Højt saltindtag og dets virkninger på det naturlige tarmmikrobiom hos vilde mus

1. Introduktion

Pattedyrs tarm er koloniseret af et komplekst og mangfoldigt bakteriesamfund, som sammen med værten skaber et delikat symbiotisk forhold [1,2]. Dette bakteriesamfund udøver mange funktioner, der er nyttige for værten, herunder metaboliske, immunmodulerende og trofiske funktioner [3-7], og tarmmikrobiotaens sammensætning kan ændre sig i løbet af livet, i overensstemmelse med værtens specifikke behov og fysiologi [1,8, 9]. Mange gavnlige funktioner af tarmsundhedsfremmende bakterier medieres af anaerobe fermenteringsafledte metabolitter [10-13], og dysbiotiske tilstande kan signifikant påvirke værtens sundhed [2,11,14,15]. Den voksende bekymring for livsstilens indvirkning på sundheden har ført til en øget videnskabelig interesse for tarmmikrobiota-involvering og dens translationelle implikationer [16,17]. Faktisk er tarmmikrobiotaen formet af både ydre (f.eks. livsstil, kost og medicinske behandlinger) og iboende (f.eks. værtsgenetik, immun- og metaboliske reguleringer) faktorer [8,18-20]. Det er almindeligt anerkendt, at ydre elementer kan fremkalde virkningsfulde virkninger, med kosten som en af ​​de vigtigste medvirkende faktorer til at påvirke tarmmikrobiotaens sammensætning og funktion [1,2,21]. Vestlige kostkomponenter, såsom højt saltindtag, er kendt for at skade værtshomeostase ved at påvirke immunsystemet og ændre tarmmikrobiotaen og sygdommen [18,22-37]. I murin tarmmikrobiota er en kost med højt saltindhold (HSD) forbundet med reduktionen af ​​sundhedsfremmende bakterier, der er notorisk kendt som producenter af kortkædede fedtsyrer (SCFA) såsom Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia og Faecalibaculum [28, 29,38-41], sideløbende med en stigning i mængden af ​​Akkermansia, en anden opportunistisk SCFA-producent, der har vist sig at påvirke værtsimmunitet og sygdom i forskellige modelsystemer [42,43]. Murine dyremodeller bruges ofte til at studere, hvordan kostfaktorer kan forme tarmmikrobiotaen, immunsystemet og sygdommen [29,44-46]. Selvom brugen af ​​konventionelle laboratoriemus (CLM) stadig er en gyldig mulighed for mange undersøgelser, mislykkes det nogle gange med korrekt at oversætte tarmmikrobiota-fokuserede applikationer [47-49]. For eksempel blev immunologisk og metabolomisk forskning i murine modeller af inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og fedme vist sig dårligt at forudsige translationelle resultater af tarmmikrobiotaundersøgelser [50]. Dette kan skyldes mange iboende forskelle i disse modelsystemer, såsom forskellig tarmens anatomi, genetik og fysiologi [16,50]. Et andet problem ved at bruge CLM til at studere mikrobiota-immune interaktioner er dog domesticeringen af ​​tarmbakteriesammensætningen i CLM, hvilket afspejles i reduktionen af ​​kompleksiteten og modstandsdygtigheden af ​​CLM-tarmmikrobiotaen sammenlignet med vilde mus [51]. Behovet for desinficerede og kontrollerede miljøer står over for en reduceret tilstedeværelse af potentielle patogener og parasitter, hvilket menes at føre til et mindre "uddannet" immunsystem i CLM sammenlignet med vilde mus [51-53]. For at løse dette problem blev den vilde musemodel udviklet ved C57BL/6-mus-afledt embryooverførsel til vilde mus for at opnå en vild-afledt tarmmikrobiota for at overvinde translationsproblemet med immunologiske tarmmikrobiotaundersøgelser [54]. Nylige undersøgelser, der involverede denne musemodel, viste overlegne resultater i at forudsige den translationelle værdi af eksperimentelle immunterapier sammenlignet med CLM [54,55]. Desuden var mikrobiotaen fra vildtlevende tarm mere resistent og modstandsdygtig over for antibiotikabehandling og fedtrig kost sammenlignet med CLM, sammenlignelig med den mere komplekse situation hos mennesker [54,55]. På trods af de etablerede virkninger af HSD på tarmmikrobiota, immunsystemet og forskellige sygdomsmodeller i CLM, er virkningerne af højt saltindtag på naturlig, vildt afledt tarmmikrobiota ukendt. I denne undersøgelse evaluerede vi effekten af ​​HSD på forskellige tarmbakterie-økosystemsammensætninger og prædiktive funktioner af CLM sammenlignet med vilde mus.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr og kost

