannelse ved at påvirke ekspressionen af ​​CD36, TLR4, TLR6 og TRPV4, udførte vi immunoblotanalyse ved to koncentrationer af GGT (1 eller 5 µM). Vi fandt lignende ekspressionsniveauer af CD36, TRPV4, TLR6 og TLR4 sammenlignet med den ubehandlede kontrol (fig. 3A-D). Flowcytometrisk analyse afslørede heller ingen signifikant forskel i celleoverfladeekspressionen af ​​proteinerne med eller uden GGT-behandling (fig. 3E-H, I-L). I betragtning af alt sammen tyder disse resultater på, at GGT blokerer makrofagskumcelledannelse uden at hæmme de basale niveauer af overfladeekspression af TRPV4, CD36, TLR4 og TLR6.

Figur 2. Inhibering af TRPV4 af Linkedin ophæver oxLDL-induceret makrofagskumcelledannelse. (A) Thioglycolat-inducerede murine peritoneale makrofager blev behandlet natten over med 50 µg/ml oxLDL, efterfulgt af en 3 timers præinkubation med vehikel eller 1 eller 10 µM Linkedin. Celler blev behandlet med 50 µg/ml nativt LDL (VLDL) som kontrol. Original forstørrelse: 40x. (B) Kvantificering af resultaterne er vist i (A). n=500 celler/tilstand. Elevens t-test; ***s<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Optagelse af oxLDL, men ikke binding af makrofager undertrykkes af GGT. Fordi TRPV4 tidligere har vist sig at have en rolle i optagelsen af ​​oxLDL og skumcelledannelse14,16, evaluerede vi, om behandling med GGT forårsagede svækkelse af bindingen af ​​oxLDL på makrofagoverfladen. WT peritoneale makrofager blev behandlet med GGT før inkubation med DiI-oxLDL ved 4 grader, og binding blev vurderet. Resultaterne indikerer, at bindingen af ​​oxLDL på makrofagoverfladen ikke var signifikant hæmmet af GGT (1 eller 10 µM) behandling sammenlignet med vehikelkontrol (fig. 5A-C). Efter at have fastslået, at GGT ikke hæmmer bindingen af ​​oxLDL, sigtede vi derefter på at bestemme, om optagelsen af ​​oxLDL i makrofager var svækket af GGT-behandling. Interessant nok indikerede vores resultater, at der var signifikant inhibering i optagelsen af ​​oxLDL i makrofager i GGT-forbehandlede celler sammenlignet med den bærerbehandlede gruppe (fig. 6A, B). I betragtning af alt sammen tyder disse resultater på, at GGT blokerer optagelsen af ​​oxLDL, men ikke bindende, i makrofager.

GGT blokerer oxLDL-induceret ekspression af TRPV4 i makrofager.

Da vores tidligere publicerede undersøgelser viste, at TRPV4-fremkaldt Ca2 plus spiller en rolle i oxLDL-medieret makrofagskumcelledannelse14,16, forsøgte vi at bestemme, om GGT blokerede skumcelledannelse via undertrykkelse af oxLDL-induceret ekspression af CD36, TLR2, TLR4, TLR6 eller TRPV4. Vi fandt, at stimulering af makrofager natten over med oxLDL resulterede i betydelig opregulering af ekspressionen af ​​TRPV4-proteiner sammenlignet med LDL, mens ekspression af andre receptorer (CD36, TLR2, TLR4 og TLR6) forblev uændret (fig. 4A-F). Forbehandling af celler med GGT før stimulering med oxLDL reducerede selektivt niveauet af ekspression af TRPV4-proteiner sammenlignet med vehikelbehandling (fig. 4A-F). Samlet tyder disse fund på en hæmmende effekt af GGT på TRPV4-proteinekspression, som delvist kan være involveret i undertrykkelsen af ​​skumcelledannelse af GGT.

Figur 3. Linkedin-behandling ændrer ikke det totale protein eller overfladeekspression af TRPV4, CD36 og TLR'er i makrofager. (A–D) Immunoblots af makrofaghelcellelysater efter behandling natten over med 1 eller 5 µM Linkedin eller vehikel. Repræsentative immunoblots viser total proteinekspression af CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) og TLR4 (D) i Linkedin-behandlede og ubehandlede celler. Tre uafhængige biologiske replikater og 3 eksperimentelle gentagelser for hvert sæt eksperimenter blev udført. (E-H) Flowcytometrisk analyse af makrofager behandlet natten over med 5 µM Linkedin eller ubehandlet, der viser overfladeekspression af TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) og TLR6 (G) i ubehandlede og Linkedin-behandlede celler. Tre uafhængige biologiske replikater og 30,000 celler pr. tilstand blev analyseret. (I–L) Kvantitativ analyse af resultater fra (E–H). Analyseret ved Two-tailed t-test med 99 procent konfidensinterval. Celler talt pr. eksperiment, 30,000; to eksperimentelle gentagelser.

