Høj P16INK4a, en markør for cellulær alderdom, er forbundet med nyreskade, svækkelse og udfald i lupus nefritis
Mar 24, 2022
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME
INTRODUKTIONLupus nefritis (LN) er en alvorlig komplikation af systemisk lupus erythematosus (SLE), initieret af aflejring af immunkomplekser eller autoantistoffer i den glomerulære basale membran, efterfulgt af rekruttering af inflammatoriske celler.'Nyreskadefører til irreversibel fibrose, hvilket resulterer i tab af nyrefunktion. LN behandles med højdosis kortikosteroider og andre immunsuppressive midler. En tredjedel af patienterne viser ikke desto mindre et fald inyrefunktion, hvor 5 procent -10 procent udvikler slutstadietnyresygdominden for 10 år." Prognostiske markører, der ville muliggøre rettidig behandlingsoptrapning eller modifikation, søges derfor ivrigt, ligesom nye terapeutiske mål. Cellulær alderdom, udløst af stimuli såsom telomererosion, oxidativ stress og kronisk inflammation, fører i sidste ende til irreversibel vækst standsning gennem akkumulering af cyclin-afhængige kinase (CDK)-hæmmere, herunder pl6Na-protein (CDKN2A): et væsentligt kendetegn for cellularsenes-videnskaben Ældrende celler forbliver metabolisk aktive og gennemgår en række morfologiske og fysiologiske ændringer, herunder opregulering af -galactosidase-aktivitet og -optagelse af en proinflammatorisk, profibrotisk senescens-associeret sekretorisk fænotype (SASP)." Selvom det er afgørende for vævsreparation og -ombygning (f.eks. under embryogenese), kan cellulær ældning have negative virkninger i aldringsrelateret og kronisk sygdom såvel som cancer.' pl6Nk eller -galactosidase positive celler er blevet observeret inyrealdring og visse nyresygdomme, og var forbundet med histologiske læsioner ognyreværdiforringelse. Tilstedeværelsen af -galactosidase-positive celler korrelerede med proteinuri i MRL/lprlupus-tilbøjelige mus-grad; dog skal cellulær senescens endnu ikke tydeligt påvises i positiv LN. Her rapporterer vi forekomsten af pl6ka. celler i nyrebiopsier fra (n=40) patienter med aktivt LN, og dets sammenhæng mednyreskadeog funktionsnedsættelse.
Nøgleord:nyrefunktion; nyresygdomme; nyrebiopsier; nyreskade; nyre
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRE DIALYSEN
METODER:Patienter og nyrebiopsierPatienter blev rekrutteret ved afdelingen for reumatologi, Cliniques Universitaires Saint-Luc (Bruxelles, Belgien). Alle opfyldte de 1982 reviderede ACR klassificeringskriterier for SLE og havde biopsi-bevist LN. Formalinfikserede paraffin-indlejrede (FFPE) nyrebiopsier var resterende korporalt materiale indsamlet til diagnostiske formål mellem januar 1996 og november 2019. Estimerede glomerulære filtrationshastighed (eGFR) værdier blev beregnet ved hjælp af Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI) formlen. Patientsamtykke var ikke påkrævet til brug af resterende kropsmateriale, i overensstemmelse med belgiske regler for undersøgelser på mennesker.
Histologi og immunhistokemiISN/RPS 2003 klassifikation af SLEnyrebiopsier, semi-kvantitativ sclerose-score og National Institutes of Health (NH) aktivitetsindeks (AI) og kronicitetsindeks (C) blev hentet fra lægejournaler. Immuntræning med anti-CD8(C8/144B, Dako) og anti-p16INK4 (E6H4, Roche Ventana CINtec Histology) og Picrosirius Red (PSR) farvning blev udført på 5μm FFPE serielle snit. Slides blev digitaliseret på en SCN400 scanner (Leica Biosystems, Tyskland) eller en Pannoramic Confocal slide scanner (3DHistech, Ungarn) ved × 20 forstørrelse. Computerstøttet kvantificering af hele overfladen af sektioner blev udført ved hjælp af Author V2017.2 (Visi Biopharm, Danmark). De viste resultater er antallet af pl6K eller CD8-positive celler pr. μm² væv. Semi-kvantitative PSR-scores (skala:2-6) er median (glomerulær plus interstitiel fibrose) score fra tre (blindede) scorere. Yderligere detaljer findes i online supplerende mentale metoder 1, online supplerende figur 1.Statistiske analyserStatistiske analyser blev udført på GraphPad Prism V.9.1.0: Mann-Whitney eller Wilcoxon matched-pair signed-rank tests for to-gruppe sammenligninger, Kruskal-Wallis for multigruppe sammenligninger og Spearmans rangordenskorrelationskoefficient.