Vildtype C57BL/6 mus (7-8 uger gamle hunner, n=20) blev købt fra Charles River og anbragt i dyrefaciliteten ved University of Hasselt under standardiserede forhold. Vilde mus (C57BL/6 genetisk baggrund, hanner n=12 og hunner n=11) [54] blev anbragt i dyrefaciliteten i UHasselt under standardiserede forhold. Dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg (ECAE) ved Hasselt Universitet (ID201618A4V1, ID202235). Mus blev anbragt (4 mus/bur) i et temperaturkontrolleret rum (21-23 ◦C) med en 12:12 timers lys/mørke lyscyklus. Følgende oprensede diæter blev købt fra Ssniff (Soest, Tyskland): 0,5% NaCl/kontroldiæt (E15430-04) og 4% NaCl/HSD (E15431-34). Til HSD blev dyr fodret med 1 % NaCl i drikkevandet ud over E15431-34, som beskrevet i [28]. CLM-mus var ligeligt fordelt mellem kontrolgruppen (n=10) og HSD (n=10). For de vilde mus var han- og hunindivider også ligeligt fordelt i kontrol- og HSD-diætgrupper (6 hanner for kontrol, 6 hanner for HSD, 5 hunner for kontrol og 6 hunner for HSD).

cistanche planteforøgende immunsystem

2.2. DNA-ekstraktion

Mikrobiel DNA-ekstraktion blev udført som beskrevet i [28] ved at bruge en modificeret protokol for QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Kort fortalt blev fækale pellets tilsat til en 2-mL Eppendorf indeholdende 0,5 mm glasperler og 1,5 ml lysisbuffer (ASL) (Qiagen, Hilden, Tyskland). Perleslåning blev anvendt til at udføre mekanisk homogenisering af pellets. Fuld ekstraktion blev udført i henhold til producentens protokol med mindre modifikationer (forlængelse af proteinase K-inkubationstiden til 2 timer ved 70 ◦C). DNA-koncentrationer blev evalueret ved hjælp af et NanoDrop ND-1000-spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) og opbevaret ved -20 ◦C før 16S rRNA-genamplifikation.

2.3. 16S rRNA genamplifikation og sekventering

16S rRNA gensekvens blev amplificeret ved at bruge en primer specifik for V4 regionen (F515/R806), som tidligere beskrevet [56]. Kort fortalt blev der brugt 25 ng DNA pr. PCR-reaktion (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) med initial denaturering i 30 s ved 98 ◦C, efterfulgt af 25 cyklusser (10 s ved 98 ◦ C, 20 s ved 55 ◦C og 20 s ved 72 ◦C). Reaktioner blev udført i tre eksemplarer, samlet pr. prøve og oprenset med et magnetisk perlebaseret oprydningssystem (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Biblioteksforberedelse blev udført ved en begrænset cyklus PCR for at opnå det indekserede bibliotek ved hjælp af Nextera-teknologi (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA), efterfulgt af et andet AMPure XP-magnetiske perler-oprydningstrin. Indekserede prøver blev derefter normaliseret til den samme koncentration på 4nM, poolet og sekventeret på en Illumina MiSeq platform PE300 med en 2 × 300 bp parret ende protokol i henhold til firmaets protokol (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Behandling og statistisk analyse af 16S rRNA-gensekvenseringsdata

