Årsagen til kronisk nyresygdom (CKD) - Anæmi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

DEL Ⅰ: Proteinurisk kronisk nyresygdom er forbundet med ændret levetid for røde blodlegemer, deformerbarhed og metabolisme

Rosi Bissinger, Travis Nemkov & et al.

Udviklingen afanæmier en typisk komplikation af fremskredenkronisk nyresygdom(CKD) og er forbundet med nedsat livskvalitet¹og øget risiko for kardiovaskulære hændelser²og indlæggelse,³samt kognitiv tilbagegang.⁴Sværhedsgraden afanæmier blevet betragtet som en uafhængig prædiktor for dødelighed ved både dialyse- og ikke-dialyseafhængig CKD (kronisk nyresygdom) patienter.⁵Patofysiologien af ​​nyresygdomsassocieretanæmier kompleks og involverer jern- og erytropoietin-mangel (EPO) i forbindelse med lavgradig inflammation, som igen kompromitterer normal erytropoiesis ved kronisk nyresygdom (kronisk nyresygdom) patienter.⁶I avanceret CKD (kronisk nyresygdom), er EPO-responsen utilstrækkelig lav i forhold til graden afanæmi.^7,8 Den høje forekomst af samtidig jernmangel ved CKD (kronisk nyresygdom) er en konsekvens af forstyrret jernhomeostase.⁹ En forsømt mekanisme for jerntab ved CKD (kronisk nyresygdom) er proteinuri, som kan føre til tab af transferrinbundet jern i urinen (op til 0,3 mg/d), når proteinuri når det nefrotiske område.¹⁰Endnu en faktor, der menes at bidrage tilanæmii CKD (kronisk nyresygdom) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >60 år siden.^6,11,12

Fordel ved Cistanche: behandling af nyresygdom og forbedring af nyrefunktionen

En nylig undersøgelse med en kulilteudåndingstest viste, at RBC-levetiden gradvist faldt fra 120 dage hos patienter med stadium 1 CKD (kronisk nyresygdom) til 60 dage hos patienter med stadium 5 CKD (kronisk nyresygdom).¹³ Især transfusion af allogene røde blodlegemer fra raske donorer til CKD (kronisk nyresygdom) patienter blev fulgt af hurtig clearance af transfunderede røde blodlegemer uden tegn på hæmolyse.¹²En plausibel mekanisme for denne observation kan være stimulering af apoptose-lignende celledød i anukleære RBC'er, hvilket angiver et skadesmønster, hvor cellemembranintegriteten ikke kompromitteres, og det cytoplasmatiske indhold forbliver intakt.¹⁴RBC'er, der gennemgår celledød, udviser forskellige morfologiske ændringer som følge af cytoskeletbeskadigelse, såsom dannelse af overfladebleb, tab af membranelasticitet og/eller cellulær dehydrering.¹⁵På et molekylært niveau er RBC-død forbundet med intracellulær Ca2þ-akkumulering, ændret cellulær energistatus og nedbrydning af phospholipid-asymmetri, hvilket i sidste ende fører til eksternalisering af phosphatidylserin (PS) på den ydre plasmamembran.^15,16Som følge heraf genkender makrofager og specialiserede dendritiske celler hurtigt PS-eksternaliserede RBC'er, hvilket fører til erythrosefagocytose og deres katabolisme i milten og leveren.¹⁷På grund af den forvirrende patofysiologi afnyre sygdom-tilknyttetanæmihos mennesker er dyreforsøg berettiget til at udpege de medvirkende mekanismer. Doxorubicin-induceret nefropati (DIN) i 129S1/SvImJ mus¹⁸og mus med inducerbar podocin-mangel (Nphs2Dipod)¹⁹er 2 modeller, der er karakteriseret ved induktion af nefrotisk proteinuri inden for få dage, progression til nyresvigt efter 3 uger og død efter 6 til 7 uger.^19–21Begge musemodeller rekapitulerer effektivt alle stadier af human CKD (kronisk nyresygdom). I den nuværende undersøgelse testede vi, om progressiv nyresvigt hos disse mus med proteinuricnyre sygdompåvirker RBC levetid og bidrager tilanæmi. Sideløbende undersøgte vi RBC-fænotypen i blod udtaget fra CKD (kronisk nyresygdom) patienter med nefrotisk proteinuri.

