GRP78-overekspression udløser PINK1-IP3R-medieret neurobeskyttende mitofagi, del 2

2.5. Western Blot

Vi bedøvede rotter dybt med Dolethal (n=4) ved 7 dpi for at opnå L4-L5 rygmarvssegmenter (5- mm længde) til western blot-analyse. Vi snap-frosset prøverne i flydende nitrogen.

I de senere år har flere og flere forskningsresultater vist, at der er en tæt sammenhæng mellem proteinblotting og hukommelse. Protein blotting er en analytisk teknik til at detektere proteinekspression, som har været meget brugt i neurovidenskabelig forskning.

Forbindelsen mellem neuroner er tæt forbundet med lagring af hukommelse. Protein blotting kan detektere forbindelsesstatus mellem neuroner og ekspressionen af ​​præ- og postsynaptiske proteiner, hvilket yderligere afslører proteinernes vigtige rolle i hukommelsesdannelse og opbevaring.

Undersøgelser har fundet ud af, at ekspressionen af ​​præsynaptiske neuronale proteiner er tæt forbundet med dannelsen og lagringen af ​​hukommelse. For eksempel under processen med indlæring og hukommelse ændrer neuroner ekspressionen af ​​præsynaptiske proteiner, og denne ændring er relateret til dannelsen og lagringen af ​​nye minder. Derudover har nogle undersøgelser også fundet, at ændringer i ekspressionen af ​​nogle proteiner er relateret til neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom.

Derfor kan proteinblotting give en dybdegående forståelse af forbindelsesstatus mellem neuroner og ændringerne i ekspressionen af ​​relaterede proteiner, hvilket afslører neuronernes molekylære mekanisme. Dette er af stor betydning for at studere mekanismen for hukommelsesdannelse og neurodegenerative sygdomme.

Kort sagt viser forholdet mellem proteinblotting og hukommelse proteinernes rolle i forbindelsen mellem neuroner og hukommelseslagring. Dette giver nye ideer og retninger til at studere mekanismen for hukommelsesdannelse og neurodegenerative sygdomme. Lad os aktivt fremme neurovidenskabelig forskning og bidrage til sundhed og lang levetid! Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen markant, fordi den har antioxidant-, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter, som kan hjælpe med at reducere oxidative og inflammatoriske reaktioner i hjernen og derved beskytte nervesystemets sundhed. system. Derudover kan Cistanche også fremme væksten og reparationen af ​​nerveceller og derved forbedre forbindelsen og funktionen af ​​neurale netværk. Disse effekter kan hjælpe med at forbedre hukommelsen, indlæringsevnen og tænkehastigheden og kan også forhindre forekomsten af ​​kognitiv dysfunktion og neurodegenerative sygdomme.

Klik på kender måder at forbedre hjernens funktion

Prøver blev opbevaret eller yderligere behandlet ved homogenisering i lysisbuffer (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og en cocktail af protease (Sigma-Aldrich) og phosphatase-hæmmere (Roche, Basel, Schweiz) ) med en Potter-homogenisator på is.

Efter centrifugering af lysater ved 800 x g i 20 minutter ved 4◦C indsamlede vi supernatanten som den postnukleare fraktion og kvantificerede proteiner ved BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Til western blotting påsatte vi 30 µg postnukleære fraktioner af L4-L5-segmenter fra hvert dyr på 12% SDS-polyacrylamidgeler for at udføre elektroforetisk separation af proteinerne efterfulgt af overførsel til en PVDF-membran i et BioRadcuvette-system i 25 mM Tris, pH 8,4, 192 mM glycin, 20% (v/v) methanol.

Vi blokerede membranerne med 5 % BSA i PBS plus 0.1 % Tween-20 i 1 time ved stuetemperatur og inkuberede derefter ved 4 ◦C natten over med primært antistof: muse anti- -aktin ( 1:10000; SigmaAldrich), mus anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), mus anti-CV (1:1000, Invitrogen), kanin anti-HSP60 (1:500, Antistoffer-online), mus anti- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), mus anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), kanin anti-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, UK), mus anti-PINK1 (1:500, Abcam), kanin anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), kanin anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Efter adskillige vaske blev membraner inkuberet i 2 timer med et passende sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (1:5000, vektor). Membranen blev visualiseret ved anvendelse af en kemiluminescerende blanding af 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM p-cumarsyre, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) og (8,8 M hydrogenperoxid, 1 M Tris-HCl; pH 8,5) og billeder blev taget med et Gene Genome-apparat og analyseret med Gene Snap og Gene Tools software (Syngene).

