Hypoksiske mesenkymale stamcelle-afledte ekstracellulære vesikler forbedrer nyrebrose efter iskæmi-reperfusionsskade ved at genoprette CPT1A-medieret fedtsyreoxidation

Abstrakt

1. Baggrund

Nyrefibrose er en almindelig patologisk proces af kroniske nyresygdomme induceret af flere faktorer. Hypoksisk forbehandling af mesenkymale stamceller kan øge effektiviteten af ​​udskilte ekstracellulære vesikler (MSC-EV'er) ved forskellige sygdomme, men det er ikke klart, om de bedre kan forbedre nyrefibrose. Den seneste forskning viste, at genopretning af fedtsyreoxidation (FAO) kan reducere nyrefibrose. I denne undersøgelse havde vi til formål at undersøge, om hypoxisk forbehandling med MSC ekstracellulære vesikler (Hypo-EV'er) kan forbedre FAO for at genoprette nyrefibrose og undersøge den underliggende mekanisme.

2. Metoder

Hypo-EV'er blev isoleret fra hypoxi-forbehandlet human placenta-afledt MSC (hP-MSC), og Norm-EV'er blev isoleret fra hP-MSC dyrket under normale forhold. Vi brugte den iskæmi-reperfusion (I/R)-inducerede nyrefibrosemodel in vivo. Musene blev injiceret med PBS, Hypo-EV'er eller Norm-EV'er umiddelbart efter operationen og dag 1 efter operationen. Nyrefunktion, nyrepatologi og nyrefibrose blev vurderet til nyreskadeevaluering. Til mekanistisk udforskning blev fedtsyreoxidation (FAO), mitokondrielle morfologiske ændringer, ATP-produktion og mitokondrielle masseproteiner påvist in vivo. Mitokondrielt membranpotentiale og produktion af reaktive oxygenarter (ROS) blev undersøgt in vitro.

3. Resultater

Vi fandt, at Hypo-EV'er giver en overlegen terapeutisk effekt på genopretning af nyrestrukturskade, genoprettelse af nyrefunktion og reduktion af nyrefibrose. I mellemtiden forbedrede Hypo-EV'er mitokondriel FAO i nyrerne ved at genoprette ekspressionen af ​​et FAO nøglehastighedsbegrænsende enzym carnitin palmitoyl-transferase 1A (CPT1A). Mekanisk forklarer forbedringen af ​​mitokondriel homeostase, karakteriseret ved repareret mitokondriel struktur, genopretning af mitokondriel masse og ATP-produktion, hæmning af oxidativt stress og øget mitokondriel membranpotentiale, delvist effekten af ​​Hypo-EV'er på at forbedre mitokondriel FAO og dermed svække I/ R skade.

4 konklusioner

Hypo-EV'er undertrykker nyrefibrose ved at genoprette CPT1A-medieret mitokondriel FAO, hvilke effekter kan opnås gennem regulering af mitokondriel homeostase. Vores resultater giver yderligere mekanismestøtte til udviklingen af ​​cellefri terapi for nyrefibrose.

5. Nøgleord

Mesenchymal stamcelle, Hypoxisk, Ekstracellulære vesikler, Mitokondrie, Fedtsyreoxidation, Nyrefibrose.

Klik her for at købe Cistanche-tilskuddet

Introduktion

Kronisk nyresygdom (CKD) er en alvorlig sygdom, der truer menneskers sundhed og er også et vigtigt globalt offentligt spørgsmål. Den globale forekomst, prævalens og død af CKD er signifikant og stigende, og prævalensen er cirka 10 procent blandt voksne på verdensplan [1, 2]. Renal iskæmi-reperfusion (I/R) skade er forbundet med nyrefibrose og progressiv CKD [3, 4]. Nyrefibrose betragtes som en almindelig patologisk proces, der fører til CKD og nyresygdom i slutstadiet. Der er dog i øjeblikket ingen effektive terapier, der med succes forebygger eller reverserer fibrose [5].

Mesenkymale stamcelle-afledte ekstracellulære vesikler (MSC-EV'er) er blevet rapporteret at spille en regenerativ og antifibrotisk rolle i flere prækliniske modeller af CKD [6-9]. Imidlertid er det lave udbytte af MSC-EV'er en begrænsende faktor for storskalaproduktion af cellefri terapier [10]. Hypoxi-prækonditionering stimulerer de parakrine aktiviteter af MSC'er og øger funktionen og produktionen af ​​EV'er og betragtes som en ingeniørtilgang til at forbedre det terapeutiske potentiale af EV'er [11, 12]. En nylig undersøgelse indikerede, at hypoxi-prækonditionerede MSC'er er mere signifikante end ubehandlede MSC'er til at forhindre nyrefibrose og inflammation [13]. Imidlertid er rollen af ​​hypoxi-forudkonditionerede MSC-afledte EV'er i nyrefibrose endnu ikke blevet fastslået.

