Hydrogensulfid dæmper nyre-I/R-induceret aktivering af den inflammatoriske respons og apoptose via regulering af Nrf2-medieret NLRP3-inhibering af signalvejen

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt. Nyreiskæmi/reperfusion (I/R) skade kan føre til akutNyresvigt, forsinket graftfunktion og graftafstødning. Nukleotidbindende oligomeriseringsdomæne NOD-lignende receptor indeholdende pyrindomæne 3 (NLRP3)-medieret inflammation deltager i udviklingen afnyreskade. Nrf2 accelererer NLRP3-signalvejsaktivering og regulerer yderligere det inflammatoriske respons. Derudover tjener svovlbrinte en beskyttende rolle inyreskade; den detaljerede underliggende mekanisme er dog stadig dårligt forstået. Denne undersøgelse undersøgte, om Nrf2- og NLRP3-veje deltager i hydrogensulfid-reguleretnyreI/R-induceret aktivering af det inflammatoriske respons og apoptose. Vildtype og Nrf2-knockout (KO) mus blev opereret for at inducerenyreI/R via fastspænding af bilateralennyrepedikler. I alt 20 mg/kg MCC950 (en NLRP3-hæmmer) blev injiceret intraperitonealt dagligt i 14 dage før operationen.Renalvæv og blod blev indsamlet fra I/R-modelmusene for at analysere NLRP3- og Nrf2-mRNA-ekspressionsniveauer, NLRP3-, PYD- og CARD-domæneholdige, caspase-1, IL-1, Nrf2 og hæm oxygenase 1-proteinekspressionsniveauer, celleapoptose, sekretion af tumornekrosefaktor-, IL-1 og IL-6 cytokiner ognyrehistopatologi og funktion.RenalI/R aktiverede NLRP3- og Nrf2-signalvejene. Omvendt hæmmede MCC950-behandling aktivering af NLRP3-signalvejen og forhindrede I/R-induceretnyreskade, frigivelse af cytokiner og apoptose inyreI/R model mus. Natriumhydrosulfid (NaHS) lindrede ikke kun opregulering af NLRP3-proteinekspressionsniveauer, men lindrede ogsånyreskade,frigivelsen af ​​cytokiner og celleapoptose induceret af renal I/R i vildtype mus, men ikke i Nrf2-KO mus. NaHS lindrede NLRP3-inflammasomaktivering,nyreskade,inflammatorisk respons og celleapoptose via Nrf2-signalvejen i nyre-I/R-modelmus.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESVIGT

Introduktion

Renal iskæmi/reperfusion (I/R) er en førende årsag til akutnyreskade(AKI), der typisk opstår undernyrekirurgi og disponerer individer for alvorlig dysfunktion i flere organsystemer. I/R-induceret celledød og inflammation indeninyrevæv er forbundet med komplekse patofysiologiske processer og fremmer faldet inyrefunktion,hvilket fører til ophobning af metaboliske affaldsprodukter (1). Ud over iskæmi-induceretnyrevævsskade, har reperfusion også vist sig at udløse en kompleks patofysiologisk kaskade, der involverer overdreven frigivelse af frie radikaler og akkumulering af inflammatoriske celler, der efterfølgende fremmer inflammation og yderligere forværrer lokal iskæmi og cellulær skade (2).

Underfamilier af det nukleotidbindende domæne og den leucinrige gentagelsesholdige familie spiller en nøglerolle i udviklingen af ​​det inflammatoriske respons (3). NLR-familiens pyrindomæne indeholder 3 (NLRP3) inflammasom (tidligere kendt som NACHT-, LRR- og PYD-domæner, der indeholder protein 3 og kryopyrin) er det mest karakteriserede inflammasom til dato. Et stigende antal undersøgelser har rapporteret en sammenhæng mellem NLRP3 ogrenal I/R. I AKI er NLRP3 involveret inyreI/R-skade (4,5). For eksempel lindrer knockdown af NLRP3 og dens adapter PYD og CARD domæneholdige (ASC) I/R-induceretnyredysfunktion og overdreven neutrofil tilstrømning tilnyrevæv(6). Derudover beskytter nedbrydningen af ​​NLRP3 og/eller caspase-1 mus mod AKI induceret af sepsis eller lipopolysaccharid (7,8). Disse resultater tyder på, at NLPR3-inflammasomet kan spille en nøglerolle i patogenesen afnyreskade.