RESULTATER:p16k4-positive celler i nyrebiopsier fra patienter med aktiv LNVi evaluerede p16Nk-protein ved immunhistokemi pånyrebiopsier taget ved diagnosen fra 40 patienter med aktiv LN, inklusive hændelig nefritis (n=31) og tilbagefald (n=9). Demografiske, biologiske og kliniske data er opsummeret i online supplerende tabel 1.p16INkA. positive celler blev påvist i alle, men med betydelig variation mellem prøverne: fra praktisk talt ingen til lejlighedsvise spredte celler til stærkt positive områder (figur lA, online supplerende figur 2A-D). Kvantificering af pl6-farvning bekræftede heterogeniteten af LN-biopsier (område: 1,76×10~-260×10~, median:14,7×10-celler/μm) (figur 1B,C). Farvede celler inkluderede mesangiale celler, endotelceller eller podocytter i glomeruli, parietale epitelceller i Bowmans kapsler, proksimale eller distale tubulære celler og interstitielle celler (figur ID). Selvom tætheden af pl6-positive celler (pr. μm) var signifikant højere i glomeruli end i interstitia (figur 1C) viste disse værdier (pr. prøve) en signifikant positiv korrelation(r=0.7591, p.<0.0001)(online supplemental="" figure="" 3).="" importantly,="" pl6ka="" accumulation="" was="" not="" associated="" with="" patient="" age,="" gender,="" or="" ethnicity="" (online="" supplemental="" figure="">
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYREINFEKTION
p16"K4 er forbundet med nedsat nyrefunktion ved baseline og 5 år efter behandlingp16INKEa-positivitet var signifikant forbundet med svækketnyrefunktion: biopsier fra patienter med eGFR<60 at="" the="" time="" of="" sampling="" had="" significantly="" higher="" pl6inf-positive="" cells/μm²,="" and="" conversely,="" samples="" with="" high(="">75. percentil) p16a var forbundet med signifikant lavere baseline eGFR (figur 2AB). Forbindelsen med eGFR var sand for både glomerulær og interstitiel pl6a (online supplerende figur 5A,B). Interessant nok, hvorimod høj glomerulær p16 også var forbundet med signifikant højere proteinuri (urinprotein/kreatinin-forhold), hvilket hovedsageligt afspejler glamour-var ikke (online suppleulær skade, interstitiel pl6ka mental figur 5C,D). I modsætning til dens tilknytning til var ikke forbundet med fattigenyrefunktion,pl6NK4a-parametre for systemisk sygdom, såsom serum-anti-dobbeltstrenget DNA-antistof eller C3-niveauer, eller med ISN/RPS-klassificering (online supplerende figur 6A-D). Lidt (ikke-signifikant) højere pl6k blev observeret i biopsier fra patienter med længere varighed mellem SLE- og LN-diagnose og i tilbagefald sammenlignet med hændelig nefritis (online supplerende figur 7A,B). Vigtigt er det, at analyse af kun de hændelige LN-tilfælde bekræftede sammenhængen mellem pl6 og eGFR (online supple-mental figur 7C), hvilket tyder på, at det ikke udelukkende er afhængigt af varigheden af nyresygdommen. Endelig var høj p16Nkia i baseline biopsier også forbundet med lavere eGFR 5 år efter behandling (men ikke på året), hvilket tyder på, at det kan være prædiktivt for dårlig langsigtetnyreevolution (figur 2C,D).
Figur 1 p16NK43-positive celler i nyrebiopsier fra patienter med aktiv LN.(A) p16-, CD8- og PSR-farvning af FFPE-seriesnit fra en LN-nyrebaselinebiopsi. Oversigt (venstre paneler), nærbillede (højre) der viser p16-positive celler i en glomerulus, periglomerulære CD8-positive celler og kollagenaflejringer i og omkring Bowmans kapsel af samme glomerulus. (B) Kvantificering af p16xa (positive celler/μm², der viser graden af heterogenitet blandt prøverne. （C） Kvantificering af p16< （positive="" cells/um²）="" in="" glomerular="" vs="" interstitial="" areas="" of="" the="" same="" samples.p-value:="" wilcoxon="" matched-pair="" signed-rank="" test.="" (d)="" representative="" image="" from="" a="" sample="" showing="" p16-positive="" cells="" within="" glomeruli="" (#),="" in="" bowman's="" capsules="" (filled="" star),="" proximal="" tubules(filled="" arrow),="" distal="" tubules(arrow)="" and="" dispersed="" in="" the="" interstitium="" (arrowhead).ffpe,="" formalin-fixed="" paraffin-embedded;="" ln,="" lupus="" nephritis;="" psr,="" picrosirius="">
p16NK43 er forbundet med nyre CD8* T-celleinfiltration og p16Ma fibroseDet er blevet vist, at CD8tTlymfocytter er den dominerende immuncelletype, der infiltrerer LN nyren, og at deres tilstedeværelse er forbundet mednyresygdomsværhedsgrad Vi fandt ud af, at pl6-høje biopsier viste signifikant højere CD8t T-celleinfiltration (figur 3A). De var også signifikant forbundet med øget fibrose: kollagen
aflejring som afspejlet af semi-kvantitative scores af PSR-farvning og sclerose og NH CI-score leveret af en neuropatolog (figur 3B-D). NIH AI-scorer var derimod ikke signifikant forskellige mellem p16INK4a-grupperne (data ikke vist). Spændende nok bemærkede vi, når vi undersøgte vævssnit, hvad der syntes at være en rumlig samfordeling mellem stærk pl6k-farvning (der havde tendens til at være glomerulære) og klyngede CD8-positive celler (oftest periglomerulære) i visse LN-biopsier (figur IA, online supplerende figur 2). Vi altså. kvantificerede antallet af CD8* T-celler placeret inden for en radius på 30μm omkring hver glomerulus, tykkelsen af dens Bowman's kapsel og antallet af pl6k-positive celler i den (online supplerende figur 1). Dette blev udført på alle glomeruli, der var synlige på de tre serielle sektioner, på tværs af alle prøver. Glomeruli med høj pl6K4-positiv celleakkumulering viste signifikant højere Perigo-makulære CD8 T-celler (figur 3E) samt øget tykkelse af Bowmans kapsler, hvilket afspejler glomerulær fibrose (figur 3F).