2.6. In vitro model

NSC34-celler blev dyrket i modificeret Eagle's medium høj-glucose (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich), 100 enheder/mLpenicillin og 0,5 X penicillin/streptomycinopløsning (Sigma-Aldrich) og holdes i befugtet inkubator ved 37 ◦C under 5 % CO2, i det væsentlige som beskrevet tidligere [26].

Efter 4 dages cellekultur uden at ændre mediet havde NSC34-celler en differentieret-lignende fænotype karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​lange neuritter. På dag 4 blev lægemidler tilsat til cellerne. Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) og EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) opløsninger blev fremstillet ved en koncentration på 10X og opløst i DMEM.

Efter 24 timer vurderede cellernes levedygtighed ved at inkubere cellerne med 4 mg/ml MTT-opløsning i 3 timer. De dannede blå formazankrystaller blev opløst i DMSO, og absorbans ved 570 nm blev målt med en mikropladelæser (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofektion

Vi transficerede en million celler med 2 µg plasmid til ekspression af GFP, GRP78, HAPARK, mus sh-eGFP, mus sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mus sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) og /eller mus sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) ved hjælp af Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Schweiz) og Nucleofactor V-kittet (Lonza) efter producentens anbefalinger.

Til statisk cytometrisk analyse podede vi cellerne i {{0}}brønde plader belagt med kollagen 10 %. Efter dyrkning fikserede vi cellerne med 4 % PFA, skyllede to gange med PBS og opbevarede eller tilføjede efterfølgende blokeringsbuffer indeholdende PBS 0,3 % (v/v) Triton X-100 og 10 % føtalt bovint serum. Efter 3 dages cellekultur blev lægemidler opløst i DMEM tilsat.

Til disse eksperimenter brugte vi 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) eller 10 µM BAPTA-AM (Sigma) -Aldrich). Efter 5 timer efter behandlingen fikserede vi enten cellerne til immuncytokemi med 4% PFA eller homogeniserede dem i modificeret RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5.150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1 % NP-40, 0,5 % natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS, protease- og fosfatasecocktails) til immunblotting. Immunhistokemi blev udført ved at skylle prøverne to gange med PBS og inkubere med blokerende buffer indeholdende PBSplus 0,3 % (v/v) Triton X-100 og 10 % føtalt bovint serum.

Vi inkuberede med følgende primære antistoffer: kanin anti-IP3R (1:200, Abcam), muse anti-HA (1:2000, Abcam), muse anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) og kanin anti-HSP60 (1:500, Antistoffer-online). For at vurdere levedygtighed ved MTT som beskrevet ovenfor forlod vi behandlingen i 24 timer.

2.8. Måling af mitokondriel superoxidproduktion og ∆ψM

Celler blev inkuberet med 2,5 µM MitoSOX til superoxidanalyse eller med 2,5 µMTMRM til ∆ψM-analyse, både fra Molecular Probes og Invitrogen i løbet af de sidste 30 minutter af behandlingen. Fluorescens blev detekteret med et IX81 Olympus-mikroskop og kvantificeret ved hjælp af statisk cytometri-software.

2.9. Elektrokemisk måling af iltforbrug

Celler (1 × 106 pr. 1 mL i HBSS) blev omrørt i et gastæt kammer ved 37 ◦C. Målinger blev taget med en Clark-type O2-elektrode (Rank Brothers, Cambridge, UK) og registreret med Dup.18-dataene acquisition device (WPI) umiddelbart efter 5-hbehandling med køretøj eller Tun.

2.10. Mitokondriel og cytosolisk fraktionering

Celler blev homogeniseret i lysisbuffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM saccharose og en cocktail af proteaser (Sigma-Aldrich) og phosphatase-inhibitorer (Roche)) med en Potter-homogenisator på is.

Efter centrifugering af lysater ved 2000 x g i 5 minutter blev supernatanten centrifugeret ved 10.000 x g i 12 minutter. Supernatanten blev betragtet som den opløselige fraktion (S2) og indeholder cytosoliske proteiner og mikrosomer.

