Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Klik her for information om del I (Introduktion, materialer og metoder) i denne artikel.

Hvordan hæmmer kinesisk medicin, der tonificerer nyren, dopaminerge neuronapoptose?

Shaogang Lin,1 Shuifen Ye,2 Jinmu Huang,1 Yun Tian,3 Yihui Xu,2 Mengqi Wu,2 Jingxia Wang,2 Songying Wu,4 og Jing Cai, MD, Ph.D.2

MATERIALER OG METODER

Design

In vitro sammenlignende observation af serumfarmakologi.

Tid og indstilling

Eksperimenterne blev udført i Laboratory of Cytobiology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Kina fra 2010 til 2011.

Materialer

Dyr

I alt 60 Wistar hanrotter, 8 uger gamle, der vejede 200-220 g, blev købt fra SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, Kina (licensnr. SCXK (Hu) {{4} }). De blev anbragt i Laboratory Animal Center ved Fujian University of Traditional Chinese Medicine i Kina ved 20-22 grader med en luftfugtighed på 40-60 procent og belysning fra kl. 7:00 til kl. 19.00 Maden blev leveret af Laboratory Animal Center ved Fujian University of Traditional Chinese Medicine. Alle eksperimentelle procedurer var i overensstemmelse med de vejledende forslag til pleje og brug af forsøgsdyr, formuleret af det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi[33].

Cistanche til forbedring af nyrefunktionen

Narkotika

Herba Epimedii, luftdelen af ​​Epimedium sagittatum Maxim var fra Sichuan-provinsen, Kina; Semen Cuscutae, det tørre modne frø af Cuscuta Chinensis Lam., var fra Shandong-provinsen, Kina; og Herba Cistanches, det chylocaulous af skælblad af Cistanche deserticola YCMa, var fra Xinjiang Uygur Autonom Region. Alle lægemidler blev leveret af Fujian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian-provinsen, Kina. Herba Epimedii, Semen Cuscutae og Herba Cistanches, 97,2 g hver, blev nedsænket i en afkogsbeholder indeholdende 1 500 mL destilleret vand, hurtigt opvarmet, kogt, holdt ved 100 grad til tillade de aktive komponenter i lægemidlerne at opløses og kondensere til 540 ml. Den rå mængde lægemiddel i lægemiddelopløsningen var 0,180 g/ml. Opløsningen blev filtreret, anbragt i en flaske, forseglet, steriliseret og opbevaret ved 4 grader. Selegilin, 5 mg × 10 tabletter pr. sæt, blev købt fra Nanjing Sike Pharmaceutical Co., Ltd. (Jiangsu-provinsen, Kina). Selegilin, 21,6 mg, blev opløst i dobbeltdestilleret vand for at fremstille en 540 ml vandopløsning. Koncentrationen af ​​lægemiddelopløsningen var 0,04 mg/ml. Lægemiddelopløsningen blev anbragt i en flaske, forseglet, steriliseret og opbevaret ved 4 grader.

Metoder

Fremstilling af lægemiddelholdigt serum

Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches og selegilin-grupperne blev intragastrisk perfunderet med lægemiddelholdigt serum indeholdende 0.180 g/mL Herba Epimedii, Semen Cuscutae eller Herba Cistanches eller {{ 5}}.04 mg/ml selegilin, to gange dagligt, i en dosis på 0,1 ml/kg i 14 på hinanden følgende dage. Blindserumgruppen fik administreret et lige så stort volumen destilleret vand. Dyrene blev berøvet mad og vand i 12 timer efter den endelige administration. Rotterne blev bedøvet ved intraperitoneal injektion med 0,3 ml/100 g ketaminhydrochlorid. Blod blev høstet fra abdominal aorta og centrifugeret ved 1 000 r/min i 15 minutter. Supernatanten blev høstet, deaktiveret i et vandbad ved 56 grader i 30 minutter, filtreret gennem en 0,22 μm mikroporøs membran og opbevaret ved -20 grader.

Fremstilling af 50×Satos opløsning

En blanding af 60 mL DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 15 mg bovin insulin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 15 mg transferrin (Sigma), 145,8 mg natriumpyruvat (Biosharp, Korea), 12 mg putrescin (Solarbio, Beijing, Kina), 25 μL natriumselenit (1 mg/mL, 100 mg/100 mL H2O; Sigma) og 100 μL progesteron (0,315 mg /ml, 15,75 mg/50 ml; Biosharp) blev udsat for ultralyd i et isbad i 1,5 timer, filtreret gennem 0,22 μm filter, alikvoteret og opbevaret ved -20 grader.