CKD (kronisk nyresygdom) oganæmi: CISTANCHE

METODER

Detaljerede oplysninger om materialerne og metoderne findes i de supplerende materialer og metoder.

Musestudier

Eksperimenter blev udført på 8-ugegamle vildtype 129S1/SvImJ mus af begge køn (Charles River). DIN blev induceret ved en enkelt injektion af doxorubicin (14,5 mg/g legemsvægt), som beskrevet tidligere.^18,22For at kontrollere den myelotoksiske virkning af doxorubicin, der ikke er relateret til udviklingen af ​​nefropati, blev doxorubicin-resistente C57BL/6-mus også underkastet den samme behandlingsprotokol.²³ Derudover blev lignende eksperimenter udført på 8-ugegamle mus med inducerbar deletion af podocin (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) eller Nphs2Dipod-mus, som blev behandlet med doxycyclin i 14 dage.¹⁹Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og den tyske lov om dyrevelfærd, med godkendelse fra de lokale myndigheder (Regierungspräsidium Tübingen, godkendelsesnummer M12/17 og M17/19G ). Det eksperimentelle design af museundersøgelserne er skitseret i supplerende figur S1.

Patienter

Patientundersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og blev godkendt af den lokale etiske komité på universitetshospitalet Tübingen (556/2018BO2). Lithium-heparin blod- og urinprøver blev taget fra patienter med nefrotisk proteinuri og bevaret glomerulær filtrationshastighed (GFR; trin 1-2; n ¼ 10) og patienter med reduceret GFR (CKD (CKD)kronisk nyresygdom) trin 3-5; n ¼ 15) på Universitetshospitalet Tübingen. Som kontrolgruppe blev blod fra alders- og kønsmatchede raske frivillige (n ¼ 25) leveret af blodbanken på universitetshospitalet Tübingen. Alle humane prøver blev indsamlet efter informeret samtykke. Patienternes kliniske karakteristika er angivet iTabel 1.

Tabel 1|Karakteristika for CKD-patienter (kronisk nyresygdom) og raske bloddonorer

Flowcytometri analyser

Forskellige parametre for RBC-celledød blev bestemt ved hjælp af andre cytometri.¹⁴ For at bestemme RBC's levetid in vivo blev 25 ml 5,6-carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester [5(6)-CFDA, SE] farvestof injiceret i en koncentration på 9,96 mM (opløseliggjort i dimethylsulfoxid) i retroorbitalen plexus af vildtype 129S1/SvImJ og doxorubicin-injicerede mus, som beskrevet tidligere.24 På de angivne tidspunkter blev blod udtaget fra retro-orbital plexus af mus, og procentdelen af ​​5(6)-CFDA, SEþ celler blev påvist ved hjælp af cytometrisk analyse. Til sidst blev data analyseret ved hjælp af FlowJo-software (FlowJo LLC).

RBC deformerbarhed og osmotisk gradient ektacytometri

RBC deformerbarhed blev målt ved hjælp af Laser-Assisted Optical Rotational Cell Analyzer (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), som er blevet beskrevet i detaljer andetsteds.²⁵Den osmotiske gradient ektacytometri (kosmos kan) analyser blev også udført ved hjælp af LORCA Max Sis og måler deformerbarhed under forskellige osmotiske forhold.²⁶

Histologisk undersøgelse

Til hæmatoxylin- og eosinfarvning blev milte og lårben farvet med hæmatoxylin og eosin. Alle objektglas blev farvet med det primære antistof Ter119 (BD Pharmingen; fortynding 1:500). Til perjodsyre-Schiff-farvning, 2,5-mm tykke skiver afnyrerblev farvet med periodic acid-Schiff-reagens (Carl Roth) og hæmatoxylin (Abcam). May-Grünwald-Giemsa-farvning (Pappenheim-metoden) blev udført for at bestemme RBC-formændringer, som beskrevet tidligere.²⁷ Glomeruli-isolering blev udført ved at bruge en biotinyleringstilgang og cellesortering.¹⁹Til proteinpåvisning af podocin blev et antistof fra Sigma påført (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; Carl Roth) blev brugt til at farve kerner.