Rå sekvenser blev behandlet ved hjælp af en QIIME 2 [57] pipeline. Efter længde- og kvalitetsfiltrering (standardparametre) blev læsninger filtreret og tildelt til operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) ved hjælp af DADA2 [58]. Taksonomisk tildeling blev udført af VSEARCH-algoritmen (https://github.com/torognes/vsearch; tilgået den 9. november 2022) og Silva-databasen v128 (https://www.arb-silva.de /; tilgået den 9. november {{40}}22). ASV-tabellen blev derefter normaliseret ved sjældenhed ved 6.147 dybde, således at hver prøve nåede plateauet ved slutningen af ​​sjældenhedskurven. Alfa-diversitet blev vurderet ved hjælp af to forskellige metrikker: OTUs rigdom (Observed), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson) økologiske indekser. For beta-diversitet blev Bray-Curtis-forskellighed, Jaccard-lighed og vægtede og uvægtede UniFrac-metrikker [59] beregnet og plottet af Principle Coordinates Analysis (PCoA) for at visualisere den reelle afstand mellem prøverne. For at normalisere OTU-tælletabellen blev sjældentgørelse udført i en dybde på 6305 sekvenser pr. prøve 100 gange. Outputtet opnået fra OTU-taksonomitildelingen, som en taksonomitabel, blev brugt til at kollapse den normaliserede OTU-tabel til tabeller for taksonominiveauerne L2 (Phylum), L5 (Familie) og L6 (Genus). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af R (https://www.R-project.org/; adgang den 25. november 2022; Version 4.2.0). R-pakken "vegansk" (Version 2.6-4) [60] blev brugt til at generere beta-diversitetsmetrikker for at sammenligne sammensætningsforskelle af grupper ved PCoA eller ved principal komponentanalyse (PCA). Pakker og dataadskillelse blev testet ved permutationstest med pseudo-F-forhold (funktion "Adonis" i "vegansk"). Adskillelse i form af beta-diversitet mellem grupper blev testet ved Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrics (PERMANOVA, funktion "Adonis" i "vegan"), mens forskelle for intra-gruppespredning blev testet ved Multivariate homogeneity of groups dispersions test (PERMDISP , funktion "betadisper" i "vegansk"). Taxa, der ikke var til stede i mindst 4 prøver, blev udelukket fra analysen. Forskelle med hensyn til taxa relative overflod blev først evalueret med den foreløbige Kruskal-Wallis test mellem 4 grupper og derefter yderligere evalueret med Wilcoxon testen mellem følgende sammenligningspar: CLM kontrol vs. CLM HSD, vildling kontrol vs. vildling HSD, CLM kontrol vs. wildling Control, CLM HSD vs. wildling HSD. Til evaluering af taksonomiske forskelle mellem wildling og CLM blev Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; adgang til den 25. november 2022) brugt til at skelne mellem hovedtrækkene på slægtsniveau [ 61]. LEfSe-resultater blev derefter vist som et søjlediagram med en Linear Discriminant Analysis (LDA) scoretærskel højere end 1,0. Når det var nødvendigt, blev p-værdier af flere sammenligninger justeret ved Benjamini-Hochberg-metoden. En falsk opdagelsesrate (FDR) Mindre end eller lig med 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant: * p Mindre end eller lig med 0,05; ** p Mindre end eller lig med 0,01; *** p Mindre end eller lig med 0,001. Funktionelle forskelle mellem mikrobiomer med forskelligt NaCl-indhold i maden (0,5 % og 4 % NaCl-fødevareindhold) blev analyseret af PICRUST2, en bioinformatiksoftwarepakke til at forudsige metagenomfunktionelt indhold fra 16s rDNA-gensekvenseringsdata (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/; åbnet den 29. november 2022; PICRUST2 2.4.1) [62]. PICRUST2-pipeline blev anvendt på repræsentative sekvenser og deres overflodstabel fra DADA2 ved at bruge standardparametre (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; tilgået den 29. november 2022). Ud fra den fulde pipeline-output blev metagenomisk forudsigelse for KEGG Orthology og MetaCyc-veje bygget som tabeller, med forudsigende funktioner som rækker og prøver som kolonner, og brugt til at sammenligne tarmmikrobiotafunktioner i wildling og CLM efter HSD-regime. Mikrobielle samfundsforudsigende funktioner, der bidrog mest til variationen mellem vilddyr og CLM efter første (PC1), anden (PC2) og tredje hovedkomponent (PC3), blev udvalgt til yderligere analyse af HSD-forbrug i de to modeller. Matrixen med de forudsigelige funktionsoverfloder blev derefter normaliseret, transformeret i Centered Log Ratio (CLR) værdier, og log2mean ratio beregnet (HSD/Control) for både wildling og CLM. Til sidst blev log2-middel-forholdene sammenlignet mellem grupper ved Wilcoxon-test og plottet som et kileskriftplot. Forskelle mellem grupper blev statistisk sammenlignet i R-software ved hjælp af Wilcoxon-test- og Kruskal-Wallis-testfunktioner og p-værdier justeret ved Holm- eller Benjamini-Hochberg-metoden.