Nrf2 er et endogent antioxidantgen, placeret i cytosolen, som kombineres med Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 (Keap). Når det er aktiveret, frigives Nrf2 fra Keep og translokerer ind i kernen, hvor det efterfølgende binder til antioxidantresponselementer for at initiere transskriptionen af ​​dets nedstrøms antioxidant- og cytobeskyttende målgener, såsom superoxiddismutase, katalase, glutathionperoxidase, glutathion-transferase-S-S- isozymer, katalytiske og modificerende underenheder af ‑glutamylcysteinligase og NADP(H): Quinonoxidoreduktase (9). Det er tidligere rapporteret, at Nrf2 er forbundet med AKI induceret af miljøfornærmelse, iskæmi eller xenobiotika(10). Bortset fra dens rapporterede beskyttende rolle i vævsskade, har tidligere undersøgelser også vist, at overekspression af Nrf2 undertrykker NLRP3-inflammasomaktivitet og forbedrer vævsskade (11-13). Imidlertid er den underliggende mekanisme for Nrf2-signalvejen og dens effekt på NLRP3-inflammasomaktivering inyreI/R forbliver ukendt.Hydrogensulfid (H2S) har opnået anerkendelse for sin evne til at regulere pattedyrs homeostase og fundamentale celleprocesser, såsom autofagi (14). En række undersøgelser har rapporteret, at H2S tjener en beskyttende rolle mod apoptose, oxidativ stress og inflammation inyreskade(15-20). Ikke desto mindre er den underliggende beskyttelsesmekanisme af H2S inyreskadeinduceret af I/R forbliver ukendt. Derfor undersøgte nærværende undersøgelse ekspressionsniveauerne af NLRP3 og dets adapter, ASC, i nyre-I/R-modelmus og bestemte efterfølgende effekten af ​​Nrf2 på NLRP3-ekspression. Nærværende undersøgelse havde også til formål at afgøre, om H2S beskytternyrevævmodnyreskade,inflammation og apoptose via Nrf2-medieret NLRP3-hæmning.

Nøgleord:nyreiskæmi/reperfusionsskade, Nrf2, hydrogensulfid, apoptose, nyreskade; Nyresvigt

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME

Materialer og metoder

Etablering af renal I/R model og behandlingsgrupper.I alt 24 vildtypehanmus (vægt, 20-25 g; alder, 6-8 uger) blev opnået fra Laboratory Animal Center ved Academy of Military Medical Sciences (Beijing, Kina). Derudover blev ni Nrf2-knockout (KO) hanmus (vægt, 20-25 g; alder, 6-8 uger) opnået fra Junke Biological Co., Ltd. Alle dyreprotokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee of General Hospital of Tianjin Medical University (godkendelsesnr. IRB2020-DW-04; Tianjin, Kina), og alle anstrengelser blev gjort for at minimere dyrelidelser og antallet af brugte dyr. Musene blev akklimatiseret til miljøet i 3 dage før eksperimentet ved 22˚C med 40-60 procent luftfugtighed, en 12-timers lys/mørke-cyklus og fri adgang til vand og gnaverfoder. Efter at mus var blevet bedøvet med intraperitoneal (ip) 50 mg/kg natriumpentobarbital, blev den bilateralenyrepedikler blev ligeret i 30 minutter under anvendelse af mikroaneurismeklemmer. Efterfølgende blev mikroaneurismeklemmerne fjernet. I kontrolgruppen blev operationen udført ved hjælp af samme proces; imidlertid,nyrepedikler blev ikke ligeret. Efter operationen blev 0,9 procent natriumchloridopløsning brugt til at hjælpe mus med at komme sig. Mus blev derefter aflivet efter reperfusion i 24 timer. I alt 24 vildtype mus blev tilfældigt opdelt i følgende seks grupper: i) Kontrol (Con) gruppe (n=9); ii) I/R-gruppe (n=9); iii) I/R plus MCC950 gruppe (n=3); og iv) I/R plus NaHS-gruppe (n=3). I alt ni Nrf2-KO-mus blev tilfældigt opdelt i følgende tre grupper: i) Con-gruppe (n=3); ii) I/R-gruppe (n=3); og iii) I/R plus NaHS-gruppe (n=3).