GGT blokerer proatherogen JNK2-aktivering og inflammation i makrofager. Publicerede rapporter fra vores laboratorium og andre har vist, at aktivering af JNK2 spiller en afgørende rolle i dannelsen af ​​skumceller og åreforkalkning7,57. For at bestemme, om GGT kunne inhibere aktiveringen af ​​JNK1/2, blev makrofager behandlet med GGT efterfulgt af stimulering med LPS eller oxLDL. Resultater fra immunoblotanalyse viste, at behandling med GGT signifikant undertrykte oxLDL- eller LPS-induceret phosphorylering af JNK1/2 sammenlignet med den ubehandlede eller native LDL-behandlede kontrol (fig. 7A-D). Det er blevet vist, at JNK-aktivering i makrofager inducerer transkription af proinflammatoriske mediatorer forbundet med aterosklerose58-60. For at bestemme, om GGT potentielt kunne blokere ekspressionen af ​​disse proinflammatoriske regulatorer i makrofager, blev GGT-forbehandlede celler stimuleret med oxLDL, og mRNA-ekspressionsniveauer af TNF, IL 6, IL12, IL1 og MCP1 blev kvantificeret ved qRT-PCR-analyse. Vi påviste signifikant nedregulering i oxLDL-inducerede ekspressionsniveauer af TNF, IL12, IL1 og MCP1 mRNA i GGT-behandlede celler sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller (fig. 7E-I). Tilsammen tyder disse resultater på, at GGT blokerer proatherogen JNK2-aktivering og inflammatorisk genekspression som reaktion på oxLDL-stimulering i makrofager. Diskussion Naturlige forbindelser såsom flavonoider og polyphenoler er kendt for at modulere kardiovaskulære reaktioner via forskellige mekanismer, såsom hæmning af proinflammatoriske signaler, insulinsensibilisering, oxidativ status og forbedring af blodlipidprofiler40-45. Heri rapporterer vi den semi high-throughput screening-baserede identifikation og funktionelle karakterisering af Linkedin, en flavon, som en ny inhibitor af TRPV4-afhængige Protherogenic/inflammatoriske processer i makrofager. Vi viste specifikt, at i) ginkgetin blokerer TRPV4-medierede Ca2 plus tilstrømning til makrofager, ii) ginkgetin blokade af TRPV4 funktion markant reducerede oxLDL-induceret skumcelledannelse ved at undertrykke optagelsen af ​​oxLDL i makrofager, og iii) ginkgetin blokke LPS- og oxLDL-induceret phosphorylering af JNK1/2, ekspression af TRPV4-proteiner og inflammatorisk genekspression. Samlet set viste resultaterne af vores undersøgelse, at ginkgetin hæmmer proatherogen/inflammatorisk makrofagfunktion på en TRPV4-afhængig måde. Aterosklerose, en aortasygdom, er oprindeligt drevet af inflammation og overfyldning af makrofager med oxLDL, hvilket inducerer dannelsen af ​​makrofagskumceller, som efterfølgende udvikler sig til at danne atheroma2-10. Da skumcelledannelse er en kritisk proces i atherogenese, kan forståelse og manipulation af skumcelledannelse have terapeutisk potentiale. Makrofager er kendt for at udtrykke en række membrangennemtrængende ionkanaler og pumper, herunder TRPV4, en mekanosensitiv polymodal Ca2 plus permeabel ionkanal, som aktiveres af både fysiske og biokemiske stimuli11-24. Publicerede undersøgelser fra vores laboratorium og andre har identificeret rollen som TRPV4 i makrofaginflammation og oxLDL-induceret skumcelledannelse14-16,26. TRPV4 kan således tjene som et levedygtigt mål for dæmpning af proatherogene processer.

