Hypotermi induceret af oxcarbazepin efter forbigående iskæmi i forhjernen udøver terapeutisk neurobeskyttelse gennem forbigående receptorpotentiale vanilloid type 1 og 4 i gerbiler del 3

4. Materialer og metoder

4.1. Forsøgsdyr

Hankønsrotter (samlet antal=252) blev brugt i en alder af 6 måneder (legemsvægt, 63-78 g). Gerbilerne blev opdrættet i det eksperimentelle dyrecenter ved Kangwon NationalUniversity (Chuncheon, Korea).

Gerbiler er meget søde små dyr. De lever i ørkenområder, er gode til at grave huler og har stærke instinkter for at opbevare og lokalisere mad. Blandt disse små fyre har mandlige ørkenrotter en særlig god hukommelse, som får folk til at ønske at kende deres hemmeligheder.

For det første, når mandlige ørkenrotter leder efter mad, bruger de en række signaler såsom vartegn og terræn til at bestemme retningen. Gennem længere tids observation og praksis har de etableret deres eget "geografiske informationssystem". I modsætning hertil har kvindelige ørkenrotter en dårligere hukommelse for disse signaler, især i et konstant skiftende miljø.

For det andet viser mandlige ørkenrotter også en stærk hukommelse, når de kæmper mod naturlige fjender. Ifølge videnskabsmænd, når ørkenrotten er truet, vil de hurtigt komme ind i hulen og forsøge at flygte. Men når de står over for den samme trussel, vil mandlige ørkenrotter huske naturlige fjenders angrebsmåde og undgå dem, hvilket øger deres chancer for at overleve.

Endelig ligger erindringen om mandlige ørkenrotter også i deres sociale adfærd med hinanden. Hver ørkenrotte har sin unikke lugt. Når de møder andre ørkenrotter, vil de bruge deres lugtesans til at identificere hinandens identitet og status. Denne hukommelsesevne tillader ikke kun ørkenrotter at etablere en relativt stabil social forbindelse, men er også en vigtig garanti for deres reproduktion.

Sammenfattende er forholdet mellem mandlige ørkenrotter og hukommelse uadskilleligt. I processen med at søge overlevelse og reproduktion i naturen stoler de på deres stærke hukommelse til konstant at tilpasse sig miljøet og forbedre sig selv. Som mennesker bør vi lære af disse små fyre og konstant finpudse vores hukommelse for bedre at tilpasse os denne evigt skiftende verden. Det kan ses, at vi skal forbedre vores hukommelse, og Cistanche kan forbedre hukommelsen markant, fordi den også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer, som er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelig næring og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på Know for at øge hukommelsesstyrken

For denne undersøgelse blev forsøgsprotokollen godkendt (godkendelsesnr. KW-200113-1; godkendelsesdato, 18. februar 2020) af Institutional AnimalCare and Use Committee.

Forskningsprotokollen overholdt retningslinjerne foreslået i "Current International Laws and Policies" i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals udgivet af The National Academies Press (8. udgave, 2011).

4.2. Eksperimentelle grupper, induktion af tFI og HyT- og OXC-behandlinger

For at bevise de beskyttende virkninger af OXC mod iskæmisk skade efter FI i ørkenrotter, blev ørkenrotterne opdelt i seks grupper: (1) sham+vehicle group (n=24); (2) tFI+vehicle group (n {{5) }}); (3) sham+HyT-gruppe (n=24); (4) tFI+HyT gruppe (n=60); (5) sham+OXC (200 mg/kg) gruppe (n=24); og (6) tFI+OXC-gruppe (n=60).

Syv og fem ørkenrotter i de tre tFI-grupper blev brugt til henholdsvis Western blot-analyse og histologisk undersøgelse 30 minutter, 12 timer, 1 dag, 2 dage og 4 dage efter tFI-operationen, og i de tre falske grupper, syv og fem ørkenrotter blev brugt 30 minutter og 4 dage efter den falske operation for at minimere antallet. I dette eksperiment blev tFI udviklet som tidligere beskrevet [34].

Kort sagt blev ørkenrotten bedøvet med 2,5 % isofluran (i 32 % oxygen og 68 % lattergas). Under bedøvelse blev begge almindelige halspulsårer isoleret fra halspulsåren og okkluderet med aneurismeklemmer (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tyskland, Tuttlingen, Tuttlingen, Tyskland) ) i fem minutter.