Pelleten (P2) var den berigede mitokondrielle fraktion, som blev resuspenderet i modificeret RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, 0,5 % natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS, protease- og phosphatasecocktails) og proteinkoncentration blev bestemt ved BCA-assay. Prøver blev derefter behandlet til western blot.

2.11. Transmissionselektronmikroskopi

Vi nedsænkede rygmarven L{{0}}L5-segmenter (1-mm skiver) i en fikseringsopløsning af 2 % (vægt/volumen) PFA og 2,5 % (v/v) glutaraldehyd (EM-kvalitet) i 0,1 M PBS, pH 7,4 og anbragt dem på en gyngeplatform i 2 timer, derefter fikseret i 1 % (w/v) PFA og efterfølgende postfikseret med 1 % (w/v) osmiumtetroxid (TAAB Lab) ) indeholdende 0,08 % (vægt/volumen) kaliumhexacyanoferrat (Sigma-Aldrich) i PBS i 2 timer.

Vi udførte fire vaske med deioniseret vand og sekventiel dehydrering i acetone. Alle procedurer blev udført ved 4 ◦C, som tidligere beskrevet [33]. Vi indlejrede prøver i EPON-harpiks og polymeriserede ved 60 ◦C i 48 timer.

Prøver blev behandlet for at opnå halvtynde sektioner (1 µm) med en Leicaultracut UCT-mikrotom, farvet med 1% (w/v) vandig toluidinblå opløsning og undersøgt med et lysmikroskop for at identificere de ventrale hornområder beriget med MN'er.

Ultratynde sektioner (70 nm) blev skåret med en diamantkniv, placeret på belagte gitre og kontrasteret med konventionelt uranylacetat og Reynolds' blycitratopløsninger.

Til sidst observerede vi sektionerne med et transmissionselektronmikroskop (Jeol 1400) udstyret med et GatanUltrascan ES1000CCD-kamera. Vi valgte tre skiver pr. tilstand, analyserede tre MN'er pr. sektion og målte områderne af kerner sammenlignet med det samlede areal af MN ved hjælp af ImageJ-værktøjer.

2.12. Bioinformatik og statistik

Vi brugte variansanalyser (ANOVA) til at sammenligne værdierne mellem forskellige eksperimentelle grupper for data, der opfyldte normalitetsantagelsen. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af en envejs ANOVA, efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-rangetest eller ved hjælp af Students t-test. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism5-software (n=3–5; p < 0.05 for signifikans).

3. Resultater

3.1. Tekst

3.1.1. Proteomisk analyse af GRP78-overekspression afslørede mitokondrier som hovedmålet

For at identificere de molekylære mekanismer, der fører til neurobeskyttelse medieret af GRP78-overekspression, udførte vi en sammenlignende mærkefri proteomisk analyse for at identificere både kvantitative og kvalitative forskelle mellem RA-skadede dyr inficeret med adenovira for overekspression af GRP78 (Ad-GRP78), som tidligere har vist sig at være neurobeskyttende af MN'er eller beta-galactosidase (Ad-ß-Gal) som kontrol [20].

Syv dage efter skade (dpi) var det valgte tidspunkt for analysen ifølge tidligere undersøgelser udført i vores laboratorium [20,25]. I en tidligere sammenligning mellem en model for regenerering efter distal aksotomi og sutur af iskiasnerven versus vores degenerative RA-model, observerede vi, at signaleringshændelser var ens indtil 7 dpi, hvor divergerende pro-degenerative hændelser opstod efter RA [20,25].

Den LC-MS/MS-mærkefri analyse af de postnukleare fraktioner fra L4-L5 rygmarvssegmenter resulterede i identifikation af 1420 proteiner med mindst to peptider pr. protein som tidligere rapporteret for andre prøver og undersøgelser [25] .

I alt 566 og 732 proteiner eller peptider blev signifikant ændret på grund af Ad-GRP78 eller Ad-ß-Gal overekspression, henholdsvis i RA-skadede dyr med hensyn til RA-skadede dyr, der ikke var inficeret med en virus (p < 0 .05) (Tabel S1 og S2).

Vi sammenlignede begge lister og fandt ud af, at 220 var unikt ændret på grund af Ad-GRP78-overekspression (tabel S3). Funktionel annotering af disse proteiner ved hjælp af værktøjet Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) gjorde det muligt for os at identificere de mest signifikante biologiske funktioner i datasættet (FDR < 0,05) [34,35].