Ifølge tidligere forskning og foreløbige eksperimenter (21,22) blev 20 mg/kg MCC950 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) injiceret (ip) dagligt i 14 dage før operationen i I/R plus MCC950 gruppe. I alt 50 µmol/kg natriumhydrosulfid [NaHS; ip; fortyndet i normalt (0,9 procent) saltvand; Sigma-Aldrich; Merck KGaA] blev injiceret før operationen i I/R plus NaHS-gruppen. Når alle eksperimentelle procedurer var afsluttet, blev mus aflivet ved cervikal dislokation, og væv og blod blev opsamlet til efterfølgende analyse.

Western blotting. Nyrevævblev opsamlet fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion for at analysere proteinekspressionsniveauer. Kort fortalt blev total- og nukleinprotein ekstraheret under anvendelse af RIPA-buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.), og proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af et BCA Protein Assay-kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). I alt 40 µg protein pr. bane blev adskilt via 10 procent SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluoridmembraner og derefter blokeret med 5 procent mælk i 2 timer ved stuetemperatur. Membranerne blev efterfølgende inkuberet med følgende primære antistoffer natten over ved 4˚C: Anti-NLRP3 (1:500; kat.nr. ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; kat.nr.sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-caspase-1 (1:200; kat.nr. sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1,000; kat . nr. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1,000; kat. nr. ab137550; Abcam), anti-hæm oxygenase (HO)-1 (1:2,000 ; kat.nr. ab68477; Abcam), anti‑ ‑actin (1:2,000; kat.nr. ab8227; Abcam) og anti-histon H3 (1:2,000; kat nr. ab176842; Abcam). Efter primær antistofinkubation blev membranerne inkuberet med de tilsvarende HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1:5,000; kat nr. ab6721 og ab6728; begge Abcam) i 1 time ved stuetemperatur. Proteinbånd blev visualiseret med et forbedret kemiluminescens-kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ved hjælp af et Bio-Imaging-system (Bio-Rad Laboratories, Inc.) og semikvantificeret ved hjælp af Quantity One (V4.6) software (Bio-Rad Laboratories) , Inc.). Proteinekspressionsniveauer blev normaliseret til -actin for cytoplasmatisk protein eller histon for nukleinprotein.

Omvendt transskription-kvantitativ(RT‑q)PCR.Nyrevævblev opsamlet fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion for at analysere mRNA-ekspressionsniveauer. Kort fortalt blev totalt RNA ekstraheret fra væv under anvendelse af TRIzol®-reagens (kat. nr. 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Totalt RNA blev omvendt transskriberet til cDNA under anvendelse af et RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (kat. nr. K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) i henhold til producentens protokol. qPCR blev efterfølgende udført ved hjælp af SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) på et 7500 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Termocyklingsbetingelserne var som følger: Denaturering ved 95°C i 5 minutter; 40 cyklusser ved 95˚C i 15 sekunder; og forlængelse ved 60˚C i 20 sek. De genspecifikke primersekvenser er anført i tabel I. De relative ekspressionsniveauer af målgenerne blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCq-metoden (23) og normaliseret til GAPDH-ekspressionsniveauer.