DISKUSSIONDette er den første demonstration, i en stor række af patienter, at pl6Na, et væsentligt kendetegn for cellulær senescens, er forbundet med sygdommens sværhedsgrad i LN. IHC for pl16-protein bruges i vid udstrækning til at vurdere for alderdom ex vivo og er blevet forbundet med sværhedsgraden af andrenyresygdomme.'Selektiv eliminering af pl6-positive celler i musemodeller for aldring og induceret nefropati har desuden vist sig at lindre fibrotiske læsioner og forbedrenyrefunktion,' tyder på en nøglerolle inyrepatogenese. Hvorfor cellulær senescens kan forekomme i LN er ukendt. Det inflammatoriske, oxidative miljø i LN-nyren kan være en kilde til cellestress. Adskillige proinflammatoriske faktorer er blevet impliceret i senescens-induktion, 14inchuding interferon-B3, der er blevet forbundet med den senescerende fænotype af knoglemarvs mesenkymale stamceller fra patienter med SLE15Mens vores undersøgelse fremhæver en signifikant sammenhæng mellem mængden af pl6-positive celler og LN-sværhedsgrad, vil brugen af yderligere markører for cellulær senescens i en større kohorte være afgørende for at bekræfte dets relevans i LN. Om og hvordan cellulær senescens bidrager til sygdomsprogression (eller om det blot afspejler vævsskade) mangler at blive undersøgt. En skadelig virkning kan udøves gennem det profibrotiske, proinflammatoriske sekretom (SASP), der er typisk for senescerende celler. I overensstemmelse med denne hypotese beskriver vi en stram rumlig samfordeling mellem pl6Nk-positive celler, fibrose og CD8* T-celle-infiltration i LN-nyrer. En anden patogen mekanisme kan involvere akkumulering af funktionelt inkompetente celler, f.eks.nyreprogenitorceller (RPC, en undergruppe af parietale epitelceller placeret i Bowmans kapsel af glomeruli).'" Mens raske RPC'er regenererer glomerulære og tubulære strukturer takket være deres evne til at proliferere og differentiere sig tilnyrecelleundergrupper,'"ældende RPC'er kunne hæmme vævsreparation." Til sidst, mens SASP er særligt velegnet til at engagere immunsystemet (inklusive CD8t T-lymfocytter)'8til clearance af senescerende celler, kan sidstnævnte hæmme processen ved at hæmme cytolyic celk." Det er blevet foreslået, at persistens af senescerende celler (på grund af den overvældende eller hæmning af immunresponsen) vipper balancen fra en positiv til en negativ effekt." Yderligere in vitro eksperimenter vil være nødvendige for at dissekere rolle af pl6Nk-positive celler i patogenesen af LN. Dette kan have vigtige konsekvenser for terapien, det første åbne pilotstudie med de senolytiske lægemidler dasatinib plus quercetin (DQ) har vist lovende resultater i idiopatisk lungefibrose og diabetisk nyresygdom.Endelig forbindelsen mellem høj baseline pl6INk4 med svækketnyrefunktion5 år efter påbegyndelse af behandlingen tyder på, at det kan være en lovende prædiktor for sygdommens sværhedsgrad. Det ville være interessant at vurdere for pl6 og dets associerede markører (fibrose og CD8 T-celleinfiltration) i 1-års opfølgningsbiopsier såvel som i en større kohorte, som udviklingen af disse markører fra baseline til lyear kan bedre afspejle behandlingsrespons end begge tidspunkter alene.