Den patologiske mekanisme af nyrefibrose er blevet gennemgået i mange nyere undersøgelser [14-16], især inden for metabolisk regulering [17]. Det er velkendt, at proksimale tubulære celler (PTC'er) er de mest energikrævende celler i nyren og spiller en central rolle i tubulointerstitiel fibroseprogression [18, 19]. Fedtsyreoxidation (FAO) er den primære energikilde til PTC'er [19, 20]. Resultaterne af genomomfattende transkriptomundersøgelser viste, at ekspressionen af ​​FAO-relaterede metaboliske nøgleenzymer og transkriptionsregulatorer var markant reduceret i humane og musemodeller med tubulointerstitiel fibrose [20]. Derudover kan genoprettelse af fedtsyremetabolismen beskytte mus mod tubulointerstitiel fibrose [17, 20]. En nylig undersøgelse bekræftede, at overekspression af det nøglehastighedsbegrænsende enzym carnitin palmitoyl-transferase 1A (CPT1A) kan forbedre FAO i renale tubulære epitelceller, reducere ekspressionen af ​​inflammatoriske mediatorer og føre til signifikant lindring af fibrose i tre eksperimentelle modeller [21 ]. Derfor kan FAO-målrettede terapier være en potentielt effektiv terapeutisk strategi til fibrosereduktion.

Mitokondrier spiller en uundværlig rolle i reguleringen af ​​FAO. En tidligere undersøgelse indikerede, at astragalosid IV kan forbedre FAO ved at regulere mitokondriel aktivitet under aldring [22]. Ødelæggelsen af ​​mitokondriel homeostase spiller en vigtig rolle i den tidlige skade af nyresygdom, unormal reparation efter skade og patogenesen af ​​CKD [23, 24]. Under fysiologiske og patologiske forhold koordinerer forskellige mekanismer for at opretholde mitokondriel homeostase, herunder antioxidantforsvar, mitokondriel DNA-reparation, mitokondriel fusion og fission, mitokondriel autofagi og mitokondriel biogenese [25]. Adskillige undersøgelser har vist, at MSC-EV'er kan dæmpe mitokondriel skade ved at stabilisere mitokondriel DNA [26], hæmme mitokondriel fission og stimulere mitokondriel antioxidantforsvar og adenosintrifosfat (ATP) produktion i akut nyreskade (AKI) modeller [27, 28] . Tidligere undersøgelser indikerede, at Hypo-EVs-behandling havde bedre effekter på at fremme angiogenese, proliferation og migration og hæmme inflammation og apoptose end Norm-EVs-behandling [29-31]. Ikke desto mindre har forskere ikke endeligt afgjort, om de terapeutiske resultater af Hypo-EV'er i fibrose afhænger af mitokondriel homeostase.

Formålet med denne undersøgelse var (1) at undersøge, om hypoxisk forbehandling af MSC'er-afledte ekstracellulære vesikler (Hypo-EV'er) har en bedre anti-fibrose effekt; (2) at bestemme, om Hypo-EV'er lindrer iskæmi-reperfusionsinduceret fibrose ved at forstærke CPT1A-medieret FAO; (3) for at undersøge, om den beskyttende effekt af Hypo-EV'er på FAO er relateret til reguleringen af ​​mitokondriel homeostase.

Cistanche pulver

Metoder

1. Cellekultur og hypoxi prækonditionering

Human placenta-afledt MSC (hP-MSC) blev leveret af Institute of Foundation, Chinese Academy of Medical Sciences og dyrket i Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Gibco) medium med 10 procent føtalt bovint serum (FBS, Corning) suppleret med 100 U/mL penicillin-streptomycin (Gibco) og holdt ved 37 grader i en befugtet 5 procent CO2 atmosfære. Efter at hP-MSC nåede 60 procent –70 procent konfluens, blev dyrkningsmedierne erstattet med exosom-depleteret FBS (SBI, 50A-1) og blev dyrket ved 37 grader, 5 procent CO2, 21 procent O2 eller ved 1 procent O2, 94 procent N2 og 5 procent CO2 i yderligere 48 timer. Mediet blev derefter opsamlet til EV'er-isolering, og EV'erne indsamlet fra den hypoxiske forbehandling af MSC (1 procent O2) blev kaldt Hypo-EV'er, og den normale MSC (21 procent O2) blev kaldt Norm-EV'er. Kun hP-MSC fra passager 6-10 blev brugt til yderligere eksperimenter.

2. Cellekultur og behandling

Humane renale proksimale tubulære epitelceller (HK-2, ATCC, USA) blev dyrket i DMEM/F12 med 10 procent FBS og suppleret med 100 U/mL penicillin-streptomycin. Cellerne blev holdt ved 37 grader i en befugtet atmosfære indeholdende 5 procent CO2. Vi brugte to tilgange til at efterligne CKD in vitro. Cellehypoxi/reoxygeneringsmodellen (H/R) blev udført som tidligere rapporteret [32]. Kort fortalt blev HK-2-celler udsat for en hypoxisk tilstand (37 grader, 1 procent O2, 94 procent N2 og 5 procent CO2) i 12 timer i glukose- og serumfrit medium for at inducere hypoxisk skade. Efterfølgende blev mediet udskiftet, og cellerne blev anbragt under normal tilstand (21 procent O2) til reoxygenering i 24 timer. Kontrolgruppen blev dyrket under normal tilstand (21 procent O2) i henhold til det eksperimentelle design. En anden metode var at inkubere HK-2-celler med transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF- 1) ved en slutkoncentration på 10 ng/ml i 48 timer som tidligere rapporteret [13]. Under reoxygenering eller TGF- 1--stimuleret tid blev Norm-EV'er eller Hypo-EV'er (100 ug/mL næringsmedium) tilsat til cellerne.