Ultra-højtydende væskekromatografi-massespektrometri metabolomik fra mus RBC'er

Analyser blev udført som tidligere offentliggjort.²⁸Kort fortalt anvender den analytiske platform et Vanquish ultra-højtydende væskekromatografisystem (Thermo Fisher Scientific) koblet online til et Q Exactive massespektrometer (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche behandler nyresygdom forårsaget af anæmi

Statistiske analyser

Data leveres som aritmetiske gennemsnit af SEM eller som median med interkvartilområde (25.–75. percentil), hvor n repræsenterer henholdsvis antallet af brugte dyr eller inkluderede patienter. Data blev testet for normalitet med Kolmogorov-Smirnov-testen, D'Agostino-testen og Shapiro-Wilk-testen. Varianser blev analyseret ved Bartlett-test for lige store varianser. Tukey eller Dunn multipel-sammenligning eftertest, uparret Student t-test eller Mann-Whitney U test blev udført af GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0.05="" med="" 2--halet="" test="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="" signifikant.="" yderligere="" grafer="" blev="" plottet="" gennem="" graphpad="" prism="">

RESULTATER

Eksperimentel proteinurisk nyresygdom inducereranæmihos mus Efter induktion udviklede 129S1/SvImJ-mus med DIN- og Nphs2Dipod-mus nefrotisk proteinuri (Figur 1a og Supplerende Figur S2C) og progressiv nyresvigt karakteriseret ved høje plasma-urinstofniveauer fra dag 20 og fremefter (Figur 1b og Supplementær). I løbet af de første 10 dage oplevede mus vægtøgning med ascites (figur 1c og supplerende figur S2E), hvilket afspejler natriumretention forårsaget af udskillelse af serinproteaser eller proteinuri.¹⁸Efter spontan reversering af natriumretention tabte disse mus støt vægt. Hos mus med DIN og i Nphs2Dipod-mus afslørede lysmikroskopibilleder, taget efter 10 dage, typiske histomorfologiske ændringer i overensstemmelse med fokal segmentel glomerulær sklerose (figur 1d og supplerende figur S2B). Disse var fraværende i doxorubicin-injicerede C57BL/6-mus (figur 1d). Doxorubicin-behandling inducerede et stærkt fald i hæmoglobin, RBC-tal og hæmatokrit (figur 1e–g) fra dag 10 og frem i 129S1/SvImJ- og C57BL/6-mus, som hos sidstnævnte blev normaliseret på dag 20 og 30. I modsætning hertil dag 20 og 30 udviklede doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ og podocin-mangelfulde mus progressiveanæmi, kendetegnet ved reduceret gennemsnitlig korpuskulær volumen (figur 1h) og reduceret hæmoglobin (supplerende figur S2F), hvilket tyder på, atanæmier forbundet med progressiv nyresvigt og ikke med doxorubicin-behandling pr. se.

Figur 1|Nyrefunktion og åbenlys anæmi hos doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus.(a–d) Doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus udviklede (a) høj proteinuri, (b) progressiv stigning i plasmaurinstofkoncentration, (c) forbigående stigning i kropsvægt og (d) typiske histomorfologiske ændringer, der tyder på fokal segmental glomerulær sklerose på dag 10 (periodic acid–Schiff-farvning; bar ¼ 10 mm). (e–h) Derudover udviklede disse mus siganæmiafspejles af (e) et nedsat hæmoglobinniveau, (f) lavere antal røde blodlegemer (RBC), (g) formindskede hæmatokritniveauer og (h) nedsat gennemsnitlig korpuskulær volumen. (a–d) Doxorubicin-injicerede C57BL/6 mus viste ingen tegn på nyreskade, og (e–g)anæmipå dag 1 blev 0 normaliseret på dag 20 og 30. Aritmetiske middelværdier af SEM er vist. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Anæmi i eksperimentel proteinurisk nyresygdom er ikke forårsaget af kompromitteret erytropoiese