3. Resultater

3.1. HSD påvirker mangfoldighed og sammensætning af CLM og Wildling Gut Microbiota

For at undersøge virkningen af ​​HSD på et vildt-afledt tarmmikrobielt økosystem i mus, fodrede vi HSD eller kontroldiæter til vilde mus og CLM. Mus blev holdt på diætregimer i to uger, og sammensætningen af ​​fækal tarmmikrobiota blev efterfølgende undersøgt ved 16S RNA-gensekventering fra fækale pellets indsamlet på dag 14 (figur 1A). I overensstemmelse med en tidligere rapport blev der ikke påvist nogen stærke forskelle med hensyn til kropsvægt mellem kontrol- og HSD-grupper af CLM og vilde mus [29]. For at vurdere den forskellige tarmmikrobiota mellem de to modeller CLM og vilde mus ved baseline estimerede vi alfa-diversitet (Observed eller Richness, Chao1, Shannon, Simpson og Inverse Simpson-indekser), beta-diversitet (Bray-Curtis-forskel) og de vigtigste taksonomiske forskelle. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [54] var vildtlevende tarmmikrobiota karakteriseret ved større mikrobiel rigdom (Figur 1B, alle alfa-diversitetsindekser) samt en distinkt og mere heterogen mikrobiel sammensætning end CLM (Figur 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, wildling vs. CLM og figur S1). Med hensyn til mikrobielle signaturer var CLM og tarmmikrobiota af vilde mus karakteriseret ved forskellige bakterielle taxa (figur S1). I overensstemmelse med Rosshart et al. [54], bakterielle taxa fra vildtlevende mus tilhører Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter og den patogene slægt Helicobacter, som karakteriserede den vild-afledte ikke-domesticerede profil af denne model (figur S1).

Figur 1. HSD-påvirkning på bakteriesammensætningen af ​​CLM (n=10/gruppe) og vilde mus (n=11 for vilde Ctrl og n=12 for vilde HSD). (A) Eksperimentelt design. C57BL/6 CLM eller vildtlevende mus blev fodret med 0,5% NaCl (kontrol, Ctrl) eller højt salt 4% NaCl (HSD) og tarmbakteriesamfunds tarm karakteriseret ved 16S rRNA gen amplikon sekventering. (B) Indekser for alfa-diversitet af fækal tarmmikrobiota fra CLM og vildtlevende dyr; fra venstre mod højre vises følgende indekser: Observeret (OUT rigdom), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Forskelle mellem grupper vurderes statistisk ved Wilcoxon-testen. (C) Hovedkoordinatanalyseplot af beta-diversitetsordination fra Bray−Curtis-ulighedsmetrik mellem CLM vs. wildling (øverst), CLM-kontrol vs. CLM HSD (nederst til venstre), og wildling-kontrol vs. wildling HSD (nederst til højre); adskillelse og homogenitet mellem grupper blev beregnet ved henholdsvis PERMANOVA og PERMDISP test. * p Mindre end eller lig med 0.05; ** p Mindre end eller lig med 0.01; **** p Mindre end eller lig med 0.0001. Figur 1. HSD-påvirkning på bakteriesammensætningen af ​​CLM (n=10/gruppe) og vilde mus (n=11 for vilde Ctrl og n=12 for vilde HSD). (A) Eksperimentelt design. C57BL/6 CLM eller vildtlevende mus blev fodret med 0,5% NaCl (kontrol, Ctrl) eller højsalt 4% NaCl (HSD) og tarmbakteriesamfunds tarm karakteriseret ved 16S rRNA gen amplikon sekventering. (B) Indekser for alfa-diversitet af fækal tarmmikrobiota fra CLM og vildtlevende dyr; fra venstre mod højre vises følgende indekser: Observeret (OUT rigdom), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Forskelle mellem grupper vurderes statistisk ved Wilcoxon-testen. (C) Hovedkoordinatanalyseplot af beta-diversitetsordination fra Bray−Curtis-ulighedsmetrik mellem CLM vs. wildling (øverst), CLM-kontrol vs. CLM HSD (nederst til venstre), og wildling-kontrol vs. wildling HSD (nederst til højre); adskillelse og homogenitet mellem grupper blev beregnet ved henholdsvis PERMANOVA og PERMDISP test. * p Mindre end eller lig med 0,05; ** p Mindre end eller lig med 0,01; **** p Mindre end eller lig med 0,0001.