3. MSC-EVs isolation og identifikation

MSC-afledte EV'er blev isoleret ved hjælp af en differentiel ultracentrifugeringsmetode. Kort fortalt blev dyrkningsmediet centrifugeret ved 4 grader som følger: 500×g i 10 minutter, ved 2,000×g i 20 minutter og 10,000×g i 30 min. Mediet blev filtreret gennem et 0.22-μm filter før ultracentrifugering ved 100,000×g i 2 timer. Til sidst blev EV-pellets resuspenderet i PBS og ultracentrifugeret i yderligere 2 timer for at kassere de kontaminerende proteiner, og derefter blev de oprensede EV'er høstet i PBS og opbevaret ved -80 grader til videre brug. Proteinkoncentrationerne af Norm-EV'erne og Hypo-EV'erne blev undersøgt ved hjælp af en bicinchoninsyre-proteinassay (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Den typiske kugleformede dobbeltlagsmembranstruktur af EV'erne blev observeret ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM). Western blotting blev brugt til at undersøge kvaliteten af ​​EV'erne, og størrelsesfordelingen af ​​EV'erne blev undersøgt ved dynamisk lysspredning (DLS).

Cistanche tubulosa

4. Dyreforsøg

C57BL/6 SPF-hanmus (7-9 uger gamle) blev leveret af Sibeifu Experimental Animal Science and Technology (Beijing, Kina) og blev fodret adaptivt i 4 dage i dyrecentret på det kinesiske PLA General Hospital før eksperimentet. Musene blev tilfældigt opdelt i fire grupper: kontrolgruppen, fosfatpufret saltvand (PBS), Norm-EVs og Hypo-EVs. Mus af PBS-, Norm-EV'er og Hypo-EV'er-grupper blev udsat for renal iskæmi-reperfusion som beskrevet tidligere [33, 34]. Kort fortalt blev mus bedøvet med pentobarbital (50 mg/kg) gennem intraperitoneal injektion. Ryghåret over musenyren blev renset, og derefter blev de bilaterale nyrepedikelkar blotlagt. For at inducere nyreiskæmi blev den venstre nyrearterie fastspændt med en ikke-traumatisk vaskulær klemme i 30 minutter, og den højre nyre blev fjernet samtidigt. Bagefter blev reperfusion påbegyndt ved at løsne klemmen. Nyrerne blev observeret i 5 minutter for at sikre reperfusion efter at klemmen var fjernet. Operationsbordet og stuetemperaturen blev holdt på 37 grader under operationen. I behandlingsmodeller blev 100 ug Norm-EV'er eller Hypo-EV'er i 0,15 ml PBS-opløsningsmiddel administreret ved haleveneinjektion umiddelbart efter operationen og dag (D) 1 efter operationen i henholdsvis Norm-EV'er og Hypo-EV'er-grupperne. Det samme volumen af ​​PBS blev administreret ved haleveneinjektion i PBS-gruppen. Musene blev dræbt ved D 2, D 7 og D 14 efter kirurgi (fig. la).

5. Internalisering af MSC-EV'er

For at kontrollere, om elbiler kunne internaliseres af beskadigede nyrer. Dil (Yeasen) fluorescerende farvning blev udført for at mærke EV'erne. Te Norm-EV'er eller Hypo-EV'er (200 ug), der var opløst i 100 μL PBS, blev inkuberet med 4 μM Dil ved 37 grader i 1 time. De ubundne farvestoffer blev derefter fjernet under anvendelse af en exosom spin-søjle (Invitrogen). Di/Norm-EV'erne og Dil/Hypo-EV'erne blev suspenderet i PBS til efterfølgende brug. Dil/Norm-EV'er eller Dil/HypoEV'er (100 ug) blev intravenøst ​​injiceret i en iskæmi-reperfusionsskade (I/R) modelmus via halevenen umiddelbart efter operationen og på D 1 postkirurgi som nævnt ovenfor. På dag 1, 3, 5 og 7 blev musene afbildet med det samme ved hjælp af Living Image Software 4.4 (PerkinElmer). Desuden blev nyrerne opsamlet og observeret på et optisk billeddannelsessystem på D 7. Alle bioluminescensbilleddannelsessignaler (BLI) blev målt ved den gennemsnitlige udstråling fra regionerne af interesse (ROI'er).

6. Transmissionselektronmikroskop (TEM)

I alt 1 mm3 nyrevæv blev fikseret i 2,5 procent glutaraldehyd (pH 7,4) ved 4 grader i 24 timer. Derefter blev vævet fikseret med 1 procent osmiumsyre i 2-3 timer, dehydreret med acetone og ethanol og indlejret med epoxyharpiks. Derefter blev en ultramikrotom brugt til at fremstille ultratynde snit med en tykkelse på 60 nm, som derefter blev farvet med 3 procent uranylacetat og blycitrat. Til sidst blev afsnittet observeret under en TEM (Japan).

7. Nyrefunktionsanalyse

En blodprøve blev opsamlet fra halevenen på D3, og niveauerne af blodurinstofnitrogen (BUN) i musene blev testet ved anvendelse af et passende kit (Bioassay).

8. Nyrehistopatologisk vurdering

Nyrevæv blev fikseret i 10 procent formalin i 48 timer, indlejret i paraffin, snit i 3 μm tykkelse, farvet med Masson-farvningsreagenser ved en standardprotokol og observeret ved hjælp af et mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Procentdelen af ​​kollagenaflejringsareal blev beregnet ved hjælp af ImageJ-software. Der var mindst 10 tilfældige ikke-overlappende felter pr. dyr til scoring.