Immunhistokemi (IHC). Nyrevævblev opsamlet fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion for at bestemme NLRP3- og Nrf2-ekspressionsniveauer. Kort,nyrevæv blev fikseret ved stuetemperatur i 48 timer i 10 procent formalin, indlejret i paraffin og skåret i 5 µm sektioner. Sektionerne blev efterfølgende blokeret med 5 procent mælk ved 37˚C i 30 minutter og inkuberet med anti-NLRP3 (1:100; kat.nr. ab214185; Abcam) eller anti-Nrf2 (1:200; kat.nr. ab137550; Abcam) primære antistoffer natten over. Efter inkubation af primær antistof blev sektionerne inkuberet med HRP-mærket sekundært anti-kanin antistof (1:200; kat.nr. ab214880; Abcam) ved 37˚C i 30 minutter, udviklet med diaminobenzidinopløsning til<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;=""  keyence="">

Nyrefunktionsanalyse. I alt 2-3 ml blod blev opsamlet efter centrifugering ved 3,000 xg i 10 minutter ved 4˚C fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion. Serumet blev opnået til analysenyrefunktionvia ELISA for at bestemme niveauer af kreatinin (kat.nr. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) og blodurinstofnitrogen (BUN; kat.nr. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), i henhold til producentens instruktioner.Nyreskademolekyle-1 (KIM-1) niveauer i serum blev målt ved ELISA (kat. nr. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) i henhold til producentens instruktioner.

Hæmatoxylin og eosin farvning.Nyrevævblev opsamlet fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion for at evaluerenyrehistopatologiske ændringer. Vævet blev fikseret ved stuetemperatur i 48 timer i 10 procent formalin og derefter indlejret i paraffin. Paraffin-indlejrede sektioner blev skåret i 5-µm tykke sektioner og farvet med 0,5 procent hæmatoxylin i 5 minutter og eosin i 3 minutter ved stuetemperatur (25˚C). Tilstedeværelsen af ​​blødning, tubulær cellenekrose, tubulær dilatation og cytoplasmatisk vakuoldannelse i vævet blev bedømt som følger: 0, normalnyre;1, minimal skade; 2, moderat skade; og 3, alvorlig skade (24).Nyreskadescore blev beregnet på en blind måde af to forskere under et lysmikroskop (forstørrelse, x200; Biorevo BZ-9000; Keyence Corporation).

ELISA-analyse af TNF‑, IL‑1 og IL‑6 niveauer. Blod blev opsamlet (1 ml) fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion. Serumet blev opnået ved centrifugering ved 3,000 xgi 10 minutter ved 4˚C. Serumniveauerne af TNF- (kat. nr. MTA00b), IL-1 (kat. nr. MLB00C) og IL-6 (kat. nr. M6000B) blev analyseret vha. kommercielle ELISA-sæt (R&D Systems, Inc.), i henhold til producentens protokol på en mikropladelæser (kat.nr. CA94089; Molecular Devices, LLC).

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYREINFEKTION

TUNEL farvning.Nyrevævblev opsamlet fra I/R-modelmus efter 24 timers reperfusion for at evaluere celleapoptose under anvendelse af TUNEL-farvning. Kort fortalt blev væv fikseret ved stuetemperatur i 48 timer i 10 procent formalin, indlejret i paraffin og skåret i 5-µm tykke sektioner. Sektioner blev inkuberet med TUNEL-reagens i et befugtet kammer ved 37˚C i 60 minutter i mørke (Roche Diagnostics) og farvet med DAPI i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev 10 højeffektmikroskopfelter tilfældigt udvalgt og observeret i hver sektion med et fluorescensmikroskop (forstørrelse, x10).Statistisk analyse. Data præsenteres som middelværdien ± SD af tre eksperimenter og blev analyseret med GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Statistiske forskelle mellem to grupper blev analyseret ved hjælp af en parret Students t-test. Statistiske forskelle mellem mere end tre grupper blev analyseret ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af post hoc Tukeys multiple sammenligningstest. Alle data var normalfordelt og havde samme varians. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a=""  statistically="" significant="">

Resultater

MCC950-behandling forhindrer efterfølgende I/R-induceret NLRP3-signalaktiveringnyreskadehos mus. NLRP3-inflammasomvejen aktiveres og spiller en afgørende rolle inyreskade(25,26). En tidligere undersøgelse rapporterede også, at NLRP3-signalering er aktiveret i nyrevæv fra mus 24 timer efter reperfusion (4). Derfor blev 24 timer efter reperfusion valgt som det nuværende vurderingstidspunkt. NLRP3-proteinekspressionsniveauer blev opreguleret af nyre-I/R-skade i I/R-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (Con) (fig. 1A og B). En lignende tendens blev observeret i NLRP3-mRNA-ekspressionsniveauer (fig. 1C). Desuden steg antallet af NLRP3-positive celler i I/R-gruppen sammenlignet med Con-gruppen, som bestemt ved IHC-farvning (fig. 1D og E).