Cistanche til behandling af nyrefunktion

Cellekultur

Celler blev podet i DMEM/F12 suppleret med 5 procent (v/v) føtalt bovint serum (Gibco), 1 procent (v/v) glutamin (Sigma), 2 procent (v/v) 50×Sato's opløsning og 2% (v/v) penicillin/streptomycin. Celler blev derefter inkuberet i 5 procent (v/v) CO2 og holdt ved mættet fugtighed ved 37 grader. Celler blev trypsinbehandlet med 0,25% (vægt/volumen) trypsin og passeret. Cellerne i den logaritmiske fase blev opsamlet til efterfølgende eksperimenter.

Virkning af H2O2 på væksten af ​​MES23.5-celler

Celler blev podet i 96-brønds kulturplader (5 × 105 celler/brønd), inkuberet med 50, 100, 150, 200, 300 og 400 μmol/L H2O2-kulturopløsning (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent Co., Ltd. ., Shanghai, Kina) efter 24 timer i 1, 3, 6, 9, 12, 24 timer, efterfulgt af MTT (Sigma) i 4 timer. Opløsningen i brøndene blev kasseret, og 150 μL dimethylsulfoxid (Sigma) blev tilsat. Kulturpladen blev rystet i 10 minutter, og absorbansen af ​​prøver ved 570 nm blev bestemt ved anvendelse af en automatisk mikropladelæser (EXL800; Biotek, Winooski, VT, USA). Frisk fremstillet DMEM/F12 kulturopløsning blev brugt som en negativ kontrol. To parallelle brønde blev sat på hvert tidspunkt. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer.

Indflydelse af lægemiddelholdigt serum i forskellige koncentrationer på væksten af ​​H2O2-behandlede MES23.5-celler

Celler blev podet og eksponeret for lægemiddelholdigt serum indeholdende 5, 10, 15, 20, 25 og 30 procent (v/v) Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches og selegilin eller blankt serum i 24 timer. Celler blev yderligere dyrket med dyrkningsopløsning indeholdende 100 μmol/L H2O2 i 3 timer, efterfulgt af MTT i 4 timer. Tre parallelle brønde blev sat i hver gruppe. Frisk fremstillet DMEM/F12 kulturopløsning blev brugt som en negativ kontrol. Celler dyrket i dyrkningsopløsning indeholdende 100 μmol/L H2O2 og blindserum tjente som modelgruppen, og celler dyrket i blindserum alene tjente som blindserumgruppen. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer. Den gennemsnitlige absorbansværdi for hver gruppe blev beregnet som overlevelsesraten for celler.

Flowcytometri for FasL-, Fas-, caspase--3- og Bcl-2-ekspression i MES23.5-celler

Celler blev podet og behandlet som før. Celler dyrket i 100 μmol/L H2O2 alene blev betragtet som modelgruppen. Det phycoerythrin-mærkede FasL-antistof og FasL-isotypekontrol (5 μL hver) blev tilsat i to rør (BD, San Jose, CA, USA), blandet jævnt med celler, opbevaret ved stuetemperatur i mørke i 15 minutter, centrifugeret kl. 1 000 r/min i 5 minutter efter tilsætning af 2 mL PBS. Supernatanten blev kasseret, og cellerne blev resuspenderet under anvendelse af 500 μL PBS. Bølgelængden af ​​laseranordningen til flowcytometri (Facscalibur; BD) var 488 nm. Ekspressionshastigheden af ​​FasL-positive celler blev analyseret og beregnet med Cell Quest-software (BD). Ekspressionshastigheden for Fas-, caspase-3- og Bcl-2-positive celler blev detekteret ved hjælp af samme metode.

ELISA for indholdet af nervevækstfaktor, hjerneafledt neurotrofisk faktor og glialcellelinjeafledt neurotrofisk faktor i celler

Celler blev podet og behandlet som beskrevet tidligere. Supernatanten blev høstet, og indhold af nervevækstfaktor, hjerneafledt neurotrofisk faktor og glialcellelinjeafledt neurotrofisk faktorindhold blev målt i overensstemmelse med producentens instruktioner (BD). Absorbansen blev målt ved 450 nm under anvendelse af en automatisk mikropladelæser (EXL800; Biotek, Winooski, VT, USA).