Det perfekte stop for blodtilførslen til hjernen blev bekræftet gennem observation af arteriel blodgennemstrømning i begge retinale arterier (grene af indre carotidarterier) ved hjælp af et oftalmoskop (HEINE K180®) fra Heine Optotechnik (Herrsching, Tyskland).

Kropstemperaturen før og under operationen i alle grupper blev kontrolleret ved normothermi (37 ± 0,2 ◦C) ved hjælp af et termometrisk tæppe. Efter fem minutters okklusion blev clipsene fjernet.

I denne undersøgelse blev en sham-operation udført ved at udsætte dem for den samme tFI-operation uden okklusion af de fælles halspulsårer. HyT i de to sham+HyT- og tFI+HyT-grupper blev kontrolleret (svarende til ændringen i kropstemperaturen i tFI+ OXC-gruppe) ved afkøling af hele kroppen med en ispose i seks timer.

Kropstemperaturen for de to sham+OXC- og tFI+OXC-grupper blev registreret i seks timer efter øjeblikkelig intraperitoneal injektion af 200 mg/kg OXC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) efter tFI-operationen.

Doseringen af ​​OXC blev valgt baseret på tidligere undersøgelse, der rapporterede, at 200 mg/kg OXC effektivt beskyttede mod celledød i hjernen efter [36]. For at registrere kropstemperaturændringen blev kropstemperaturen målt i endetarmen hver time efter tFI, over en 6 timers periode ved stuetemperatur (ca. 22 ◦C).

Gerbilerne fik en restitutionstid på fire dage efter tFI, fordi pyramideceller placeret i hippocampus CA1-regionen begynder at dø fire dage efter tFI [30,34,62].

4.3. SMA test

SMA-testen blev udført for at undersøge ændringer i hyperaktivitet i alle grupper. Kort sagt, som beskrevet tidligere [63], blev SMA-testen udført på dag 1 efter tFI, da lokomotorisk aktivitet når det højeste punkt på dag 1 efter iskæmisk skade efter tFI.

Ørkerotterne i alle grupper modtog miljøtilpasning i to timer, og de blev placeret i et åbent markbur (bredde 44 cm; længde 44 cm; højde 30) opnået fra Ugo Basile SRL (Gemonio, Italien), hvor to parallelle vandrette infrarøde stråler 4 × 8 fra gulvet blev installeret i en time. SMA blev optaget under anvendelse af et Photobeam Activity System-Home Cagefrom San Diego Instruments (San Diego, CA, USA).

Bevægelse (bane og total tilbagelagt distance) blev detekteret gennem afbrydelsen af ​​rækken af ​​infrarøde stråler produceret af fotoceller.

SMA blev overvåget kontinuerligt i en time, og dataene blev indsamlet ved hjælp af en AMB-analysator fra IPC Electronics (Cumbria, UK).

Dataindsamlingen blev påbegyndt 15 minutter efter tilvænning i det åbne markbur. Til sidst blev de opnåede resultater vurderet som afstanden (meter) af bevægelse i testperioden (en time).

4.4. Test af kognitive funktioner

4.4.1. RAMT

For at sammenligne rumlig hukommelse på tværs af alle grupper blev RAMT udført i henhold til tidligere undersøgelser [38,44]. En radial 8-armlabyrint fra Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA) blev brugt til denne test.

Labyrintinstrumentet bestod af en central platform og otte arme (hver armbredde 5 cm; højde 9 cm; længde 35 cm). Gerbilerne blev trænet en gang om dagen i tre dage før.

Pillefoder opnået fra DBL Co (Chungbuk, Korea) blev nemlig sat i endedelen af ​​hver arm, og hver ørkenrotte blev placeret på den centrale platform. Herefter ledte ørkenrotten efter foderet.

Efter sham- eller tFI-operationen blev den rigtige test udført en gang om dagen i fire dage, begyndende en dag efter operationen.

Til analysen blev antallet af fejl evalueret, hvor der opstod en fejl hver gang ørkenrotten gik ind i en arm, der allerede var besøgt før. Testen var afsluttet, da ørkenrotten spiste foderet.

4.4.2. KLAPPE

For at sammenligne korttidshukommelsen på tværs af grupperne blev PAT udført i henhold til tidligere rapporterede metoder [64,65] med nogle modifikationer. Kort sagt blev ørkenrotterne testet ved hjælp af Gemini Avoidance System (GEM 392) fra San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), som består af to (mørke og lyse) rum, der kommunikerer med hinanden via en lodret skydeport.