For at bestemme den underliggende mekanisme for NLRP3-inflammasomaktivering og effekten på den nedstrøms signalvej efter nyre-I/R-skade blev mus behandlet med NLRP3-hæmmeren MCC950. Western blotting-resultater viste, at I/R opregulerede proteinekspressionsniveauer af NLRP3 og dets adapter ASC og fremmede modning fra pro-caspase-1 til caspase-1 og pro-IL-1 til IL-1 i I/R-gruppen sammenlignet med Con-gruppe (fig. 2A-E). Disse resultater indikerede, at renal I/R kan inducere aktivering af NLRP3-inflammasomvejen, og behandling med MCC950 kan nedregulere NLRP3, ASC, caspase-1 og IL-1 ekspressionsniveauer efter nyre I/R-skade.

Virkning af NLRP3-inflammasomet pånyreskadeinflammation og apoptose i nyre-I/R-modelmus. For at

bestemme effekten af ​​NLRP3 på nyreskade, blev I/R-modelmus behandlet med NLRP3-hæmmeren MCC950. Nyre-I/R-modelmus udviste signifikant øgede niveauer af BUN, serumkreatinin og KIM-1, som er en biomarkør for nyreskade (fig. 3A-C), hvilket indikerer vellykket induktion af nyre-I/R-skade. Histologisk undersøgelse af nyrevæv fra I/R-modelmus afslørede øget histologisk score, hvilket blev påvist ved alvorlig tubulær epitelhævelse, tubulær udvidelse og interstitielt ødem, vakuolar degeneration og tab af børstekanten, hvilket antydede, at renal I/R kan fremme signifikant nyrevævsskade og øget histologisk score (fig. 3D og E). Hæmning af NLRP3 ved MCC950-behandling reducerede signifikant I/R-inducerede stigninger i BUN-, kreatinin- og KIM-1-niveauer og nedsatte histologisk score, hvor nyrevæv udviste færre alvorligt beskadigede tubuli (fig. 3A-E).

Derudover blev niveauer af inflammatoriske faktorer og apoptotiske celler efter MCC950-administration analyseret i nyre-I/R-modelmus. Indikatorer for inflammation, herunder TNF-, IL-1 og IL-6, var signifikant opreguleret i I/R-gruppen sammenlignet med Con-gruppen (fig. 3F-H). Desuden, sammenlignet med Con-gruppen, var procentdelen af ​​apoptotiske celler signifikant øget 24 timer efter reperfusion i I/R-gruppen (fig. 3I og J). Sammenlignet med I/R-gruppen blev de sekretoriske niveauer af cytokiner, TNF‑, IL‑1 og IL‑6 og procentdelen af ​​apoptotiske celler reduceret ved MCC950-behandling i I/R plus MCC950-gruppen (fig. 3F‑J) ). Disse resultater indikerede, at inhibering af NLRP3-inflammasomet kan forhindre frigivelse af inflammatoriske faktorer og apoptose af nyrevæv induceret af I/R.