Statistisk analyse

Resultater blev udtrykt som middel ± SD. Data blev analyseret ved hjælp af SPSS 18.0-software (SPSS, Chicago, IL, USA). Envejs-variansanalyse blev udført efterfulgt af multiple sammenligningstest med mindst signifikant forskel. En værdi på P < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

Cistanche til nyrefunktion

Anerkendelser

Vi takker Chen B, Laboratory of Neurobiology, Capital Medical University, for elskværdigt at levere MES23.5dopaminergnerveceller.

Fodnoter

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af udviklingsfonden for Chen Keji Integrative Medicine, nr. CKJ2010025 og Key Foundation of Society Development i Fujian-provinsen, nr. 2013Y0059.

Interessekonflikter: Ingen erklæret.

Etisk godkendelse: Denne undersøgelse modtog tilladelse fra Animal Ethics Committee ved Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Kina.

(Anmeldt af Diwakarla S, Norman C, Cheng HY, Wang JM)

(Redigeret af Wang LM, Su LL, Li CH, Song LP, Liu WJ, Zhao M)

REFERENCER

[1] Zhang ZX, Roman GC, Hong Z, et al. Parkinsons sygdom i Kina: udbredelse i Beijing, Xian og Shanghai. Lancet. 2005;365(9459):595-597. [PubMed] [Google Scholar]

[2] He JC, Wang WW. Effekt af Tianma Gauteng Yin påapoptoseafdopaminergneuroner i modelrotter med Parkinsons sygdom. Zhongyi Zazhi. 2010;51(11):1024-1027. [Google Scholar]

[3] Perier C, Bové J, Vila M. Mitokondrier og programmeret celledød i Parkinsons sygdom:apoptoseog videre. Antioxid redox signal. 2012;16(9):883-895. [PubMed] [Google Scholar]

[4] Gallagher DA, Schapira AH. Etiopatogenese og behandling af Parkinsons sygdom. Curr Top Med Chem. 2009;9(10):860–868. [PubMed] [Google Scholar]

[5] Rangasamy SB, Soderstrom K, Bakay RA, et al. Neurotrofisk faktor terapi for Parkinsons sygdom. Prog Brain Res. 2010;184:237-264. [PubMed] [Google Scholar]

[6] Zuccato C, Cattaneo E. Hjerneafledt neurotrofisk faktor i neurodegenerative sygdomme. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311-322. [PubMed] [Google Scholar]

[7] Cai DF, Chen XQ, Gao Y. Effekt af buske yangban-opskrift på nigrostriatal funktion hos parkinsoniske modelrotter efter langvarig levodopabehandling. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002;22(1):43–46. [PubMed] [Google Scholar]

[8] Yang MH, Wang HM, Liu Y. Effekt af Bushen Huoxue Decoction på den forældreløse receptor og tyrosinhydroxylase i hjernen hos rotter med Parkinsons sygdom. Chin J Integr Med. 2011;17(1):43–47. [PubMed] [Google Scholar]

[9] Li SD, Liu Y, Yang MH. Effekter af buske Huo Xue yin på hjernens NF-kB og NO indhold i Parkinsons sygdom model mus. J Tradit Chin Med. 2012;32(1):67–70. [PubMed] [Google Scholar]

[10] Tian Y, Cai J, Chen XZ, et al. Beskyttende virkning af kinesisk næringnyreurter på neuroner af striatale neuroner i Parkinsons sygdom model mus. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31(3):440–443. [Google Scholar]

[11] Yu H, Li YH, Feng XL, et al. Identifikation og aktivitetsassay af tyrosinhydroxylasen i MES23.5-celler. Zhongguo Shengwu Huaxue yu Fenzi Shengwu Xuebao. 2004;20(1):95-100. [Google Scholar]

[12] Wang XR. Beijing: People's Medical Publishing House; 2007. Toksikologi Eksperimentelle metoder og teknologi. [Google Scholar]

[13] Lv SJ. Beijing: China Medical Science Press; 2010. Klinisk immunologisk test. [Google Scholar]

[14] Eriksen JL, Wszolek Z, Petrucelli L. Molecular pathogenesis of Parkinsons sygdom. Arch Neurol. 2005;62(3):353-357. [PubMed] [Google Scholar]