9. Immunhistokemi

De paraffinindlejrede nyresektioner blev forbehandlet under anvendelse af varmemedieret antigenudvinding med natriumcitratbuffer (pH 6, epitopudvindingsopløsning 1) i 20 minutter efterfulgt af inkubation med primære antistoffer natten over ved 4 grader. Sektionerne blev derefter inkuberet med et biotinyleret sekundært antistof, og 3,3'-diaminobenzidin (DAB) blev anvendt som chromogen. Sektionerne blev derefter modfarvet med hæmatoxylin og observeret med et optisk mikroskop. De anvendte primære antistoffer var som følger: CPT1A (ab128568, Abcam) og Vimentin (ab92547, Abcam).

10. Immunfluorescens

Celler eller væv blev permeabiliseret med 0.2 procent Triton X-100 i 5 minutter, blokeret med fåreserum i 30 minutter og inkuberet med -glatmuskelaktin (-SMA, 1:200, 55135, Proteintech) eller collagen I (1:100, ab270993, Abcam) antistof i 16-18 timer ved 4 grader, efterfulgt af inkubation med Cy3-konjugeret sekundært antistof (rødt) ved stuetemperatur i 1 time. Kerner blev modfarvet med DAPI. Fluorescerende farvning af vævssnittene blev afbildet ved konfokal fluorescensmikroskopi.

11. Western blotting-analyse

Nyrerne, cellerne eller EVs pellets blev lyseret i RadioImmune Precipitation Assay (RIPA) lysisbuffer indeholdende phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), og supernatantsuspensionen opnået efter centrifugering blev målt ved hjælp af et BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific). Proteinprøver af samme kvalitet (20 ug/bane) blev tilsat til en 10 procent eller 12 procent natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel (SDS-PAGE) og derefter overført fra SDS-PAGE-gelerne til membranerne. Membranen blev blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med en 1X kaseinopløsning og derefter inkuberet med primære antistoffer ved 4 grader mod følgende proteiner: -SMA (ab7817, Abcam), vimentin (ab92547, Abcam), glyceraldehyd 3- fosfatdehydrogenase (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), actin (20536-1-AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), succinatdehydrogenasekompleks jern svovl underenhed B (SDHB , 10620-1-AP, Proteintech), cytochrom c-oxidase-underenhed IV (COXIV, ab202554, Abcam) og ATPB (17247-1-AP, Proteintech). Membranen blev derefter inkuberet med det tilsvarende sekundære antistof i 1,5 time ved stuetemperatur og vasket tre gange. Billederne blev analyseret ved hjælp af ImageJ-software.

12. Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR)

Først blev RNA ekstraheret fra de lyserede celler eller nyrevæv ved hjælp af Trizol-reagens (Invitrogen), og derefter blev RNA'et syntetiseret til cDNA i henhold til producentens instruktioner ved hjælp af ReverTra Ace qPCR RT-kittet (Toyobo). Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid blev udført ved hjælp af SYBR Select Master Mix (Life Technologies) og et RT-qPCR-detektionssystem (ABI). Primerne for følgende gener blev syntetiseret: PPAR fremad TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, omvendt GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 frem AATGCAGCGGTCTTAGCACT, tilbage CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, tilbage CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 frem CATCGT ACCCACCATGCACT, baglæns CTCCTTCCCAATGCC GTTCT, GTTCT, 18S AGCATCATCCATGA og GTTCT ekspressionen af ​​hvert målgen blev normaliseret af 18S-genet og beregnet ved 2−ΔΔCT metode.

13. Måling af mitokondriel membranpotentiale

Det mitokondrielle membranpotentiale (MMP) blev detekteret ved hjælp af JC-1 (Beyotime). Først blev JC-1-farvningsarbejdsopløsning opnået ved at tilsætte 8 mL ultrarent vand for hver 50 μL JC-1 (200X), som blev hvirvlet voldsomt for at opløses fuldstændigt, og derefter 2 mL JC{{ 7}} farvningsbuffer (5X) blev tilføjet. For det andet blev celler i en seksporet plade vasket to gange i PBS, og derefter blev 1 ml JC-1-farvningsarbejdsopløsning tilsat og efterladt i 20 minutter ved 37 grader C. Til sidst blev cellerne vasket med PBS igen og 2 ml af cellekulturopløsningen blev tilsat. Visualiserede billeder blev erhvervet ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Cistanche kapsler

14. Påvisning af mitokondrielle reaktive oxygenarter (ROS).

Mitokondriel ROS-generering blev målt ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). MitoSOX-reagensarbejdsopløsning (2,0 ml, 5 μM) blev tilsat for at dække cellerne i de seks-porede plader, efterfulgt af farvning med MitoSOX Red i 10 minutter ved 37 grader. Derefter blev cellerne vasket med PBS tre gange, og de visualiserede billeder blev erhvervet ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

15. ATP-detektion

ATP-produktion blev bestemt gennem Enhanced ATP Assay Kit (Beyotime, Kina, Kat.nr.: S0027) i henhold til producentens protokol.

16. Statistisk analyse

Kvantificeringen og graferne blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, USA) og præsenteret som middel ± standard fejl af middelværdien. Forskelle mellem flere grupper blev analyseret ved hjælp af variansanalyse (ANOVA), og statistisk signifikans blev sat til P < 0.05.

Diskussion

I denne undersøgelse fokuserede vi på FAO i nyrefibrose, og vi identificerede metaboliske enzymer (CPT1A) og transkriptionsregulatorer (PGC1, PPAR) af FAO, hvilket indikerede, at Hypo-EV'er kan vende fedtsyremetabolismeforstyrrelser i fibrotisk nyre forårsaget af I /R. Desuden fandt vi, at Hypo-EV'er udøver en dybtgående effekt på CPT1A-medieret FAO, som delvist tilskrives reguleringen af ​​mitokondriel homeostase.