GRP78-overekspression resulterede i forskelle i niveauerne af proteiner involveret i mitokondrielle processer, funktion og komponenter (tabel S4A-C, figur S1A-C). Gene Ontology (GO) termer og KEGG pathwayenrichment-analyse af disse data afslørede, at der hos dyr inficeret med Ad-GRP78 var signifikante fald i niveauerne af mange proteiner med mitokondrielle funktioner, inklusive proteiner fra det ydre og indre mitokondrielle ansigt, proteiner i det respiratoriske kompleks, og matrixproteiner.

Vi bekræftede forskelle i proteinniveauer afsløret i den proteomiske liste, såsom GRP75, som var opreguleret (p < 0.05), og underenheden af ​​komplekse V (CV ), nedreguleret (p=0.03) i GRP78-grupperne som forventet (figur 1A).

På tværs af hele listen var de mest nedregulerede 2-oxoglutarat/malatbærerprotein OGC (SCL25A11), MT-ND3 (en tumorundertrykker, der deltager i themalat-aspartat-shuttle og regenererer NADH-puljen i mitokondriematrixen tillader komplekset I-funktion), NADH-dehydrogenase-underenheden 3 af kompleks I, gammaaminosmørsyre-aminotransferasen ABAT og ubiquinol-cytochrom C-reduktase-underenheden af ​​kompleks III. I modsætning hertil blev meget få proteiner opreguleret (figur 1B).

Oneupregulated protein var GRP78 som forventet, og de andre opregulerede proteiner var aminosyretransporteren EAAT2, som primært er placeret i plasmamembranen og nogle gange i mitokondrier ved excitatoriske synapser, og hydroxyacyl-CoA dehydrogenase HADHA, som katalyserer de sidste tre trin af mitokondriel beta -oxidation af langkædede fedtsyrer.

Vi udvidede analysen for at undersøge, om andre proteiner i mitokondrier eller mitokondrier funktionsrelaterede proteiner blev modificeret ud af den proteomiske liste for at bekræfte funktionel mitokondrierpåvirkning (figur 1C).

Vi observerede, at den mitokondrie konserverede dynamin-relaterede GTPase optisk atrofi 1 (OPA1), som er involveret i fusion [36], var nedreguleret (p < 0.1); LONP1, en ATP-afhængig protease, der formidler den selektive nedbrydning af forkert foldede polypeptider, viste en tendens til at blive øget, men der blev ikke observeret forskelle i niveauerne af ubiquinon NDUFA9, transkriptionsfaktoren NRF2, som regulerer gener, der indeholder antioxidantresponselementer eller andre dynaminer. -relateret GTPase involveret i infusion, såsom mitofusin 2 (MFN2) [36].

En omfattende oversigt over ændringerne fundet inden for mitokondrier er vist i skemaet i figur 1D. Mitokondriel dynamik er vigtig for stressreaktioner, da beskadigede mitokondrier kan smelte sammen til udveksling af materiale, og mitokondriel fission tillader adskillelse af beskadigede mitokondrier og efterfølgende mitofagi [37].

I betragtning af, at det største antal af nedregulerede proteiner lokaliseres ved mitokondrierne, og der ikke blev observeret nogen tydelige ændringer vedrørende mitokondrierfusionsaktivitet ved at analysere MFN2 og forholdet mellem L/S OPA1-former (figur 1C), undersøgte vi markører relateret til mitofagi.

Klassisk forekommer autofagi-afhængig nedbrydning af mitokondrier efter depolarisering, og det udløses normalt af den øgede akkumulering af fosfatase og tensinhomolog (PTEN)-induceret formodet kinase 1 (PINK1) i fuld længde ved den ydre mitokondrielle membran.

Efterfølgende rekrutteres E3 ubiquitin-proteinligase Parkin mellem ringen til at markere mitokondrielt ydre membranprotein af depolariserede mitokondrier ved ubiquitylering [38-41]. Øverst i figur 2A viser ingen ændringer i Parkin-niveauer, men en signifikant reduktion af PINK1 i fuld længde frembragt af RA-skade i det ipsilaterale L4-L5-rygmarvssegment i forhold til kontrollen ved 7 dpi. I modsætning hertil reducerede overekspressionen af ​​GRP78 Parkin, men fordoblede PINK1-niveauer efter RA sammenlignet med kontrolekspressionen af ​​ikke-relateret protein-Gal (figur 2A, nederst).