De eksperimentelle sessioner blev udført i to faser: en træningssession og en reel testsession udført en dag før og fire dage efter tFI- eller sham-operationen.

Den rigtige test blev udført 20 minutter efter træningssessionen ved at måle latenstiden (sekunder) under opholdet i det mørke rum. I træningssessionen fik ørkenrotten nemlig lov til at udforske de to rum frit i et minut, mens lågen blev åbnet .

Derefter, da ørkenrotten gik ind i det mørke rum, blev døren lukket, og ørkenrotten fik et elektrisk fodstød (0,5 mA) fra et stålgitter på gulvet i fem sekunder.

I den rigtige testsession, på dag 4 efter tFI, blev ørkenrotten placeret i det lyse rum, og latenstiden i det lyse rum, før det gik ind i det mørke rum, blev registreret.

4.5. Western Blot-analyse for TRPV1 og TRPV4

For at undersøge ekspressionsniveauerne af TRPV1 og TRPV4 i gerbil hippocampal CA1 blev Western blot-teknikken udført i overensstemmelse med tidligere beskrevne metoder [66,67].

I overensstemmelse med det angivne skema (30 min, 12 timer, 1 dag, 2 dage og 4 dage efter sham- eller tFI-operation) fik ørkenrotter (n=5 for hver gruppe) bedøvelse til eutanasi ved intraperitoneal injektion med 200 mg/kg pentobarbitalnatrium (JW Pharm.Co., Ltd., Seoul, Korea).

Derefter blev deres hjerner høstet og homogeniseret med 50 mM fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) indeholdende 0,1 mM ethylenglycol-bis (aminoethylether)-N, N, N{{ 11}}, N0-tetraeddikesyre (EGTA) (pH 8.0), 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (pH 8,0), 0,2 % Nonidet P{{17 }}, 15 mM natriumpyrophosphat, 100 mM -glycerophosphat, 2 mM natriumorthovanadat, 50 mM NaF, 150 mM NaCI, 1 mMphenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mM dithiothreitol (DTT).

Derefter blev prøverne centrifugeret, og supernatanterne blev taget for at bestemme proteinniveauer under anvendelse af et Micro BCA assaykit fra Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) med bovineserumalbumin fra Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Alikvoter inklusive 20 µg af det samlede protein blev kogt i ladningsbuffer, 150 mM Tris (pH 6,8) indeholdende 6% natriumdodecylsulfat (SDS), 3 mM DTT, 0,3% bromphenolblåt og 30% glycerol.

Prøverne blev adskilt via 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). Derefter blev gelerne overført til nitrocellulosemembraner fra Pall Co (East Hills, NY, USA) ved 350 mA og 4 ◦C i 90 min.

For at blokere ikke-specifik farvning blev membranerne inkuberet i 5 % affedtet mælk i 60 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev de immunreageret med hvert primært antistof: kanin anti-TRPV1 (fortyndet 1:1000) (Abcam, Cambridge, UK), kanin anti-TRPV4 (fortyndet 1:1000) (Abcam) og kanin anti- - actin (fortyndet 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ◦C i 7 timer.

Efterfølgende blev de reageret med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret æsel anti-kanin IgG (fortyndet 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ved stuetemperatur i 1 time.

Endelig blev aluminol-baseret kemiluminescens kit fra Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) brugt til at forbedre visualisering.

Som beskrevet tidligere [68] blev immunoblots af TRPV1 og TRPV4 analyseret ved hjælp af Scion Image-software fra Scion Crop (Frederick, MD, USA). Båndene blev scannet, og densitometriske analyse blev udført. Proteinniveauerne blev normaliseret versus det tilsvarende niveau af -actin.

4.6. Udarbejdelse af histologiske snit

Til immunhistokemiske og histopatologiske undersøgelser blev ørkenrotten (n=7 for hver gruppe) aflivet i overensstemmelse med det angivne skema (30 min, 12 timer, 1 dag, 2 dage og 4 dage efter tFI- eller falsk operation).

Som tidligere beskrevet [34] blev gerbilerne dybt bedøvet med pentobarbitalnatrium (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seoul, Korea). Under bedøvelse blev ørkenrotterne skyllet transkardialt med 0,1 M phosphatbuffer-saltvand (pH 7,4) og fikseret med 4% paraformaldehyd (i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4).