HSD inducerede en signifikant reduktion i bakteriediversitet (figur 1B, alle alfa-diversitetsindekser) såvel som et signifikant mikrobielt skift i sammensætningen af ​​CLM (figur 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl vs. CLM HSD). I modsætning hertil var tarmmikrobiotaen af ​​vilde mus karakteriseret ved højere diversitet efter HSD (Figur 1B, Observed & Chao1 indekser), divergent fra CLM, og de var også karakteriseret ved mindre udtalt mikrobiel sammensætningsændring efter HSD sammenlignet med CLM (Figur 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, wildling Ctrl vs. wildling HSD).

3.2. Tarmmikrobiel sammensætning af vilde mus er mere modstandsdygtig over for HSD end CLM

Bakteriesammensætningsforskelle mellem wildling og CLM blev yderligere taksonomisk karakteriseret. På phylum niveau var de hyppigst forekommende phyla med hensyn til relativ overflod: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, vildtlevende: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, vilde dyr: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7%, vildtlevende: 0,7 ± 1,3%) og Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%, vildtlevende: 0%/ikke påvist) (figur 2). Den mikrobielle tarmprofil viste yderligere forskellige mængder for alle phyla påvist i fækale prøver mellem vilde mus og CLM (figur 2). Især var kernemikrobiota phyla Firmicutes, Bacteroidota og Verrucomicrobiota signifikant forskellige mellem de to modeller (figur 2). Mere specifikt, på familieniveau, blev et andet bidrag observeret i vilddyr vs. CLM tarmmikrobiota for de fleste af de bakterier, der tidligere er rapporteret som HSD-følsomme [28], herunder Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae og Akkermansiaceae (figur 3). I overensstemmelse hermed blev lignende tendenser bekræftet på slægtsniveau mellem wildling- og CLM-prøver for hovedmedlemmerne af de førnævnte familier; blandt disse var de mest repræsentative Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum og Akkermansia (figur S1 og 4). For yderligere at karakterisere virkningen af ​​HSD på CLM og vildtlevende tarmmikrobiotasammensætninger analyserede vi også indvirkningen af ​​diætregimet på forskellige klassifikationsniveauer. På phylum-niveau var HSD-behandlet CLM-tarmmikrobiota karakteriseret ved betydelig udtømning af Firmicutes og berigelse af Verrucomicrobiota (Figur 2), men ingen af ​​de vigtigste phyla blev påvirket af HSD i vilddyrsprøver (Figur 2). På familieniveau var CLM tarmmikrobiota karakteriseret ved betydelig udtømning af mælkesyreproducerende bakterier såsom Lactobacillaceae, såvel som SCFA-producenter såsom Peptostreptococcaceae og Clostridiaceae (figur 3). Derudover observerede vi i HSD-fodret CLM stigninger i Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae og Eggerthellaceae (figur 3). I modsætning hertil påvirkede HSD forskellige bakteriefamilier i vildtlevende tarmmikrobiota, blandt dem de to meget rigelige Muribaculaceae og Prevotellaceae, som begge blev øget efter HSD (figur 3). Bakteriel modulation, der bidrog mest til HSD-effekten i CLM, inkluderede stigningen af ​​slægterne Akkermansia, Parasutterella og Enterorhabdus, såvel som faldet af Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens-gruppen, Muribaculum og Anaerovorax (Figur 4). Bortset fra Roseburia var ingen af ​​de førnævnte slægter påvirket af HSD i vildtlevende tarmmikrobiota, mens slægten Anaerovorax viste en modsat tendens fra CLM (Figur 4).