[15] Christen Y. Oxidativ stress og Alzheimers sygdom. Am J Clin Nutr. 2000;71(2):621S-629S. [PubMed] [Google Scholar]

[16] Blandini F, Armenteros MT, Fancellu R, et al. Neuroprotektiv effekt af rasagilin i en gnavermodel af Parkinsons sygdom. Exp Neurol. 2004;187(2):455-459. [PubMed] [Google Scholar]

[17] Zhang XN, Wang HH, Wang ZQ, et al. Beskyttende effekt af icariin påapoptoseaf primært dyrkede rotteneuroner induceret af Aâ25-35-peptid. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixue Ban. 2007;36(3):224-228. [PubMed] [Google Scholar]

[18] Wang LH, Bu PC, Bao YM. Neurobeskyttende virkning af Cuscuta Chinensis Lam-ekstrakter på de neuronal differentierede PC12-celler skader induceret af reaktive oxygenarter. Xibao Shengwu Xue Zazhi. 2005;27:69-72. [Google Scholar]

[19] Sun SL, Wang B, Peng HS. Hæmning af Dodder-ekstrakter til hjertemyocytapoptosehos aldrende mus. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31:642-644. [Google Scholar]

[20] Yang JH, Hu JP, Rena K, et al. Struktur-aktivitet forhold af phenylethanoid glycosider i planter af Cistanche salsa på antioxidativ aktivitet. Zhong Yao Cai. 2009;32(7):1067-1069. [PubMed] [Google Scholar]

[21] Wu Y, Li L, Wen T, et al. Beskyttende virkninger af echinacosid på kultetrachlorid-induceret hepatotoksicitet hos rotter. Toksikologi. 2007;232(1-2):50-56. [PubMed] [Google Scholar]

[22] Cheng SD. Beijing: People's Medical Publishing House; 2006. Parkinsons sygdom. [Google Scholar]

[23] Yang T. Beijing: People's Medical Publishing House; 2010. Cellebiologi. [Google Scholar]

[24] Baba N, Koji T, Itoh M, et al. Gensidige ændringer i ekspressionen af ​​Bcl-2 og Bax i den hypoglossale kerne efter aksotomi hos voksne rotter: mulig involvering i induktionen af ​​neuronal celledød. Brain Res. 1999;827(1-2):122-129. [PubMed] [Google Scholar]

[25] Zuccato C, Cattaneo E. Hjerneafledt neurotrofisk faktor i neurodegenerative sygdomme. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311-322. [PubMed] [Google Scholar]

[26] Peterziel H, Unsicker K, Krieglstein K. TGFbeta inducerer GDNF-respons i neuroner ved rekruttering af GFRalpha1 til plasmamembranen. J Cell Biol. 2002;159(1):157-167. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Google Scholar]

[27] Hong M, Mukhida K, Mendez I. GDNF-terapi for Parkinsons sygdom. Ekspert Rev Neurother. 2008;8(7):1125-1139. [PubMed] [Google Scholar]

[28] Chaturvedi RK, Shukla S, Seth K, et al. Nervevækstfaktor øger overlevelse afdopaminerggraft, redder nigrale dopaminerge neuroner og genopretter funktionelle mangler i en rottemodel af Parkinsons sygdom. Neurosci Lett. 2006;398(1-2):44-49. [PubMed] [Google Scholar]

[29] Kavanagh ET, Loughlin JP, Herbert KR, et al. Funktionalitet af NGF-beskyttede PC12-celler efter eksponering for 6-hydroxydopamin. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):890-895. [PubMed] [Google Scholar]

[30] Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Hjerneafledt neurotrofisk faktor er påkrævet for etablering af det korrekte antaldopaminergneuroner i substantia nigra pars compacta. J Neurosci. 2005;25(26):6251-6259. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Google Scholar]

[31] Hung SY, Liou HC, Fu WM. Mekanismen for hæmoxygenase-1-virkning er involveret i forstærkningen af ​​neurotrofisk faktorekspression. Neurofarmakologi. 2010;58(2):321-329. [PubMed] [Google Scholar]

[32] Duarte EP, Curcio M, Canzoniero LM, et al. Neurobeskyttelse af GDNF i den iskæmiske hjerne. Vækstfaktorer. 2012;30(4):242-257. [PubMed] [Google Scholar]

[33] Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Folkerepublikken Kina. Vejledende forslag til pleje og brug af forsøgsdyr. 2006 30. september; [Google Scholar]