I de senere år har et stigende antal undersøgelser rapporteret den nyrebeskyttende effekt af MSC-EV'er in vivo-modeller af CKD, og ​​en lille mængde tilgængelige data viste, at EV'er var overlegne eller lige så effektive i renobeskyttelse sammenlignet med deres moder-MSC [43] . Behandlingen af ​​MSC-EV'er ved CKD er i sin vorden, og den komplekse mekanisme er ikke fuldt ud påvist. AKI er en af ​​hovedfaktorerne for CKD, som fører til nyresygdom i slutstadiet [44], og nyre-I/R-skade er en vigtig faktor for AKI, så vi vælger I/R-induceret fibrosemodel for at afdække potentielle molekylære mekanismer, der hvordan MSC-EV'er forhindrer nyrefibrose.

Det lave udbytte af MSC-EV'er er en begrænsende faktor for storstilet produktion af cellefri terapier. Således er forskellige potentielle tilgange til at øge udbyttet af EV'er blevet undersøgt, herunder optimering af MSC-kulturbetingelser, tredimensionelle ekstracellulære matrixbaserede stilladser og regulering af EV'ers biogenese [10]. Blandt dem er hypoxisk konditionering af MSC en gyldig metode til at øge effekten af ​​EV-behandling ved forskellige sygdomme, såsom heling af knoglebrud [30], diabetisk sårheling [29] og myokardiereparation [45]. Vores undersøgelse giver bevis for den hypoxi-forstærkede virkning af EV'er udskilt af MSC. Desuden viser vi også, at hypoxiske prækonditionerede MSC-afledte EV'er har en større anti-fibrose og nyrebeskyttende effekt end Norm-EV'er ved CKD induceret af I/R. Data om miRNA'er i Hypo-EV'er sammenlignet med Norm-EV'er er blevet rapporteret godt. Talrige undersøgelser har rapporteret, at miRNA-indholdet var ansvarlig for de gavnlige virkninger af Hypo-EV'er i mange sygdomme [30, 46]. Sammenlignet med Norm-EV'er blev 215 miRNA'er opreguleret og 369 miRNA'er nedreguleret i fedtafledte Hypo-EV'er, som hovedsageligt regulerer cellemetabolisme, differentiering og TGF-funktion [29]. Imidlertid er mekanismen, hvorved Hypo-EV'er regulerer metabolismefunktionen, stadig dårligt forstået ved CKD. En stor mængde litteratur indikerer, at FAO reduceres i nyrefibrose og bidrager til dets patogenese [47]. I overensstemmelse med rapporterne viste vores undersøgelse, at genekspressionen af ​​FAO-relaterede metaboliske nøgleenzymer (CPT1A, CPT2 og ACOX2) og FAO-transskriptionsregulerende faktorer (PPAR og PGC1) var markant reduceret i nyrefibrose induceret af I/R.

Desuden er genoprettelse af lipidmetabolisme en potentiel strategi til behandling af nyrefibrose [48]. Overekspressionen af ​​CPT1A i nyretubuli er en væsentlig bidragyder til funktionsforøgelsen i FAO og resulterer i beskyttelse af nyrefunktion og fibrose ved at forhindre mitokondriel dysfunktion, TEC-differentiering og inflammation i CKD-dyremodeller [21]. Vores data viste, at Hypo-EV'er godt kunne vende beskadiget FAO i I/R-induceret fibrose, hvilket tyder på, at de terapeutiske virkninger af Hypo-EV'er ved nyrefibrose delvist er resultatet af genoprettelse af FAO.

Nedsat nyre-PPAR-signalering nedsatte aktiviteten af ​​FAO-vejen og forværret udvikling af nyrefibrose [49]. Administration af fenofibrat, en PPAR-agonist, genoprettede fedtoxidationsdefekten og tubulointerstitiel fibrose i CKD [50, 51]. PGC-1 er en co-aktivator af PPAR i den transkriptionelle kontrol af mitokondriel FAO-kapacitet [39]. Vi undersøgte, om HypoEV'er kan øge PPAR-signalering og genoprette FAO i I/R-skade. Vores resultater viste, at der ikke var nogen åbenlyse forskelle i udtrykket af PGC-1 og PPARa mellem Norm-EV'er og Hypo-EV'er. Derfor skal der være andre faktorer, der fremmer forekomsten af ​​denne proces. Mitokondrier er kraftværket for FAO til at generere energi til cellen [52]. Mitokondriel dysfunktion er kritisk i patogenesen af ​​nyrefibrose [53]. Restaurering af mitokondriel homeostase er dukket op som en lovende terapeutisk strategi til at forhindre nyreskade og fremskynde nyrereparation [25]. Nylige undersøgelser har indikeret, at MSC-EV'er har en beskyttende effekt på mitokondriel skade forårsaget af AKI, som beskytter TEC'er mod fornærmelse ved at reducere mitokondriel fragmentering, normalisere mitokondriel membranpotentiale og vende mtDNA-deletion og mitokondrielle OXPHOS-defekter [26, 27]. Vores resultater viste, at Hypo-EVs-behandling genfandt unormalt mitokondriel morfologiskift, øget mitokondriel masse og forbedret mitokondriel funktion i fibrotiske nyrer. Vores resultater indikerer, at virkningerne af Hypo-EV'er på FAO kan opnås ved at regulere mitokondriel homeostase.