Begge anæmiske musemodeller viste en signifikant stigning i procentdelen af ​​cirkulerende retikulocytter (figur 2a og supplerende figur S3C). Plasma-EPO-koncentrationer blev dramatisk øget på dag 10 i 129S1/SvImJ med DIN og raske C57BL/6-mus, men blev normaliseret igen på dag 20 og 30 (figur 2b). Hos podocin-mangelfulde mus steg plasma-EPO-koncentrationerne på dag 10 og forblev øget på dag 20 og 30 (Supplerende figur S2H). I histologiske analyser fra knoglemarv og milt blev antallet af erythroide precursorceller sammenlignet med myeloide precursorer øget på dag 30 (figur 2d-g), hvilket peger på stimuleret erytropoiese i anæmiske 129S1/SvImJ mus med DIN.

Figur 2|Erytropoiese stimuleres i doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus med anæmi. (a) Anæmii doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus forekom på trods af øget retikulocyttal på dag 2{{30}} og 30. (b) Plasma-erythropoietinkoncentrationen var stærkt øget på dag 10 i doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ- og C57BL/6-mus, men blev normaliseret igen på dag 20 og 30. (c–e) Kvantificering af det absolutte antal af (c) myeloide og (d) erythroide celler i knoglemarven. (e) forholdet mellem myeloid-til-erythroide celler i raske og doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus i knoglemarv viste et højere antal erythroide-precursorceller i doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus på dag 3{{5{52 }}}}. (f, g) (f) milt- og (g) knoglemarvshistologien viste en stigning i erythroide precursorceller, observeret selv ved lavere forstørrelser, i doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus (højre paneler) sammenlignet med raske mus (venstre paneler) ) på dag 30. (f,g) Ter119 immunhistokemi (nedre paneler) understøttede hæmatoxylin og eosin (H&E) fundene. Ter119 er positiv i de erythroide precursorer (kerneholdige celler) og i de røde blodlegemer (ikke-kerneholdige celler). Bar ¼ 100 mm; indsatser ¼ 25 mm. Aritmetiske betyder SEM er vist. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" og="" ***p="">< 0,001="" indikerer="" signifikant="" forskel="" mellem="" raske="" 129s1/svimj-mus="" og="" doxorubicin-injicerede="" 129s1/svimj-mus;="" ##p="">< 0,01="" og="" ####p="">< 0,0001="" indikerer="" signifikant="" forskel="" til="" baseline="" for="" doxorubicin-injicerede="" 129s1/svimj-mus;="" og="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" og="" §§§§p="">< 0,0001="" indikerer="" signifikant="" forskel="" mellem="" doxorubicin-injicerede="" 129s1/svimj="" og="" doxorubicin-injicerede="">

Fordel vedCistanche: behandling af nyresygdom og forbedring af nyrefunktionen

Nedsat RBC-levetid er den primære årsag til anæmi ved eksperimentel proteinurisk nyresygdom