Nrf2 er afgørende for renal I/R-induceret regulering af NLRP3-inflammasomaktivitet.En tidligere undersøgelse afslørede, at Nrf2 er aktiveret og ekspressionsniveauer af Nrf2 målgener er opreguleret inyrevævefter nyre-I/R-skade (27). Lignende resultater blev opnået i denne undersøgelse. Nuklein-, totalprotein- og mRNA-ekspressionsniveauer af Nrf2 blev analyseret 24 timer efter nyre-I/R-skade. Resultaterne viste, at sammenlignet med Con-gruppen var nuklein-, totalprotein- og mRNA-ekspressionsniveauerne af Nrf2 opreguleret i I/R-gruppen (fig. 4A-D). Derudover fandt IHC-analyse, at ekspressionsniveauer af Nrf2 i nyrevæv blev øget, hvilket blev demonstreret af det øgede antal Nrf2-positive

celler observeret i I/R-gruppen (fig. 4E og F). Disse data antydede, at aktivering af Nrf2-signalvejen kan initiere et beskyttende respons hos nyre-I/R-modelmus. For at verificere effekten af ​​Nrf2 på NLRP3-inflammasomvejen i nyre-I/R blev Nrf2-KO-mus brugt i efterfølgende eksperimenter. Proteinekspressionsniveauer af Nrf2 og dets målgen, HO-1, blev signifikant nedreguleret efter renal I/R i KO-mus sammenlignet med vildtype-mus (fig. 5A-C). Omvendt, sammenlignet med I/R-vildtypegruppen, blev ekspressionsniveauerne af NLRP3 og dets adapter, ASC, caspase-1 og IL-1 opreguleret i I/R KO-gruppen (fig. 5A og D-G). Disse data indikerede, at nyre-I/R kan inducere aktivering af NLRP3-inflammasomet i Nrf2-KO-mus.

NaHS lindrer I/R-induceret opregulering af NLRP3-proteinekspressionsniveauer i vildtype-, men ikke i Nrf2-KO-mus. NaHS har vist sig at udøve effekter på Nrf2-ekspression og NLRP3-inflammasomaktivering i forskellige sygdomsmodeller (28-30). Den nuværende undersøgelse undersøgte, om effekten af ​​NaHS på aktivering af NLRP3-vejen sker via Nrf2-signalvejen ved at analysere ekspressionsniveaueraf Nrf2- og NLRP3-inflammasom-associerede proteiner i vildtype- og KO-mus.I vildtype mus, sammenlignet med Con-gruppen, blev ekspressionsniveauerne af Nrf2, NLRP3, caspase-1 og IL-1 opreguleret af nyre-I/R-skade. Derudover opregulerede NaHS-behandling Nrf2-ekspression yderligere og nedregulerede NLRP3-, caspase-1- og IL-1-ekspressionsniveauer i I/R plus NaHS-gruppen sammenlignet med I/R-gruppen (fig. 6A-E). I Nrf2-KO-mus blev der ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle i Nrf2-, NLRP3-, caspase-1- og IL-1-ekspressionsniveauer mellem I/R- og I/R plus NaHS-grupperne (fig. 6A-E). I I/R plus NaHS-gruppen var Nrf2-ekspressionsniveauer signifikant nedreguleret, hvorimod NLRP3-, caspase-1- og IL-1-ekspressionsniveauer var signifikant opreguleret i Nrf2-KO-mus sammenlignet med vildtype-mus. Disse resultater antydede, at NaHS kan reducere NLRP3-inflammasomaktivering via Nrf2-signalvejen ved nyre-I/R-skade

NaHS lindrer nyreskade, inflammation og apoptose via Nrf2-signalvejen i nyre-I/R-modelmus. NaHS spiller en vigtig rolle i nyreskade i AKI, I/R og andre sygdomsmodeller (31). NaHS lindrede renal I/R-induceret histopatologisk skade, som blev påvist ved nedsat tubulær epitelhævelse, tubulær dilatation og interstitielt ødem ognyrehistologiske scores i I/R plus NaHS-gruppen sammenlignet med I/R-gruppen i vildtypemus (fig. 7A og B). Indikatorer for nyrefunktion, herunder kreatinin, BUN og KIM‑1, blev også reduceret ved NaHS-behandling i I/R plus NaHS-gruppen sammenlignet med I/R-gruppen i vildtype