Der er nogle begrænsninger i vores undersøgelse. For eksempel viser vores data, at Hypo-EV'er har bedre antifibrotiske virkninger i I/R-skademus end Norm-EV'er. Vi bestemte imidlertid ikke det differentielle udtryk for indhold mellem Norm-EV'er og Hypo-EV'er og evaluerede heller ikke den specifikke måde, hvorpå Hypo-EV'er påvirker mitokondriel homeostase i denne undersøgelse.

Cistanche fordele

Konklusioner

Sammenfattende indikerer vores data, at Hypo-EV'er signifikant hæmmer nyrefibrose ved at genoprette CPT1Amedieret FAO, og disse effekter kan opnås ved at regulere mitokondriel homeostase. Vores resultater giver yderligere mekanisk støtte til udviklingen af ​​cellefri terapi for nyrefibrose.

Referencer

1. Kalantar-Zadeh K, Jafar TH, Nitsch D, Neuen BL, Perkovic V. Kronisk nyresygdom. Lancet. 2021;398(10302):786-802.

2. Xie Y, Bowe B, Mokdad AH, Xian H, Yan Y, Li T, Maddukuri G, Tsai CY, Floyd T, Al-Aly Z. Analyse af Global Burden of Disease-undersøgelsen fremhæver den globale, regionale og nationale undersøgelse. tendenser i epidemiologi af kronisk nyresygdom fra 1990 til 2016. Nyre Int. 2018;94(3):567–81.

3. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akut nyreskade. Lancet. 2019;394(10212):1949–64.

4. Zheng Z, Li C, Shao G, Li J, Xu K, Zhao Z, Zhang Z, Liu J, Wu H. Hippo-YAP/MCP-1 medieret tubulær maladaptiv reparation fremmer betændelse i nyresvigt genopretning efter iskæmisk AKI. Celledød Dis. 2021;12(8):754.

5. Yan H, Xu J, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Definition af terapeutiske mål for nyrefibrose: udnyttelse af patogenesens biologi. Biomed Pharmacother. 2021;143:112115.

6. Shi Z, Wang Q, Zhang Y, Jiang D. Ekstracellulære vesikler produceret af knoglemarvs mesenkymale stamceller dæmper nyrefibrose, delvist ved at hæmme RhoA/ROCK-vejen, i en UUO-rottemodel. Stamcelle Res Ther. 2020;11(1):253.

7. Kholia S, Herrera Sanchez MB, Cedrino M, Papadimitriou E, Tapparo M, Deregibus MC, Bruno S, Antico F, Brizzi MF, Quesenberry PJ, Camussi G. Mesenchymale stamcelle-afledte ekstracellulære vesikler forbedrer nyreskade i nyre- og thyresygdomme . Front Cell Dev Biol. 2020;8:188.

8. Birtwistle L, Chen XM, Pollock C. Mesenchymale stamcelle-afledte ekstracellulære vesikler til undsætning af nyreskade. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6596.

9. Huang Y, Yang L. Mesenchymale stamceller og ekstracellulære vesikler i terapi mod nyresygdomme. Stamcelle Res Ther. 2021;12(1):219.

10. Phan J, Kumar P, Hao D, Gao K, Farmer D, Wang A. Konstruktion af mesenkymale stamceller for at forbedre deres exosom-effektivitet og udbytte til cellefri terapi. J Ekstracelle-vesikler. 2018;7(1):1522236.

11. Bister N, Pistono C, Huremagic B, Jolkkonen J, Giugno R, Malm T. Hypoxia og ekstracellulære vesikler: en gennemgang af metoder, vesikulær last og funktioner. J Ekstracelle-vesikler. 2020;10(1): e12002.

12. Yang Y, Lee EH, Yang Z. Hypoxi-konditionerede mesenkymale stamceller i vævsregenereringsapplikation. Tissue Eng Part B Rev 2021.

13. Ishiuchi N, Nakashima A, Doi S, Yoshida K, Maeda S, Kanai R, Yamada Y, Ike T, Doi T, Kato Y, Masaki T. Hypoxi-forkonditionerede mesenkymale stamceller forhindrer nyrefibrose og inflammation ved iskæmi-reperfusion rotter. Stamcelle Res Ther. 2020;11(1):130.

14. Panizo S, Martinez-Arias L, Alonso-Montes C, Cannata P, Martin-Carro B, Fernandez-Martin JL, Naves-Diaz M, Carrillo-Lopez N, Cannata-Andia JB. Fibrose ved kronisk nyresygdom: patogenese og konsekvenser. Int J Mol Sci. 2021;22(1):408.

15. Humphreys BD. Mekanismer for nyrefibrose. Annu Rev Physiol. 2018;80:309–26.

16. Nastase MV, Zeng-Brouwers J, Wygrecka M, Schaefer L. Målretning af nyrefibrose: mekanismer og lægemiddelleveringssystemer. Adv Drug Deliv Rev. 2018;129:295–307.

17. Zhao X, Kwan JYY, Yip K, Liu PP, Liu FF. Målretning af metabolisk dysregulering til fibroseterapi. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(1):57–75.

18. Qi R, Yang C. Renale tubulære epitelceller: den forsømte mediator af tubulointerstitiel fibrose efter skade. Celledød Dis. 2018;9(11):1126.