Figur 5. Linkedin undertrykker ikke DiI-oxLDL-binding til makrofager. Makrofager blev forbehandlet med vehikel eller Linkedin (1 eller 10 µM) i 3 timer efterfulgt af inkubation med DiI-mærket oxLDL (2,5 µg/ml) i 1 time ved 4 grader. (A) Repræsentative fluorescensmikroskopiske billeder (oprindelig forstørrelse, 63×) af DiI-oxLDL-binding på makrofagmembranoverfladen (n=20 celler/tilstand). (B) Resultater fra eksperiment A vist som plotprofil ved brug af NIH ImageJ-software. (C) Kvantitativ analyse af resultater fra A. n=20 celler/tilstand. i at forbedre åreforkalkning ved at reducere MMP-2 og MMP-9 og øge niveauerne af NO og NOS i thoraxaorta hos rotte52. I denne undersøgelse viste vi, at ginkgetin blokerer TRPV4-fremkaldte Ca2 plus tilstrømning i makrofager. Mekanistisk viste vi, at ginkgetin blokerer optagelsen af ​​oxLDL, men ikke bindende, i makrofager. Undersøgelser udført in vivo og in vitro antydede en kritisk rolle for CD36 som den vigtigste scavenger-receptor i optagelsen af ​​oxLDL og makrofagskumcelledannelse2-7. Det blev vist, at CD36 null-mus, der mangler ApoE eller LDLR, er mindre tilbøjelige til at udvikle aterosklerotiske læsioner5,6. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe identificerede en væsentlig rolle for CD36-JNK-signaleringskaskaden i makrofagskumcelledannelse7. Toll-lignende receptorer TLR2, TLR4 og TLR6 fungerer som coreceptorer ved at interagere med CD36 og har vist sig at være involveret i atherogenese2,56,63. Vi undersøgte muligheden for, at manglen på skumcelledannelse set i Linkedin-behandlede makrofager skyldtes nedsat ekspression af CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 eller TLR6 proteiner. Interessant nok reducerede Linkedin-behandling ikke signifikant ekspression af CD36-, TLR2-, TLR4- eller TLR6-proteiner ved basale niveauer eller under oxLDL-stimulerede forhold. Linkedin blokerede imidlertid specifikt den oxLDL-inducerede opregulering af ekspression af TRPV4-proteiner, mens dets ekspression på basale niveauer forblev uændret. I betragtning af alt sammen tyder disse resultater på, at ginkgetin blokerer oxLDL-induceret skumcelledannelse via en mekanisme uafhængig af CD36 og TLR-ekspression, men afhængig af TRPV4. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe og andre viste, at JNK2-aktivering er involveret i skumcelledannelse og udvikling af aterosklerotisk læsion7,57. Det blev også rapporteret, at JNK er involveret i moduleringen af ​​MMP-9 og MMP-13, som er overudtrykt i aterosklerotiske læsioner64-68. I betragtning af den anerkendte forbindelse af JNK i atherogene processer, ønskede vi at bestemme, om ginkgetin kunne hæmme aktiveringen af ​​JNK. I overensstemmelse med tidligere rapporter viste vores resultater også, at ginkgetin blokerer inflammatorisk stimulus-induceret phosphorylering af JNK2 i makrofager. Dette resultat antyder en mulig mekanisme, hvormed Linkedin blokerer skumcelledannelse. Desuden fandt vi en signifikant nedregulering i den oxLDL-inducerede ekspression af TNF, IL12, IL1 og MCP1 mRNA i ginkgetin-behandlede celler sammenlignet med vehikelkontrol, hvilket fremhæver potentielle anti-inflammatoriske roller af ginkgetin som svar på oxLDL. Sammenfattende viste vores resultater, at ginkgetin hæmmer proatherogen og inflammatorisk makrofagfunktion på en TRPV4-afhængig måde. Disse resultater styrker således begrundelsen for brugen af ​​naturlige forbindelser i udviklingen af ​​potentielle terapeutika og/eller kemopræventive reagenser.

Referencer
1. Barquera, S. et al. Globalt overblik over epidemiologien af ​​den aterosklerotiske kardiovaskulære sygdom. Arch. Med. Res. 46, 328-338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te cellulær biologi af makrofager i aterosklerose. Celle 145, 341-355 (2011).
3. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 407, 233-241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokiner, makrofag-lipidmetabolisme og skumceller: implikationer for kardiovaskulær sygdomsbehandling. Prog. Lipid Res. 50, 331-347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Målrettet afbrydelse af klasse B scavenger-receptoren CD36 beskytter mod udvikling af aterosklerotisk læsion hos mus. J. Clin. Investere. 105, 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Scavenger-receptorer klasse AI/II og CD36 er de vigtigste receptorer, der er ansvarlige for optagelsen af ​​modificeret lavdensitetslipoprotein, hvilket fører til lipidbelastning i makrofager. J. Biol. Chem. 277, 49982-49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. En CD36-afhængig signaleringskaskade er nødvendig for dannelse af makrofagskumceller. Celle Metab. 4, 211-221 (2006).
8. Ross, R. Aterosklerose - en inflammatorisk sygdom. N Engl J Med. 340(2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Te molekylære mekanismer af de trombotiske komplikationer af aterosklerose. J. Intern. Med. 517-527, 2008.
10. Lusis, AJ Atherosclerosis. Nature 407, 233-241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Ultrahurtig aktivering af TRPV4-ionkanaler ved hjælp af mekaniske kræfter påført celleoverflade beta1-integriner. Heltal. Biol. (Camb). 2(9), 435-442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ-mekanotransduktionssignaleringsakse i matrixstivheds- og TGF 1-induceret epitel-mesenkymal overgang. Cell Mol. Bioeng.12, 139-152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Transient receptorpotentiale vanilloid 4 er påkrævet for fremmedlegemerespons og kæmpecelledannelse. Er. J. Pathol. 189(8), 1505-1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. TRPV4 calciumpermeabel kanal er en ny regulator af oxideret LDL-induceret makrofagskumcelledannelse. Fri Radik. Biol. Med. 110, 142-150 (2017).