Opreguleringen af ​​PINK1 i fuld længde er i overensstemmelse med induktionen af ​​mitofagi [42], og Parkin-reduktion kan være relateret til en fremskreden tilstand af organel-demontering som observeret af resten af ​​mitochondria-proteiner.

Vi undersøger yderligere co-lokalisering af mitokondrier og mikrotubulus-associerede proteiner 1A/1B let kæde 3 (LC3)-positive puncta, en nøglekomponent i kernemakroautofagi-maskineriet og nødvendig for mitofagiprocessen [43].

Ved hjælp af konfokal mikroskopi observerede vi en signifikant stigning i co-lokaliseringen af ​​mitokondrier, mærket ved hjælp af anti-COX IV, med LC 3-positiv puncta efter RA kun i beskadigede MN'er, der overudtrykker GRP78 ved 7 dpi (figur 2B).

Vi bekræftede kun eksistensen af ​​mitofagi i afulserede MN'er, når vi overudtrykte GRP78 ved analyse af prøver ved hjælp af transmission elektronisk mikroskopi.

Vi observerede rigelige vakuoler med opslugte mitokondrier, et kendetegn for mitofagi [37], der ligner mitofagosomer og flere ERcisternae i tæt forbindelse med mitokondrier i MN'er fra Ad-GRP78 dyr, men vi opdagede dem ikke i Ad- -Gal RA-skadede rotteprøver ved 5 dpi (figur 2C).

Figur 1. GRP78-overekspression i RA-skadede dyr retter sig mod mitokondrielle proteiner. (A) Immunoblot og søjlediagrammer, der viser gennemsnitlige foldændringer (± SEM) af GRP78-, GRP75- og CV-proteinniveauer i L4-L5-rygmarvssegmenter i GRP78 vs.

-Gal overudtrykker RA-skadede rotter med 7 dpi. Niveauer blev normaliseret til actinværdier (n=4; * p < 0.05 vs. Ad- -Gal, Elevens t-test). (B) Histogram af mitokondrielle proteinfoldændringer opnået ved proteomisk analyse af L4-L5-rygmarvssegmenter fra RA-skadede dyr, der overudtrykker GRP78 sammenlignet med Ad- -Gal-gruppen med 7 dpi. (C)Immunblot og søjlediagrammer, der viser gennemsnitlige foldændringer (± SEM) af NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 normaliseret til actin. (Ingen signifikante forskelle mellem grupperne. Elevens t-test). (D) Skematisk mitokondrier med proteiner ændret ved overekspression af GRP78 i L4-L5 rygmarvssegmenter fra RA-skadede dyr fremhævet med gult (nedsat) eller inblåt (øget) ved 7 dpi.

Figur 2. Mitofagi moduleres in vivo efter RA i rotter, der overudtrykker GRP78. (A) Immunoblots og tilsvarende søjlediagrammer for PINK1- og PARK-foldændringsanalyse af proteinniveauer (middelværdi ± SEM) normaliseret til actinniveauer i L4-L5-rygmarvssegmenterne af RA-skadede rotter vs.

kontrol (øverst) eller fra Ad{{0}}}Gal- og Ad-GRP78-grupper (nederst) med 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, elevens t-test). (B) Til venstre, mikrofotografier af repræsentative MN'er på det ipsilaterale sted fra RA-skadede dyr, der modtog en intrathekal injektion af AAVrh10-GFP- eller AAVrh10-GRP78-grupper ved 7 dpi. Prøver blev farvet for COX IV (rød) og LC3 (grøn) og modfarvet med fluorescerende Nissl (blå).

Skalabjælke=10 µm og digital zoom ind 10X.

Bemærk, at samlokalisering kun observeres i AAVrh10-GRP78-gruppen. Til højre, søjlediagram, der viser analysen af ​​% af co-lokaliseringspunkter for COX IV og LC3. Gennemsnit ± SEM af COX IV og LC3 co-lokalisering (n=4; ** p < 0.01, Elevens t-test). (C) Repræsentative transmissionselektronmikroskopibilleder, hvor mitokondrier skelnes inden for MN'er af rygmarven: et billede af MN-cytoplasma, der viser mitokondrier-inkontroldyr; b, billede af MN cytoplasma fra RA-skadet rotte fra Ad- -gal-gruppen; c, billede af MN-cytoplasma fra RA-skadet rotte fra Ad-GRP78-gruppen med nogle opslugte mitokondrier angivet med røde stjerner; d, billede med højere forstørrelse er vist i (C), der peger på en stor mitokondrier og ER-kontakt. Skalabjælker er angivet i figurerne.