19. Gewin LS. Nyrefibrose: den proksimale tubulis forrang. Matrix Biol. 2018;68:248–62.

20. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, Chinga F, Park AS, Tao J, Sharma K, Pullman J, Bottinger EP, Goldberg IJ, Susztak K. Defekt fedtsyreoxidation i renale tubulære epitelceller har en nøglerolle i udviklingen af ​​nyrefibrose. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

21. Miguel V, Tituana J, Herrero JI, Herrero L, Serra D, Cuevas P, Barbas C, Puyol DR, Marquez-Exposito L, Ruiz-Ortega M, Castillo C, Sheng X, Susztak K, Ruiz-Canela M, Salas-Salvado J, Gonzalez MAM, Ortega S, Ramos R, Lamas S. Nyretubuli Cpt1a overekspression beskytter mod nyrefibrose ved at genoprette mitokondriel homeostase. J Clin Invest. 2021;131(5):e140695.

22. Luo Z, Wang Y, Xue M, Xia F, Zhu L, Li Y, Jia D, Chen S, Xu G, Lei Y. Astragaloside IV forbedrer fedtstofskiftet i leveren hos aldrende mus ved at målrette mitokondriel aktivitet. J Cell Mol Med. 2021;25(18):8863-76.

23. Bhargava P, Schnellmann RG. Mitokondriel energi i nyrerne. Nat Rev Nephrol. 2017;13(10):629–46.

24. Jiang M, Bai M, Lei J, Xie Y, Xu S, Jia Z, Zhang A. Mitokondriel dysfunktion og AKI-til-CKD-overgangen. Am J Physiol Renal Physiol. 2020;319(6): F1105–16.

25. Tang C, Cai J, Yin XM, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Dong Z. Mitokondriel kvalitetskontrol ved nyreskade og reparation. Nat Rev Nephrol. 2021;17(5):299-318.

26. Zhao M, Liu S, Wang C, Wang Y, Wan M, Liu F, Gong M, Yuan Y, Chen Y, Cheng J, Lu Y, Liu J. Mesenchymale stamcelle-afledte ekstracellulære vesikler dæmper mitokondriel skade og inflammation ved at stabilisere mitokondrielt DNA. ACS Nano. 2021;15(1):1519-38.

27. Cao H, Cheng Y, Gao H, Zhuang J, Zhang W, Bian Q, Wang F, Du Y, Li Z, Kong D, Ding D, Wang Y. In vivo-sporing af mesenkymale stamcelle-afledte ekstracellulære vesikler forbedres mitokondriel funktion ved nyreiskæmi-reperfusionsskade. ACS Nano. 2020;14(4):4014–26.

28. Gu D, Zou X, Ju G, Zhang G, Bao E, Zhu Y. Mesenchymale stromale celler afledte ekstracellulære vesikler afhjælper akut nyreiskæmi-reperfusionsskade ved hæmning af mitokondriel fission gennem miR-30. Stamceller Int. 2016;2016:2093940.

29. Wang J, Wu H, Peng Y, Zhao Y, Qin Y, Zhang Y, Xiao Z. Hypoksi adipose stamcelle-afledte exosomer fremmer højkvalitets heling af diabetiske sår involverer aktivering af PI3K/Akt-veje. J Nanobioteknologi. 2021;19(1):202.

30. Liu W, Li L, Rong Y, Qian D, Chen J, Zhou Z, Luo Y, Jiang D, Cheng L, Zhao S, Kong F, Wang J, Zhou Z, Xu T, Gong F, Huang Y, Gu C, Zhao X, Bai J, Wang F, Zhao W, Zhang L, Li X, Yin G, Fan J, Cai W. Hypoksiske mesenkymale stamcelle-afledte exosomer fremmer heling af knoglebrud ved overførsel af miR{{2} }. Acta Biomater. 2020;103:196-212.

31. Rong Y, Zhang J, Jiang D, Ji C, Liu W, Wang J, Ge X, Tang P, Yu S, Cui W, Cai W. Hypoksisk forbehandling af små ekstracellulære vesikler medierer bruskreparation ved slidgigt ved at levere miR{ {1}}a-5s. Acta Biomater. 2021;122:325-42.

32. Yang C, Chen Z, Yu H, Liu X. Inhibition of Disruptor of Telomeric Silencing 1-Som lindret renal iskæmi og reperfusionsskade-induceret fibrose ved at blokere PI3K/AKT-medieret oxidativ stress. Drug Des Devel Ther. 2019;13:4375-87.

33. Qian Y, Qian C, Xie K, Fan Q, Yan Y, Lu R, Wang L, Zhang M, Wang Q, Mou S, Dai H, Ni Z, Pang H, Gu L. P2X7-receptorsignalering fremmer inflammation i renale parenkymceller, der lider af iskæmi-reperfusionsskade. Celledød Dis. 2021;12(1):132.

34. Hu MC, Shi M, Gillings N, Flores B, Takahashi M, Kuro OM, Moe OW. Rekombinant alfa-Klotho kan være profylaktisk og terapeutisk til akut til kronisk nyresygdomsprogression og uremisk kardiomyopati. Nyre Int. 2017;91(5):1104–14.

35. Dubois V, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B. Distinkte, men komplementære bidrag fra PPAR-isotyper til energihomeostase. J Clin Investig. 2017;127(4):1202–14.

36. Desvergne B, Wahli W. Peroxisomproliferator-aktiverede receptorer: nuklear kontrol af metabolisme. Endocr Rev. 1999;20(5):649-88.

37. Libby AE, Jones B, Lopez-Santiago I, Rowland E, Levi M. Nukleare receptorer i nyren under sundhed og sygdom. Mol Aspekter Med. 2021;78:100935.