Figur 2. HSD-effekt på bakteriel phyla fra tarmmikrobiota af CLM (n=10/gruppe) og vilde mus (n=11 for vilde Ctrl og n=12 for vilde HSD). Den samlede sammensætning i form af phyla relative overflod er vist ved søjleplot for hvert individ (øverst) og boxplot for specifik phyla (nederst); statistiske sammenligninger blev udført mellem grupper ved Wilcoxon-test. * p Mindre end eller lig med 0.05; ** p Mindre end eller lig med {{10}}.01; *** p Mindre end eller lig med 0,001; **** p Mindre end eller lig med 0,0001.

Figur 3. Indvirkningen af ​​foderforbrug med højt saltindhold på bakteriefamilier af CLM (n=10/gruppe) og vilde mus (n=11 for vilde Ctrl og n=12 for vilde HSD). Den samlede sammensætning på familieniveau er repræsenteret ved søjleplot pr. individ (øverst) og boxplot for specifikke familier (nederst); statistiske sammenligninger blev udført mellem grupper ved Wilcoxon-test. * p Mindre end eller lig med 0.05; ** p Mindre end eller lig med {{10}}.01; *** p Mindre end eller lig med 0,001; **** p Mindre end eller lig med 0,0001.

Figur 4. Ændringer i bakterieslægter i CLM (n=10/gruppe) og vilde mus (n=11 for vilde Ctrl og n=12 for vilde HSD). Samlet relativ overflodsbidrag på slægtsniveau er plottet som et cirkulært søjleplot for hvert individ (øverst) og et boxplot for specifikke slægter (nederst); statistiske sammenligninger blev udført mellem grupper ved Wilcoxon-test. * p Mindre end eller lig med 0.05; ** p Mindre end eller lig med 0.01; *** p Mindre end eller lig med 0,001; **** p Mindre end eller lig med 0,0001.

3.3. HSD påvirker prædiktive mikrobielle funktioner i CLM, men ikke i vilde mus

PICRUST 2-output påviste ikke nogen signifikant forskel mellem mikrobielle samfundsfunktioner af vildtlevende HSD vs. ubehandlede vildtlevende mus for både KEGG Orthology og MetaCyc pathway-annoteringer, med den eneste undtagelse af HSD-induceret øget funktion på recG-genet for en ATP-afhængig helicase fra KEGG-ortologien (figur 5A). HSD-påvirkning på CLM var karakteriseret ved et signifikant fald i prædiktive funktioner for KEGG Orthology, blandt dem genet spp (saccharose-6-phosphatase) og pfkA (phosphofructokinase 1), begge involveret i stivelse og saccharosemetabolisme, som er på linje med tidligere fund [28] (figur 5A). Derudover var tarmmikrobiotaen af ​​HSD-fodret CLM karakteriseret ved nedsatte prædiktive funktioner af gener involveret i membrantransport (feoB for jerntransport, AB 2P AB 2 permeaseprotein, AB 2A AB 2 ATP bindende protein), glutaminbiosyntese (glnA) LacI-familie transkriptionel regulator (lacI, galR) og transketolase (tktA, tktB) (figur 5A). For MetaCyc-veje berigede HSD signifikant CLM-tarmmikrobiotaen af ​​prædiktive funktioner forbundet med nitratreduktion (denitrifikationsvej), galactosenedbrydning (D-galactarat-nedbrydning, super-vej for D-glucarat og D-galactarat-nedbrydning), phenyl-propanoat-nedbrydning, fedtsyre syrebjærgning, succinatnedbrydning til butansyre og aminosyrenedbrydning (aromatisk aminnedbrydning, L-leucinnedbrydning) (figur 5B). I overensstemmelse med tidligere fund [28], mistede HSD tarmmikrobiota i CLM forudsigende funktioner for amminosyrebiosyntese (supervej for L-alaninbiosyntese, L-lysinbiosyntese), blandet syrefermentering, med yderligere ny signatur tabt som N- nedbrydning af acetylglucosamin/N-acetylmannosamin/N-acetylneuraminat og nedbrydning af deoxyribonukleosider (pyrimidin- og purinnedbrydning, inosin5phosphatbiosyntese III) (figur 5B).