Alt i alt antydede disse resultater, at GRP78-overekspression kan inducere mitophagyin-afbrudte MN'er efter RA, og det kunne fremme neurobeskyttelse.

3.1.2. GRP78 Overekspression genopretter beskadiget mitokondriel funktion

Vi undersøgte derefter effekten af ​​GRP78-overekspression på mitokondrier, der forårsagede en in vitro-model af ER-stress, da denne fornærmelse optræder tidligt efter RA-skade in vivoaer rapporteret tidligere [20,26], og det er en pålidelig metode til at screene nye neurobeskyttende midler [2,44 ].

Denne model anvender tunicamycin (Tun), som er en ER-stress-inducer, der forårsager dannelsen af ​​N-acetylglucosamin-lipid-mellemprodukter, og derved forhindrer glycosyleringen af ​​nysyntetiserede proteiner og fører til, at proteiner fejlfolder. Vi brugte det, fordi en standset sekretorisk vej også er blevet rapporteret at være nøglen i den neurodegenerative proces efter RA [26].

Vi bekræftede først, at nukleofektion af de NSC34motoneuron-lignende celler med en passende vektor resulterede i produktionen af ​​GRP78 (figur 3A). I disse celler forbedrede ekspressionen af ​​GRP78 signifikant overlevelse i medium indeholdende Tun (figur 3B).

Selvom Tun-behandling normalt inducerer selve GRP78, er denne endogene overekspression ret sen (med 24 timer) (Figur S2). Vi spekulerede også på, om vi kunne afgøre, om GRP78-overekspression har neurobeskyttende virkninger i en anden in vitro-model, som vi tidligere rapporterede for at reproducere flere karakteristika ved MN-død efter RA-skade [26].

Denne model er baseret på cytoskeletbeskadigelse induceret af nocodazol, som interfererer med polymeriseringen af ​​mikrotubuli. GRP78-ekspression øgede også levedygtigheden af ​​celler dyrket i nærvær af nocodazol (figur 3B).

Derefter vurderede vi mitokondriel funktion ved at måle dannelsen af ​​reaktive iltarter (ROS) i mitokondrier ved hjælp af MitoSOX, mitokondriemembranpotentialet (∆ψm) ved hjælp af tetramethylrhodamine methylester (TMRM) og O2-forbrugsraten i vores NSC34-celler udsat for ER-stress med eller uden GRP78 overekspression.

Som positiv kontrol brugte vi efavirenz (EFV), et mitotoksisk middel, der ændrer alle tre parametre [45]. Vi observerede, at MitoSOX-niveauer gradvist steg efter Tun-tilsætning og nåede statistisk signifikans med 24 timer, og at ROS-generering blev øget signifikant i EFV-behandlede celler fra den første time efter behandling med hensyn til vehikelbehandlede kontroller (Figur S3A).

Overekspression af GRP78 resulterede i signifikant lavere niveauer af ROSin-mitokondrier med hensyn til GFP-udtrykkende celler 24 timer efter Tun- eller EFV-behandling (figur 3C). ∆ψm blev kollapset efter 5 og 24 timers Tun-behandling og efter 24 timers EFV-behandling (figur S3B). Gendannelse af denne parameter blev opnået ved GRP78-overekspression i Tun- eller EFV-behandlede celler (figur 3D).

Hastigheden af ​​O2-forbrug blev reduceret i løbet af 80 minutters analyse efter Tun-tilsætning i cellerne, der udtrykker GFP (hældning -0.063,R2=0.98), men O2-forbruget var stabil i GRP78-overudtrykkende celler på trods af tilstedeværelsen af ​​Tun (hældning -0,221, R2=0.99) (Figur 3E, venstre).

Efter 5 timer var respirationen normal i GRP-78-overudtrykkende celler og alvorligt kompromitteret i de GFP-udtrykkende celler (figur 3E, højre). Alt i alt tyder disse resultater på, at GRP78 dæmper mitochondriadysfunktion forårsaget af ER-stress eller mitotoksicitet.

For more information:1950477648nn@gmail.com