Efterfølgende blev deres hjerner opnået og efterfikseret ved anvendelse af det samme fikseringsmiddel i seks timer. Derefter blev hjernevævet skåret (25 µm tykkelse af koronale planer) i akryostat (Leica, Wetzlar, Tyskland).

4.7. Histokemisk farvning ved hjælp af CV

For at undersøge den morfologiske og neuronale skade i hippocampus af hver gruppe blev kresylviolet (CV) farvning udført som vi tidligere beskrevet [69]. Kort fortalt blev cresylvioletacetat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) opløst ved 1,0% (vægt/volumen) i destilleret vand og iseddikesyre (0.28 %) blev tilsat til denne opløsning. Sektionerne blev farvet og monteret med canadisk balsam (Kanto, Tokyo, Japan).

4.8. FJ B Farvning

FJ B-farvning blev udført for at undersøge neuronal degeneration (død eller tab). Ifølge den offentliggjorte procedure [34] blev de forberedte hjernesektioner gennemblødt i 1% natriumhydroxid, straks overført til 0.06% kaliumpermanganat og omgående reageret med 0,0004% Fluoro-Jade B (Histochem) , Jefferson, AR, USA).

Sektionerne blev kortvarigt vasket og sat på en objektglasvarmer (ca. 50 ◦C) til reaktion med FJ B. For at vurdere den terapeutiske effekt af OXC mod tFI blev antallet af FJ B+-celler talt i CA1-regionen ifølge en metode offentliggjort i [ 70].

Kort fortalt blev digitale billeder af FJ B+-celler taget fra fem sektioner pr. gerbil ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop (Carl Zeiss) (Oberkochen, Tyskland) ved 450-490 nm bølgelængde. Cellerne blev talt i 250 µm2, som inkluderede SP, i midten af ​​CA1-regionen ved hjælp af et billedanalysesystem (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA).

4.9. Immunhistokemi

For at undersøge ændringer i NeuN-, TRPV1- og TRPV4-immunreaktivitet i CA1-regionen blev der udført generel immunhistokemi. Kort sagt, ifølge en offentliggjort metode [34] blev de forberedte hjernesektioner inkuberet med primære antistoffer - muse-anti-NeuN (fortyndet, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, USA), muse-anti-TRPV1 (fortyndet, 1:500) (Abcam, Cambridge, Storbritannien) og kanin-anti-TRPV4 (fortyndet, 1:500) (Abcam, Cambridge, Storbritannien).

Derefter blev disse inkuberede sektioner inkuberet i de tilsvarende sekundære antistoffer (fortyndet, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) og udviklet under anvendelse af Vectastain ABC (fortyndet, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) , USA). Endelig havde disse immunreagerede sektioner farve efter visualisering med 3,3'-diaminobenzidin.

Antallet af NeuN+-celler blev talt som følger. Digitale billeder af NeuN+celler blev fanget fra fem sektioner pr. gerbil ved hjælp af et lysmikroskop (AxioM1) (Carl Zeiss, Tyskland).

Cellerne blev talt på samme måde som FJ B+celletællingen. For at vurdere tætheden af ​​TRPV1+ og TRPV4+strukturer blev de tilsvarende områder i CA1-regionen brugt i fem sektioner pr. dyr. Billeder af TRPV1+- og TRPV4+-strukturerne blev optaget ved hjælp af et AxioM1-lysmikroskop (Carl Zeiss) (Tyskland).

Tæthederne af TRPV{{0}} og TRPV4+strukturer blev evalueret som den relative optiske tæthed (ROD). Til denne ende blev billederne transformeret til det gennemsnitlige gråniveau. ROD blev præsenteret som en procentdel ved hjælp af Adobe Photoshop (version 8.0) og NIH Image J-software (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.10. Statistisk Analyse

Vi præsenterede dataene som middel ± standardfejl for middelværdien (SEM). Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism (version 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Forskelle i middelværdierne blandt de eksperimentelle grupper blev statistisk analyseret ved to-vejs variansanalyse (ANOVA) med en post hocBonferronis multiple sammenligningstest for at belyse tFI-relaterede forskelle blandt alle grupper. Statistisk signifikans blev betragtet ved p < 0. 05.

