Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Forbedring af phenylethanoidglycosider produktion af en svampeeicitor i cellesuspensionskultur af Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-guo Mei²

Søgeord Cistanche deserticola, svampe elicitor,phenylethanoid glycosid, plantecellekultur

Abstrakt
Hvornår, på den 15. vækstdag, en elicitor fraFusarium solaniblev tilsat ved 40 mg l^-1tilCistanche deserticolacellesuspensionskulturer, indholdet af echinacosid, acteosid og totalphenylethanoid glycosider(PeGs) i dyrkede celler steg alle i løbet af de næste 27 d med over 100% til 15 mg g^-1tør vægt, 9 mg g-1 tør vægt og 57 mg g^-1tør wt, henholdsvis. Den endelige biomasse (1,3 mg tør vægt ml^-1) ikke blev berørt.

Cistanche deserticola

Indførelsen

Cistanche deserticolaMa. (Orobanchaceae), en indfødt urt i Kina, anvendes i vid udstrækning i traditionel medicin til forskellige behandlinger, herunder anvendelse som beroligende eller immunresponsforstærker (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Phenylethanoid glycosider(Peg'er) er de vigtigste bioaktive metabolitter iCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) og består af mange komponenter såsom echinacosid, acteosid, cisacteosid, isoacteosid, 2-acetylacteosid, cistanosid A og osmanthusid B (Wang et al. 2000). Med den stigende efterspørgsel efter disse produkter og det hurtige fald iCistanche deserticolaplanter, cellekultur ville være et attraktivt alternativt produktionsmiddel. Mange elicitorer (især svampeeicitorer) kan forbedre metabolitproduktionen i plantecellekultur (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) fandt ud af, at en svampeeicitor af Fusarium solani isoleret fra rodsystemer af beggeCistanche deserticolaog dens vært, Halaxylon ammodendron, kunne forbedre aminosyreindholdet i calli afCistanche deserticolaMen ændringerne af PeGs indhold i denne callus linje blev ikke nævnt i deres undersøgelse. I dette papir blev virkningerne af en elicitor fra F. solani på biosyntesen af samlede Peg'er og to vigtigste bioaktive Peg'er (echinacosid og acteosid) og på ændringerne i cellevækst undersøgt i suspensionskulturen afCistanche deserticola.

Materialer og metoder

Plantecellekulturer
Callus blev induceret fra skalaer afCistanche deserticolaog vedligeholdt på Gamborgs B5-medium (1968) suppleret med 0,5 mg indol-3-eddikesyre l^-1, 2 mg kinetin l^-1,og 1 g kaseinhydrolysat l^-1. PH blev justeret til 6 før sterilisering. Alle forsøg blev udført i 250 ml rystekolber, der hver indeholdt 100 ml medium på en roterende ryster (120 o / min og 25 ° C) under mørke. Inokulumet var ca. 100 g frisk vægt l^-1.

effektivt indhold af cistanche deserticola--phenylethanoid glycosid

Fremstilling af svampeeicitor

Adskillelse af svampestamme, Fusarium solani og fremstilling af svampeeicitor blev udført som tidligere beskrevet (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Forskellige mængder (kulhydratækvivalenter) af svampeeicitor blev tilsat til rystekolbekulturerne den 15. d (den samlede dyrkningsperiode var 42 d).

Biomasseakkumulering og levedygtighedsassay
Celler fra en rystekolbe blev vasket med destilleret vand og frysetørret til en konstant vægt. Den tørre vægt blev således bestemt. Cellelevedygtighed (procentdel af levedygtige celler i en cellepopulation) blev bestemt ved reduktionen af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (Towill & Mazur 1975).

phenylethanoid glycosidafcistanche deserticola

Bestemmelse af indholdet af echinacosid, acteosid og totalphenylethanoid glycosider(Peg'er)
Ekstraktion af Ping'er blev udført efter metoden Du & Liu (1993). FrysetørretCistanche deserticolaceller blev ekstraheret med 70% (v / v) ethanol. Ethanolfraktionen blev koncentreret, affedtet med vandmættet ethylacetat og derefter udvasket med vandmættet n-butanol. N-butanolfraktionen blev koncentreret, opløst i vand, indlæst i en makroporeharpikskolonne (AB-8, kemisk produkt fra Nankai University, Tianjin, Kina) og elueret med vand og methanol successivt. Methanolfraktion blev indsamlet, og det samlede PeGs-indhold blev bestemt ved anvendelse af echinacosid som standard ved 334 nm. Echinacosid og acteosid blev bestemt ved anvendelse af Nova Pak C18-søjlen (250 × 4,6 mm) i et HPLC-system (vand) med en UV-detektor (334 nm).

Resultater

Effekt af svampeelektor på biomasseakkumulering og total PeGs biosyntese Virkninger af svampeelektor på cellebiomasse og total PeGs-akkumulering afhang af den tilsatte dosis (kulhydratækvivalenter). Som vist i figur 1 var lavere doser af elicitor gunstige for den tørre vægt afCistanche deserticolaCeller. Toppen var med elicitoren ved 20 mg l^-1(giver 1,76 mg tør vægt ml^-1).
Den samlede PeGs-ophobning blev signifikant forbedret af svampeelukkeren på mellem 20 mg l^-1og 80 mg l^-1. Elicitor ved 40 mg l-1 opnåede det højeste udbytte (57 mg g^-1), hvilket var over det dobbelte af, hvad der blev opnået i ikke-elicitorkontrolkulturen. Det yderligere eksperiment anvendte svampeelukatoren ved 40 mg1^-1.