38. Bougarne N, Weyers B, Desmet SJ, Deckers J, Ray DW, Staels B, De Bosscher K. Molecular actions of PPARalpha in lipid metabolism and inflammation. Endocr Rev. 2018;39(5):760–802.

39. Vega RB, Huss JM, Kelly DP. Coaktivatoren PGC-1 samarbejder med peroxisomproliferatoraktiveret receptor alfa i transkriptionel kontrol af nukleare gener, der koder for mitokondrielle fedtsyreoxidationsenzymer. Mol Cell Biol. 2000;20(5):1868-76.

40. Li SY, Susztak K. Rollen af ​​peroxisom proliferator-aktiveret receptor gamma coactivator 1alpha (PGC-1alpha) i nyresygdom. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.

41. Fransen M, Lismont C, Walton P. Peroxisom-mitokondrierforbindelsen: Hvordan og hvorfor? Int J Mol Sci. 2017;18(6):1126.

42. Aparicio-Trejo OE, Avila-Rojas SH, Tapia E, Rojas-Morales P, Leon-Contreras JC, Martinez-Klimova E, Hernandez-Pando R, Sanchez-Lozada LG, PedrazaChaverri J. Kronisk svækkelse af mitokondriel bioenergetik og beta-energi -oxidation fremmer eksperimentel AKI-til-CKD-overgang induceret af folinsyre. Free Radic Biol Med. 2020;154:18–32.

43. Eirin A, Lerman LO. Mesenkymale stam-/stromalcelle-afledte ekstracellulære vesikler til kronisk nyresygdom: Er vi der endnu? Forhøjet blodtryk. 2021;78(2):261-9.

44. Kurzhagen JT, Dellepiane S, Cantaluppi V, Rabb H. AKI: en stadig mere anerkendt risikofaktor for CKD udvikling og progression. J Nephrol. 2020;33(6):1171-87.

45. Zhu J, Lu K, Zhang N, Zhao Y, Ma Q, Shen J, Lin Y, Xiang P, Tang Y, Hu X, Chen J, Zhu W, Webster KA, Wang J, Yu H. Myokardiereparative funktioner af exosomer fra mesenkymale stamceller forstærkes af hypoxibehandling af cellerne via overførsel af mikroRNA-210 på en nSMase2--afhængig måde. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(8):1659–70.

46. ​​Zhu LP, Tian T, Wang JY, He JN, Chen T, Pan M, Xu L, Zhang HX, Qiu XT, Li CC, Wang KK, Shen H, Zhang GG, Bai YP. Hypoxi-fremkaldte mesenkymale stamcelle-afledte exosomer letter hjertereparation gennem miR-125b-medieret forebyggelse af celledød i myokardieinfarkt. Teranostik. 2018;8(22):6163-77.

47. Xie YH, Xiao Y, Huang Q, Hu XF, Gong ZC, Du J. CTRP6/AMPK-vejens rolle i nyrefibrose gennem fremme af fedtsyreoxidation. Eur J Pharmacol. 2021;892:173755.

48. Chen YY, Chen XG, Zhang S. Drugability af lipidmetabolisme modulation mod nyrefibrose. Acta Pharmacol Sin. 2021.

49. Chung KW, Lee EK, Lee MK, Oh GT, Yu BP, Chung HY. Svækkelse af PPARalpha og fedtsyreoxidationsvejen forværrer nyrefibrose under aldring. J Am Soc Nephrol. 2018;29(4):1223–37.

50. Han SH, Malaga-Dieguez L, Chinga F, Kang HM, Tao J, Reidy K, Susztak K. Deletion af Lkb1 i renale tubulære epitelceller fører til CKD ved at ændre stofskiftet. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):439–53.

51. Jao TM, Nangaku M, Wu CH, Sugahara M, Saito H, Maekawa H, Ishimoto Y, Aoe M, Inoue T, Tanaka T, Staels B, Mori K, Inagi R. ATF6alpha-nedregulering af PPARalpha fremmer lipotoksicitet-induceret tubulointerstitiel fibrose. Nyre Int. 2019;95(3):577–89.

52. Spinelli JB, Haigis MC. De mangefacetterede bidrag fra mitokondrier til cellulær metabolisme. Nat Cell Biol. 2018;20(7):745–54.

53. Chung KW, Dhillon P, Huang S, Sheng X, Shrestha R, Qiu C, Kaufman BA, Park J, Pei L, Baur J, Palmer M, Susztak K. Mitokondriel skade og aktivering af STING-vejen fører til nyrebetændelse og fibrose. Celle Metab. 2019;30(4):784–99.

Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1 , Qianqian Chen1 , Yinghua Zhao4 , Liangmei Chen5 , Xu Wang1 og Xiangmei Chen1,2

1 Afdeling for nefrologi, første medicinske center på kinesisk PLA General Hospital, Nefrologisk Institut for den kinesiske folks befrielseshær, State Key Laboratory of Kidney Diseases, National Clinical Research Center for Kidney Diseases, Beijing Key Laboratory of Kidney Disease Research, Beijing, Kina.

2 Afdeling for nefropati, The Second Hospital of Jilin University, Changchun, Kina.

3 Nyreforskningsinstituttet, National Clinical Research Center for Geriatrics and Division of Nephrology, West China Hospital ved Sichuan University, Chengdu, Kina.

4 School of Clinical Medicine, Tsinghua University, Beijing, Kina.

5 Nefrologisk afdeling, det første tilknyttede hospital ved Jinan University, Guangzhou, Kina.