Figur 5. Forts.

Figur 5. Virkning af HSD på tarm-forudsigende metagenomiske funktioner i CLM (n=10/gruppe) og wildling (n=11 for wildling Ctrl og n=12 for wildling HSD) tarmmikrobiota. PICRUST2-output plottet som kileskriftsplot for KEGG Orthology-annotering (A) og MetaCyc-veje (B) udtrykt som log2-gennemsnitsforhold mellem de forudsigelige funktioners tællinger mellem HSD vs. Ctrl-prøver. Alle statistiske sammenligninger blev udført mellem Ctrl vs. HSD grupper ved Wilcoxon-test.

4. Diskussion

Kompleks og forskelligartet vildtlevende tarmmikrobiota er kendt for at være mere modstandsdygtig over for visse sygdomsmodeller [51] og diætregimer, såsom højt fedtindtag [54,55]. Imidlertid har ingen tidligere undersøgelse evalueret virkningerne af højt natriumindtag på murin vild-afledt tarmmikrobiota. Her undersøgte vi for første gang, hvordan HSD påvirker vildtlevende tarmmikrobiota sammenlignet med CLM. Interessant nok viste vores resultater, at sammenlignet med CLM er det vilde mikrobiom mere modstandsdygtigt over for HSD-forstyrrelser på både sammensætningsmæssige og forudsigelige funktionelle niveauer. Det er veletableret, at højt saltindtag kan forværre risikoen for forskellige sygdomme, såsom kardiovaskulære eller autoimmune sygdomme, ved at ændre tarmmikrobiomsammensætning og immunhomeostase [25,29,31,34,63-65]. I overensstemmelse med tidligere rapporter var HSD-inducerede skift i tarmmikrobiota i CLM karakteriseret ved signifikante ændringer i mikrobiel diversitet, sammensætning og prædiktive funktioner [28]. Sundhedsfremmende bakterier såsom Peptostreptococcaceae-familien og slægterne Lactobacillus, Roseburia og Tuzzerella faldt med hensyn til relativ overflod i CLM, mens Akkermansia steg signifikant i HSD-fodrede grupper. Vi opdagede også højere relative forekomster af HSD i Defluvitaleaceae, Enterorhabdus og Parasutterella. Interessant nok er slægten Parasutterella en kernekomponent i tarmmikrobiotaen hos både CLM og mennesker, hvor den opfører sig som en asaccharolytikum og producent af succinat [66]. Både Enterorhabdus fra Eggerthellaceae-familien og Parasutterella fra Sutterellaceae-familien er kendt for at være beriget hos patienter med IBD [67,68], hvilket yderligere indikerer, hvordan HSD kan påvirke sygdomsudviklingen. Interessant nok viste vildtlevende mus ikke en lignende enhed af HSD-inducerede mikrobielle skift, såsom CLM. På trods af dette steg vilddyrsdiversiteten signifikant på HSD for observerede OTU'er og Chao1-metrikker, og kun få taxa var involveret i HSD-forstyrrelsen af ​​vildtlevende tarmmikrobiota, blandt dem en stigning af Anaerovorax, kombineret med et fald i Erysipelatoclostridium, Roseburia og Lachnospiraceae UCG-004 slægt. Roseburia var den eneste bakterielle signatur, der almindeligvis blev delt mellem HSD-grupper sammenlignet med de tilsvarende kontroller, på trods af at HSD-fodret CLM stadig var karakteriseret ved en højere overflod af disse bakterier sammenlignet med HSD-fodrede vilde mus. Det er værd at bemærke, at butyratproducerende bakterier såsom Roseburia viste sig at have lavere relativ overflod hos patienter med colitis ulcerosa [69], og denne reduktion blev også observeret at være korreleret med IBD genetiske risiko hos mennesker [70]. Dette er i overensstemmelse med tidligere fund, hvor skift i bakterieslægter såsom Roseburia eller Lactobacillus viste sig at være forbundet med en risiko for hypertension, muligvis fremmet af en vestlig diæt [71]. Den bakterielle sammensætning af tarmen er også forbundet med tarmens motilitet og fysiologi [72].