mus (fig. 7C-E). Hos Nrf2-KO-mus var NaHS imidlertid ikke i stand til at reducere stigningennyrehistologisk score og niveauer af nyrefunktionsindikatorer induceret af nyre-I/R. Desuden blev procentdelen af ​​apoptotiske celler og frigivelse af cytokiner, TNF-, IL-1 og IL-6, alle faldet efter NaHS-behandling i I/R plus NaHSgruppen sammenlignet med I/R-gruppen i vildtypemus (fig. 7F-J). Imidlertid var NaHS ikke i stand til at udøve en beskyttende virkning mod apoptose og overdreven frigivelse af inflammatoriske faktorer efter reperfusion af nyrevæv i I/R plus NaHS-gruppen af ​​Nrf2-KO-mus sammenlignet med I/R plus NaHS-vildtypemus (fig. 7F-J). Disse resultater antydede, at NaHS kan lindre nyreskade, inflammation og apoptose hos nyre-I/R-vildtypemus, men ikke hos Nrf2-KO-mus.

Diskussion

Inflammation er en nøglepatogen proces af AKI induceret af I/R (4). NLRP3-inflammasom- og Nrf2-signalvejen deltager i reguleringen af ​​inflammation inyreskade(32). Den nuværende undersøgelse fandt, at AKI induceret af I/R aktiverede NLRP3-inflammasomet, og dets adapter, ASC, fremmede modningen af ​​pro-caspase-1 og pro-IL-1 og accelererede den overdrevne frigivelse af cytokiner og apoptose, hvilket kulminerede i alvorlig nyre dysfunktion. Hæmning af NLRP3-inflammasomet ved MCC950-behandling forbedrede nyrefunktionen, inflammationsniveauer og apoptose i nyrevæv. Ud over at aktivere NLRP3 aktiverede renal I/R også Nrf2-signalvejen. Imidlertid førte fraværet af Nrf2 i Nrf2-KO-mus til yderligere opregulering af NLRP3-inflammasomet og dets adapter. NaHS-behandling viste sig at lindre NLRP3-inflammasomaktivitet via Nrf2-signalvejen. Desuden blev nyreskade, inflammation og apoptose reduceret ved NaHS-behandling via Nrf2-medieret hæmning af NLRP3-inflammasomaktivering.

Nyre I/R-skade er et vigtigt klinisk problem og primær årsag til AKI, som fører til en øget risiko for at udvikle kronisknyre sygdom(33). Inflammation er et vigtigt patologisk træk ved iskæmisk skade og opstår som en konsekvens af immuncelleaktivering via genkendelse af patogen- og skadesassocierede molekylære mønstre (34). Desuden blev det tidligere rapporteret, at NLRP3-inflammasomet spiller en rolle i en række afnyresygdommeved at regulere inflammation, pyroptose, apoptose og fibrose (35). NLRP3-inflammasomet er et proteinkompleks, der omfatter NLRP3, dets adapterprotein, ASC og caspase-1. Caspase-1 spalter pro-IL-1 og pro-IL-18 til modne, aktiverede sekretoriske former. Nyreskade induceret af forskellige patologier, herunder iskæmi (33), aktiverer inflammasomkomplekset, opregulerer NLRP3-ekspression og fremmer den efterfølgende modning af pro-IL-1 (36). NLRP3 KO ved hjælp af lille interfererende RNA i mus eller renale tubulære epitelceller udøver en beskyttende effekt mod nyrevævsskade induceret af iskæmi eller celleskade i fravær af glucose (37). De nuværende resultater indikerede, at nyre-I/R inducerede aktivering af NLRP3-inflammasomet, mens inhibering af NLRP3 ved hjælp af MCC950 signifikant nedregulerede NLRP3- og ASC-ekspressionsniveauer og modningen af ​​pro-caspase-1 og pro-IL-1 i renal I/R. skadesmodel. Derudover forbedrede NLRP3-hæmning af MCC950 nyreinsufficiens og reducerede histopatologiske skader og score, overdreven frigivelse af cytokiner og antallet af apoptotiske celler. Disse data antydede, at NLRP3-aktivering kan tjene en nøglerolle ved nyreskade, og hæmning af NLRP3 kan udøve en beskyttende effekt mod vævsskade og dysfunktion induceret af nyre-I/R.