Forfatterbidrag: Konceptualisering: M.-HW og T.-KL; Metodik, J.-CL og DWK;Software, H.-IK og MCS; Validering, JHA, IJK og JHP; Undersøgelse, J.-CL, H.-IK og M.CS; Data Curation, JHC, IJK og JHP; Skrive-Original Draft Preparation, H.-IK og J.-CL; Skrive-anmeldelse og redigering, M.-HW; Supervision, S.-SL; Projektadministration, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL og T.-KL Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807) finansieret af National Research Foundation (NRF) i Korea, og af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af undervisningsministeriet (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Udtalelse fra institutionelle revisionsråd: ørkenrotterne blev opdrættet i det eksperimentelle dyrecenter ved Kangwon National University (Chuncheon, Korea). For denne undersøgelse blev den eksperimentelle protokol godkendt (godkendelsesnr., KW-200113-1; godkendelsesdato, 18. februar 2020) af Institutional AnimalCare and Use Committee.

Forskningsprotokollen overholdt retningslinjerne foreslået i "CurrentInternational Laws and Policies" i Guide for Care and Use of Laboratory Animals udgivet af The National Academies Press (8. udgave, 2011).

Erklæring om informeret samtykke: Ikke relevant.

Erklæring om datatilgængelighed: Dataene præsenteret i denne undersøgelse er tilgængelige på anmodning fra den tilsvarende forfatter.

Anerkendelser: Forfatterne sætter pris på Hyun Sook Kim og Seung Uk Lee for deres tekniske hjælp i denne undersøgelse.

Interessekonflikter: Forfatterne har erklæret, at der ikke er nogen økonomisk interessekonflikt.

Forkortelser

CA1: underfelt Cornu Ammonis 1; CNS, centralnervesystemet; CV, cresylviolet; DG, dentate gyrus; FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hypotermi; NeuN, neuronale kerner; OXC, oxcarbazepin; PAT, passiveundgåelsestest; ROD, relativ optisk tæthed; SMA, spontan motorisk aktivitet; SO, stratum oriens;SP, stratum pyramideformet; SR, stratum radiatum; tFI, forbigående iskæmi i forhjerne; TRPV1, transientreceptorpotentiale vanilloid type 1.

Referencer

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MY; Valdes, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Små forskelle i intraiskæmisk hjernetemperatur bestemmer kritisk omfanget af iskæmisk neuronal skade. J. Cereb. Blodgennemstrømningsmetab. 1987, 7, 729-738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Hypotermi som en potentiel behandling af cerebral iskæmi. Cerebrovasc. Hjernemetab. Rev. 1993, 5.277-300.

3. Sygeplejerske, S.; Corbett, D. Neurobeskyttelse efter flere dage med mild, lægemiddelinduceret hypotermi. J. Cereb. Blodgennemstrømningsmetab. 1996, 16.474-480. [CrossRef]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Opdatering af de akademiske prækliniske rundbords-anbefalinger for slagtilfældeterapi. Slagtilfælde 2009, 40, 2244-2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Terapeutisk hypotermi: Neuroprotektive mekanismer. Front. Biosci. 2007, 12, 816-825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Terapeutisk hypotermi ved akut slagtilfælde. Int. J. Stroke 2006, 1, 9-19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Terapeutisk hypotermi ved akut slagtilfælde. J. Neurosci. Sygeplejersker. 2011, 43, 94-103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Terapeutisk hypotermi ved akut iskæmisk slagtilfælde. Neurosurg. Fokus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Gennemførlighed og sikkerhed ved moderat hypotermi efter massivt hemisfærisk infarkt. Slagtilfælde 2001, 32, 2033-2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. Reguleret hypotermi reducerer hjernens oxidative stress efter hypoxisk iskæmi. Brain Res. 2004, 1017, 85-91. [CrossRef]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Farmakologisk hypotermi: Et potentiale for fremtidig slagtilfældebehandling? Neurol. Res.2016, 38, 478-490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Neuroprotektive virkninger af lægemiddelinduceret terapeutisk hypotermi ved sygdomme i centralnervesystemet. Curr. Drug Targets 2017, 18, 1392-1398. [CrossRef]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Antiepileptika som en mulig neurobeskyttende strategi i hjernens iskæmi. Ann. Neurol. 2003, 53, 693-702. [CrossRef]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS Anti-epileptiske lægemidler ved pædiatrisk traumatisk hjerneskade. Ekspert Rev. Neurother. 2016, 16, 1229-1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com