Eksternalisering af PS på den ydre folder af RBC-plasmamembranen er en indikator for celledød og en promotor for erythrofagocytose.¹⁴RBC-celledød blev kvantificeret ved hjælp af fluorescensaktiverede cellesorteringsanalyser af fluorescerende annexin V-bundet overflade PS.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}fold højere på dag 20 hos mus med DIN (4,16 procent & 0.86 procent) sammenlignet med raske mus (1.{{7 }} procent og 0.11 procent ) (Figur 3a). Tilsvarende viste Nphs2Dipod-mus en omtrentlig 2-fold stigning i PS-eksponering (1,27 procent & 0.20 procent) sammenlignet med raske mus (0,58 procent & 0,05 procent) på dag 30 (Supplerende figur S3A). Det er kendt, at røde blodlegemer elimineres fra kredsløbet af makrofager, der befinder sig i milten.17 Denne observation kan derfor forklare det højere milt/kropsvægt-forhold for Nphs2Dipod-mus (Supplerende figur S2G), hvor dobbelt så mange røde blodlegemer nedbrydes sammenlignet med raske C57BL/6 mus. Da nefrotisk proteinuri fører til dysproteinæmi,29 undersøgte vi yderligere, om øget RBC-celledød kan stimuleres af en komponent i plasmaet hos mus med DIN. Som afbildet i figur 3b var PS-eksponering på dag 10 og 20 dobbelt så høj efter inkubation (30 minutter ved 37.^OC) af sunde røde blodlegemer i plasma fra doxorubicin-injicerede 129S1/SvImJ-mus sammenlignet med inkubation i plasma fra raske mus. Ca2þ-tilstrømning til RBC'er, medieret af spændingsstyrede og spændingsuafhængige ikke-selektive kationkanaler,^30,31er en af ​​nøgleregulatorerne for RBC-celledød. I RBC'er indsamlet på dag 20 og 30 fra 129S1/SvImJ-mus med DIN blev intracellulære Ca2þ-koncentrationer øget (figur 3c); dette fænomen blev rekapituleret i Nphs2Dipod-mus på dag 20 (Supplerende figur S3B). I begge musemodeller var der en signifikant negativ sammenhæng mellem procentdelen af ​​PS-positive røde blodlegemer, med sværhedsgraden afanæmiafspejles af hæmoglobinniveauer (figur 3d og supplerende figur S3D). Desuden var der en signifikant korrelation med nyreskade afspejlet af plasmaurinstofkoncentration (Figur 3e og Supplerende Figur S3E) og i mindre grad med proteinuri (Figur 3f og Supplerende Figur S3F). For at kompensere for RBC-tab ianæmi, blev dannelsen af ​​nye røde blodlegemer stimuleret i begge mus, som angivet ved øget procentdel af cirkulerende retikulocytter, og var signifikant korreleret med størrelsen af ​​PS-eksponerende røde blodlegemer (figur 3g og supplerende figur S3G).

Figur 3|Mus med doxorubicin-induceret nefropati udvikler øget død af røde blodlegemer (RBC) medieret af øgede intracellulære calciumniveauer.(a) Eksternalisering af phosphatidylserin (PS), hvilket afspejler RBC-død, blev forstærket på dag 20 og 30 efter induktion af doxorubicin-induceret nefropati. (b) Inkubation af sunde RBC'er i plasma taget på dag 10 og 20 fra disse mus førte til eksternalisering af PS. (c) PS eksternalisering blev ledsaget af øgede intracellulære calciumniveauer af røde blodlegemer taget på dag 20 og 3{{30}} efter induktion. (d–g) (d) procentdelen af ​​PS-eksponerende røde blodlegemer var korreleret med hæmoglobinniveauer, nyreskade angivet ved (e) plasmaurinstofkoncentration og (f) proteinuri, samt med (g) retikulocytdannelse. (d–g) Data inkluderer hvert tidspunkt (0, 10, 20 og 30 dage) for hver sund 129S1/SvImJ og 129S1/SvImJ mus med doxorubicin-induceret nefropati. Aritmetiske betyder SEM er vist. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001="" og="" ****p="">< 0,0001="" indikerer="" signifikant="" forskel="" mellem="" raske="" 129s1/svimj="" og="" doxorubicin-injicerede="" (in.)="" 129s1/svimj-mus;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" og="" ####p="">< 0,0001="" indikerer="" signifikant="" forskel="" til="" baseline="" for="" doxorubicin-injicerede="" 129s1/svimj-mus;="" og="" §§§§p="">< 0,0001="" indikerer="" signifikant="" forskel="" mellem="" doxorubicin-injicerede="" 129s1/svimj="" og="" doxorubicin-injicerede="" c57bl/6-mus.="" crea,="" kreatinin;="" mfi,="" middel="">

Fordel vedCistanche: behandling af nyresygdom og forbedring af nyrefunktionen

KLIK HER FOR AT DEL Ⅱ