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at Nrf2 deltager i det inflammatoriske respons (10-12). Derudover tjener Nrf2 en vigtig anti-inflammatorisk, antioxidativ eller anti-apoptotisk rolle i iskæmiske tilstande. Nrf2/antioxidant respons element signalvejsaktivering dæmper inflammation og apoptose i nyrevæv fra cyclophosphamid-inducerede mus (38). En anden undersøgelse viste, at Nrf2-aktivering af sulforaphane hæmmer NF‑κB signalvejsaktivitet og derved lindre inflammation i dystrofisk muskelvæv (39). Desuden fremmer nedbrydningen af ​​Nrf2 NLRP3-inflammasomaktivering og fører til IL-1-aktivering i en iskæmimodel (11). De nuværende data understøttede resultaterne af, at nyre-I/R kan inducere Nrf2-signalvejen og ekspression af dets nedstrøms målgener, såsom HO-1. Nrf2-KO-mus fremmede yderligere aktivering af NLRP3-inflammasomet, hvilket indikerede, at NLRP3, ASC, caspase-1 og IL-1 ekspressionsniveauer blev øget i den renale I/R-model. Disse resultater antydede, at Nrf2 udøvede en hæmmende effekt på NLRP3-inflammasomaktivering ved nyre-I/R-skade.

Tidligere forskning har rapporteret, atnyreproducerer H2S (40). Ydermere øger H2S renal blodgennemstrømning og fremmer clearance-funktionen afnyresom vist ved en forhøjet glomerulær filtrationshastighed (41). Desuden lindrer H2S ikke kun inflammation og oxidativt stress, men spiller også en afgørende rolle i reguleringen af ​​endoteldysfunktion og hypertension (28). H2S deltager i reguleringen af ​​nyre-associerede sygdomme, såsom I/R-skade og obstruktiv og diabetisk nefropati (42), men de underliggende mekanismer er stadig dårligt forståede. NHS er blevet brugt som en H2S-eksogen donor i forskning (43). I denne undersøgelse var leveringen af ​​H2S i form af NaHS. De nuværende resultater viste, at NaHS forbedrede vævsskade,nyredysfunktion, overdreven frigivelse af cytokiner og apoptose induceret af renal I/R. Det blev tidligere rapporteret, at NaHS forhindrer mikroglial aktivering og inflammation induceret af nerveskade via regulering af Nrf2-signalvejen (44). I overensstemmelse med hypotesen om, at NaHS regulerer inflammation via Nrf2-signalvejen, viste de nuværende resultater, at NaHS opregulerede Nrf2-ekspressionsniveauer og inhiberede ekspressionsniveauer af NLRP3 i nyre-I/R-modelmus. Endvidere afskaffede Nrf2 KO de regulatoriske virkninger af NaHS på Nrf2 og NLRP3-inflammasomet. Nærværende undersøgelse undersøgte også rollen af ​​Nrf2 på nyreskade og funktion efter NaHS-behandling; hæmning af Nrf2 vendte ikke kun delvist den beskyttende effekt af NaHS pånyreskadeog dysfunktion, men vendte også den hæmmende effekt af NaHS på det inflammatoriske respons og apoptose efter renal I/R. Disse resultater antydede, at Nrf2 kan være nødvendig for den beskyttende effekt af NaHS på AKI induceret af I/R, og NaHS kan udøve sin beskyttende rolle mod vævsskade via Nrf2-medieret NLPR3-inflammasomhæmning. Som konklusion aktiverede I/R-induceret nyreskade NLRP3-inflammasom- og Nrf2-signalvejen, og inhibering af NLRP3-inflammasomet beskyttede mod nyreskade. Nrf2 negativt reguleret NLRP3-inflammasomaktivering og NaHS lindretnyreskadeog dysfunktion, apoptose og det inflammatoriske respons via Nrf2-medieret NLRP3-inflammasomhæmning. Disse resultater giver ny indsigt i et potentielt fremtidigt mål for behandling af iskæmisk nyreskade.