Fig. 1. Tørcellevægt og total PeGs-akkumulering i suspensionscellekultur afCistanche deserticolasom reaktion på forskellige doser svampeeicitor. En svampeeicitor blev tilsat til mediet den 15. d. Prøver blev taget efter yderligere 27 d. ▲, Endelig tørcellevægt; ◆, det samlede indhold af PeG. Værdier er midler til tredobbelte resultater, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelser.

Tidsforløb af cellevækst og PeGs biosyntese
Figur 2 viser tidsforløbet for cellelevedygtighed og PeGs (echinacosid og acteosid) biosyntese af suspensionsceller, efter at kulturer blev udsat for en 40 mg l^-1svampeeicitor den 15. d. I de efterfølgende 27 d af kultur, echinacosid og acteosid, de to vigtigste bioaktive Peg'er iCistanche deserticola, begge steg betydeligt. Den 39. d blev der opnået maksimale akkumuleringer begge og nåede 14,7 mg g^-1tør vægt og 8,9 mg g^-1tør wt, henholdsvis. En signifikant forskel i cellelevedygtighed mellem de elicitorbehandlede kulturer og kontrollen blev ikke observeret.

Fig. 2. Cellelevedygtighed og echinacosid- og acteosidbiosyntese i suspensionscellekultur afCistanche deserticolaefter behandling med 40 mg l^-1svampe elicitor. Svampeeicitor blev tilsat til mediet den 15. d.◆, Echinacosid-behandlet med elicitor; ◇, echinacosid-kontrol; ●, acteosidbehandlet med elicitor;○,

acteosid-kontrol; ▲, cellelevedygtighedsbehandlet med elicitor;△ , cellelevedygtighedskontrol. Værdier er midler til tredobbelte resultater, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelser.

Diskussion

Mange komponenter afledt af svampe (cellevægsfragmenter, polysaccharider, oligosaccharider, glycoproteiner osv.) er blevet anvendt som forskellige svampeeicitorer i sekundær metabolitproduktion med mange plantecellearter. I dette papir er homogenatet (hovedsageligt sammensat af polysaccharider) fra svampestammen Fusarium solani isoleret fra rodsystemer afCistanche deserticolaog Halaxylon ammodendron viste sig at være en effektiv elicitor til PeGs biosyntese i cellekulturen afCistanche deserticola. Anvendelsen af denne eicitor til at stimulere PeGs syntese i celler var ikke kun signifikant, men blev udstillet kort efter fremkaldelse. Denne konklusion var i uenige med nogle tidligere undersøgelser af plantecellekultur (Wang et al. 2001).

I den tidligere undersøgelse af Li et al. (1998), da en svampeeicitor fra F. solani blev tilsat til kulturmediet, callus induceret fra frøene afCistanche deserticolakunne forblive i live i den efterfølgende langsigtede subkultur, og iridoidernes produktion kunne forbedres. Det indikerede, at dyrkede celler kunne syntetisere sekundære metabolitter af sygdomsresistens, når de blev angrebet af mikroorganismer. Selvom iridoider ikke blev bestemt i vores eksperiment, har vi vist, at polysaccharider fra F. solani kunne anvendes som effektive svampeeicitorer i produktionen af PeGs medCistanche deserticolaCeller.

effektivt indhold af cistanche deserticola--phenylethanoid glycosid

Fra: ' Forbedring afphenylethanoid glycosiderproduktion af en svampeeicitor i cellesuspensionskultur afCistanche deserticola' af Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Bioteknologiske breve 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Trykt i Holland.

Referencer

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Undersøgelse af de stærke virkninger afCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (C.A. Mey) G. Beck. og Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. Kina J. Chin. Mater. Med. 26: 143-146.
Du NS, Liu JL (1993) Bestemmelse afphenylethanoid glycosideriCistanche deserticolaved makrovesikulær harpiksspektrofotometri. Udvikle. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Næringsstofkrav til suspensionskulturer af sojabønnerodceller. 50: 151-158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Undersøgelse af de kemiske bestanddele og farmakologiske virkninger afCistanche deserticolaMa. og Cistanche salsa (C.A. Mey) G. Beck. Hage. Tradit. Krydderurt. Narkotika 26: 143-146.

Li Sørensen, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Virkning af elicitor af Fusarium solani på aminosyreindholdet iCistanche deserticolaCallus. Kina J. Nordvest Pharm. 13: 247-248.
Towill LE, Mazur P (1975) Undersøgelser af reduktionen af 2,3,5-triphenyltrazoliumchlorid som et levedygtighedsassay for plantevævskulturer. Kan. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Forbedring af Taxol produktion og udskillelse i Taxus Chinensis cellekultur ved svampeudløsning og medium fornyelse. Appl. Mikrobiol. Bioteknol. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Analyse afphenylethanoid glycosidi uddraget af urter Cistanchis af LC/ESI- MS/MS. Acta Pharm. Sin. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Hæmning af nitrogenoxid af phenylethanoider i aktiverede makrofager. Eur. J. Pharm. 400: 137-144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Virkninger af salicylsyre på svampeeicitor-induceret membran-lipidperoxidation og Taxolproduktion i cellesuspensionskulturer af Taxus Chinensis. Proc. Biokemi. 37: 477–482.