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Slægten Anaerovorax er tidligere blevet observeret hos mus med abnorm tarmfysiologi og nedsat motilitet [73]; dog kan berigelsen af ​​Anaerovorax i HSD for vilde mus føre til en anden rolle for denne taxa i forbindelse med tarmhomeostase og korrekt funktion. I overensstemmelse med tidligere fund observerede vi en stigning i slægten Akkermansia i HSD-gruppen af ​​CLM [28], mens tarmmikrobiotaen af ​​vilde mus var udtømt for denne slægt, hvilket også er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af denne model [51, 53-55]. Selvom slægten Akkermansia er et potentielt probiotikum på grund af dets positive virkning på at forbedre værtens immunologiske og metaboliske profiler (f.eks. ved fedme og type 2-diabetes) [42,74-77], er denne slægts rolle stadig uklar på grund af dens negative korrelation med kliniske resultater i kolorektal cancer [78], Parkinsons sygdom [79,80] og multipel sklerosepatienter [81]. I overensstemmelse med vores tidligere resultater opnået med MetaCyc-veje [28], viste CLM efter HSD nedsatte prædiktive mikrobielle funktioner forbundet med stivelse og saccharosemetabolisme til KEGG-ortologi. De mindre skift i tarmbakteriesammensætningen af ​​HSD-fodrede vilde mus formåede imidlertid ikke at inducere nogen signifikant variation i forudsigelige bakteriefunktioner, hvilket indikerer, at tarmmikrobiota og metaboliske/økologiske netværk er meget mere stabile og kan tilpasse sig meget lettere til HSD-inducerede kostvariationer sammenlignet med CLM tarmøkosystemer, hvilket berettiger yderligere undersøgelse. Værd at nævne er også den mulige indflydelse fra tarmsvampesamfundet på tarmens bakterielle netværk på forskellige diætregimer. Tidligere undersøgelser har allerede foreslået, hvordan potentielle interaktioner mellem bakterier og svampe er impliceret i værtens immunsystems homeostase og sygdomsudvikling [82-85]. I denne sammenhæng er CLM yderligere begrænset af deres lavere bakterielle kompleksitet sammenlignet med vilde mus, hvilket kan hindre etableringen af ​​en forskelligartet tarmmycobiota [54]. Fremtidige undersøgelser vil være i stand til at bestemme bidraget fra tarmsvampesamfund i omgivelser med tarmmikrobiota og værtsimmunitet ved at bruge vilddyrsmodellen. Sammenfattende giver vores undersøgelse data om, hvordan højt natriumindtag påvirker et naturligt, vildt afledt tarmmikrobielt økosystem sammenlignet med et domesticeret tarmbakteriesamfund af CLM. Vores undersøgelse viste, at HSD ikke påvirker bakterielle taxa og tarmmikrobiota hos vilde mus på samme måde som for en domesticeret tarmmikrobiota fra CLM. Denne divergens, som tidligere nævnt for andre diætregimer eller tilstande såsom diæter med højt fedtindhold [54,55], indikerer, at fremtidig forskning er nødvendig i naturlige murine modelsystemer for at rekapitulere og estimere virkningen af ​​diætinterventioner på mere komplekse tarmøkosystemer, som hos mennesker.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet