Glukose udøver en anti-melanogen effekt ved indirekte inaktivering af tyrosinase i melanocytter og en human hudækvivalent

Abstrakt:

Sukker er allestedsnærværende i organismer og er velkendte kosmetiske ingredienser til at fugte huden med minimale bivirkninger. Glucose, et simpelt sukker, der bruges som energikilde af levende celler, bruges ofte i hudplejeprodukter. Adskillige rapporter har vist, at sukker og sukkerrelaterede forbindelser har anti-melanogene virkninger på melanocytter. Den underliggende molekylære mekanisme, hvorved glucose hæmmer melaninsyntesen, er dog ukendt, selvom glucose bruges som blegning såvel som en fugtgivende ingrediens i kosmetik. Heri fandt vi, at glucose signifikant reducerede melaninindholdet i -melanocytstimulerende hormon (MSH)-stimulerede B16-celler og mørkt pigmenterede normale humane melanocytter uden tegn på cytotoksicitet.

Ydermere demonstrerede topisk behandling af glukose dens blegningseffektivitet gennem fotografering, Fontana-Masson (F&M)-farvning og multi-fotonmikroskopi i en pigmenteret 3D-hudmodel, MelanoDerm. Glucose ændrede imidlertid ikke genekspressionen eller proteinniveauerne af større melanogene proteiner i melanocytter. Mens glucose kraftigt nedsatte intracellulær tyrosinaseaktivitet i melanocytter, reducerede den ikke svampetyrosinaseaktivitet i et cellefrit eksperimentelt system. Glucose blev imidlertid metaboliseret til mælkesyre, som kraftigt kan undertrykke tyrosinaseaktivitet. Således konkluderede vi, at glucose indirekte hæmmer tyrosinaseaktivitet gennem omdannelse til mælkesyre, hvilket forklarer dens anti-melanogene virkninger i melanocytter.

Tyrosinase er et enzym, der kan nedbryde tyrosin i protein og omdanne det til tyrosinoxidationsprodukter, såsom tyrosinphenol og andre stoffer. Dette enzym findes bredt i den menneskelige krop, især i tarmkanalen, hvor det er involveret i fordøjelsen og optagelsen af ​​mad. Samtidig blev det i forskningen fundet, at cistanche kan reducere aktiviteten af ​​tyrosinase og dermed blege huden.

Klik på hvad der er cistanche

Nøgleord:

melanogenese; sukker; glukose; tyrosinase; ækvivalent med menneskelig hud

1. Introduktion

Melanogenese er processen med melaninproduktion og er afgørende for hudbeskyttelse. Melanin absorberer ultraviolet (UV) lys og beskytter huden mod de skadelige virkninger af UV-lys og frie radikaler [1]. Men fordi overdreven produktion af melanin forårsager hyperpigmentering såsom fregner og lentigo, som kan betragtes som uæstetisk, er meget forskning blevet dedikeret til at finde effektive depigmenterende ingredienser til kosmetik eller medicin [2-4].

Sukker er et kraftigt fugtighedsbevarende middel til at fugte huden og bruges som en kosmetisk ingrediens til at fugte huden med minimale bivirkninger. Derudover påvirker sukkerarter og sukkerrelaterede midler melanogenesen [5,6]. Glycosylering af tyrosinase, et nøgleenzym involveret i melaninsyntese, kan ændres, hæmmer dets katalytiske aktivitet og accelererer dets nedbrydning [7]. Sukkers rolle i melanogenese er blevet fremhævet af undersøgelser, der undersøger effekten af ​​glycosylering på pigmenteringsfænotypen af ​​melanocytter og sukkerresternes roller på den katalytiske aktivitet af tyrosinase [5-7]. Nogle undersøgelser har rapporteret, at sukkerderivater kan hæmme tyrosinasemodning, hvilket påvirker dets glykosylering. For eksempel forstyrrer N-acetylglucosamin (NAG), en aminohexose produceret fysiologisk ved tilføjelse af en aminogruppe til glucose, tyrosinaseglycosylering, hvilket resulterer i depigmenterende effekter i marsvinehud og menneskehud [8].

Derudover har nyere undersøgelser vist, at sukkerrelaterede forbindelser hæmmer tyrosinaseekspression eller aktivering samt ændrer dets glycosylering. For eksempel evaluerede vi blegningseffektiviteten af ​​galacturonsyre (GA), en sukkersyre, der er en oxideret form af galactose og hovedbestanddelen af ​​pektin. Galacturonsyre udøver en blegende effekt gennem regulering af tyrosinaseaktivitet og ekspression i B16 murine melanomceller og en human hudækvivalent [9]. I en anden rapport viste en ny type cyklisk oligosaccharid, kendt som cyklisk nitrosylnigerose (CNN), en svag, men signifikant direkte hæmmende effekt på den enzymatiske aktivitet af tyrosinase, hvilket tyder på en mulig mekanisme for hypopigmentering [10]. I lighed med tyrosinasemodning ved korrekt glycosylering kan ekspressionen eller aktiviteten af ​​CNN være et mål for anti-melanogene midler [11]. Men talrige anti-melanogene midler har alvorlige bivirkninger, såsom vitiligo [12,13]. Der er derfor stor interesse for sikrere depigmentære forbindelser.

Her undersøgte vi de anti-melanogene virkninger af glucose på B16 murine melanomceller og normale humane melanocytter. Derudover undersøgte vi vævsfarve og epidermal status ved hjælp af vævssnitfarvning af en human hudækvivalent. Baseret på vores resultater foreslår vi, at glukoses blegende effekt er afhængig af mælkesyreproduktion, hvilket resulterer i tyrosinase-inaktivering.

2. Resultater

2.1. Anti-melanogen virkning af glukose i B16 og NHM'er

For at undersøge den anti-melanogene effekt af glucose brugte vi to typer melanocytter, B16 melanomceller (en murin melanomcellelinje) og normale humane melanocytter (NHM'er). Først bestemte vi, om glucose var giftig for B16-celler. Glucose viste ingen cytotoksicitet ved koncentrationer op til 100 mM i B16-celler, som vist i figur 1A. Baseret på cytotoksicitetsdataene blev B16-celler behandlet med forskellige koncentrationer af glucose i 72 timer i nærvær af det -melanocyt-stimulerende hormon (MSH), en inducer af melanogenese. Som vist i figur 1B nedregulerede glucose klart og signifikant det intracellulære melaninindhold på en dosisafhængig måde. Kojic acid (KA) blev brugt som en referenceforbindelse til anti-melanogenese, fordi den ofte bruges som en hudoplysende kosmetisk ingrediens [1,3,4]. Farven på lysater i glucose-behandlede celler var lysere end farven på kontrolceller (figur 1C).

Derudover bekræftede vi, at mængden af ​​melanin udskilt i dyrkningsmediet faldt, og mediets farve blev lysere (figur 1D). Dernæst undersøgte vi den anti-melanogene effekt af glucose på mørkt pigmenterede NHM'er. Glucose i koncentrationer op til 100 mM var ikke cytotoksisk i op til fire 4 dage (figur 1E). Når melaninindholdet blev bestemt efter glukosebehandling af NHM'er i 4 dage, fandt vi, at melaninindholdet faldt på en dosisafhængig måde (figur 1F). Tilsammen indikerer disse resultater, at glucose undertrykker melaninsyntese i melanocytter.

2.2. Whitening Effekt af Glucose på en 3D Human Hud Equivalent

For yderligere at definere glucoses anti-melanogene evne brugte vi en pigmenteret 3D-hudmodel, MelanoDerm. Som beskrevet i afsnittet Materialer og metoder blev glucose påført på MelanoDerm'en topisk i 18 dage, og cellelevedygtighed blev bestemt ved CCK-8-assay. Som vist i figur 2A blev der ikke observeret nogen vævscytotoksicitet efter glucosebehandling i 18 dage. Vævsfarveændringer blev vurderet ved fotografering. Som vist i figur 2B var glucosebehandlet væv lysere i farven end phosphatpufret saltvand (PBS)-behandlet væv. Derudover afslørede hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning, at glucose ikke inducerede vævskollaps, mens fontana-masson (F&M) farvning viste, at glucose reducerede antallet af hyperpigmenterede melanocytter (som angivet med pile) i basallaget (Figur 2C) .

For yderligere at undersøge ændringer i melaninindhold sammenlignede vi autofluorescenssignalerne af melanin i melanocytlagene af PBS- og glucosebehandlede væv ved hjælp af to-foton excitationsfluorescens (TPEF) mikroskopi, som vist i figur 2D. En analyse af disse billeder viste, at melaninvolumenet blev reduceret med cirka 36 procent, og TPEF-signalintensiteten for melanin i det melanocytrige område blev reduceret med cirka 38 procent i glukosebehandlet væv sammenlignet med PBS-behandlet væv.

Figur 2. Effekt af glucose på human hudækvivalent, MelanoDerm. (A) Levedygtighed af humane hudækvivalenter behandlet med glucose. (B) Humane hudækvivalenter (MelanoDerm; n=3) blev topisk behandlet med glucose i 18 dage og derefter fotograferet. ∆L-værdien angiver graden af ​​lethed sammenlignet med PBS-behandlet væv. (C) H&E og F&M farvning af vævssnit. Objektglassene blev fikseret i en formaldehydopløsning og indlejret i paraffinvoks til farvning (skalastang, 5{{10}} µm). Sorte pile indikerer pigmenterede melanocytter. (D) Melanin-billeddannelse (200 × 200 × 60 µm3) af humane hudækvivalenter blev udført ved anvendelse af TPEF-mikroskopi. Pseudofarvede (røde) signaler indikerer melanin (skalalinje, 50 µm). Graferne angiver kvantificeringen af ​​melaninvolumen og TPEF-signaler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD af mindst tre uafhængige målinger (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. Effekt af glukose på ekspressionen af ​​melanogene proteiner i melanocytter

For at belyse depigmenteringsmekanismen for glucose i melanocytter vurderede vi dens effekt på ekspressionen af ​​melanogene enzymer såsom tyrosinase og Tyrp-1 i B16-celler og NHM'er. B16-celler blev behandlet med glucose i de angivne tider i nærvær af -MSH. Derefter blev proteinniveauer af tyrosinase og Tyrp-1 bestemt ved Western blot-assay (figur 3A). Ekspressionsniveauerne af tyrosinase og Tyrp-1 blev ikke reduceret af glucose på noget tidspunkt. Desuden blev transskriptionsniveauer af tyrosinase ikke påvirket af glucose i -MSH-stimulerede B16-celler (figur 3B). I lighed med B16-celler blev proteinniveauer af tyrosinase, Tyrp-1 og MITF ikke hæmmet af glucose (figur 3C) i NHM-celler behandlet med glucose, og mRNA-niveauer af tyrosinase og Tyrp-1 var heller ikke faldet, men lidt øget af glukose (figur 3D).

Figur 3. Effekt af glucose på ekspressionen af ​​melanogene proteiner i B16-celler og NHM'er. (A, B) B16-celler blev behandlet med -MSH i den angivne tid i nærvær eller fravær af 20 mM glucose. Derefter blev Western blot (A) og qRT-PCR (B) assays udført. (C) NHM'er blev behandlet med de angivne koncentrationer af glucose i 48 timer. Derefter blev Western blot-assayet udført. (D) NHM'er blev behandlet med den angivne tid i nærvær af 50 mM glucose. Derefter blev qRT-PCR-assays udført. Data er udtrykt som middelværdien ± SD af mindst tre uafhængige målinger.

2.4. Effekt af glucose på tyrosinaseaktivitet

For yderligere at definere virkningsmekanismen for glucose testede vi, om det havde en hæmmende effekt på svampe-tyrosinase-aktivitet. Som vist i figur 4A fandt vi, at glucose ikke havde nogen hæmmende virkning på svampe-tyrosinase-aktivitet, hvilket indikerer, at glucose ikke direkte påvirker tyrosinase-aktivitet. Vi udførte derefter en total intracellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse ved anvendelse af glucosebehandlede cellelysater fra både B16-celler og NHM'er. Interessant nok blev intracellulær tyrosinaseaktivitet hæmmet på en dosisafhængig måde i glucosebehandlede B16-celler i nærvær af -MSH (figur 4B). I NHM'er hæmmede glucose også intracellulær tyrosinaseaktivitet (figur 4C). Disse data understøtter muligheden for, at glucose indirekte inaktiverer tyrosinase i melanocytter.

Figur 4. Effekt af glucose på tyrosinaseaktiviteten. (A) Effekt af glucose på svampe-tyrosinase-aktiviteten i et cellefrit system. (B, C) Cellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse. (B) B16-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af glucose i 24 timer. Derefter blev det cellulære tyrosinaseaktivitetsassay udført som beskrevet i metodeafsnittet. (C) NHM'er blev behandlet med 5 0 mM glucose i den angivne tid. Derefter blev det cellulære tyrosinaseaktivitetsassay udført som beskrevet i metodeafsnittet. Den cellulære tyrosinaseaktivitet blev normaliseret af det totale proteinindhold. Data er udtrykt som middelværdien ± SD af mindst tre uafhængige målinger (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.5. Tyrosinase-inaktivering ved produktion af mælkesyre i glukosebehandlede melanocytter

Glucose omdannes til den cellulære metabolit laktat, som er mælkesyren i opløsning, og som er blevet rapporteret at være effektiv til behandling af pigmentlæsioner [14,15]. Derfor antog vi, at glucose omdannes til mælkesyre i melanocytter, og at øgede niveauer af mælkesyre hæmmer melanogenese gennem tyrosinase-inaktivering. For at evaluere denne hypotese vurderede vi først produktionen af ​​mælkesyre i medier fra glucosebehandlede melanocytter. Som forventet opregulerede glucose signifikant mælkesyreindholdet i B16-celle-dyrkede medier (figur 5A). Fordi mælkesyre er kendt for direkte at hæmme tyrosinaseaktivitet [15], vurderede vi desuden, om mælkesyre undertrykte svampetyrosinaseaktivitet. Som vist i figur 5B inhiberede mælkesyre dramatisk svampetyrosinaseaktivitet i modsætning til glucose. Disse resultater tyder på, at omdannelsen af ​​glucose til mælkesyre har en anti-melanogen effekt via tyrosinase-inaktivering af mælkesyren.

Figur 5. Produktion af laktat ved hjælp af glucose og virkning af mælkesyre på tyrosinaseaktiviteten. (A) Lactatproduktion i glucosebehandlede B16-celler. (A) B16-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af glucose i 3 dage. Derefter blev et lactatassay udført under anvendelse af de dyrkede medier, som beskrevet i metodeafsnittet. (B) Effekt af mælkesyre på svampe-tyrosinase-aktiviteten i et cellefrit system. Data er udtrykt som middelværdien ± SD af mindst tre uafhængige målinger (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001) .

3. Diskussion

Sukker eller sukkerafledte materialer bruges ofte som kosmetiske ingredienser til hudbeskyttelse og fysiologisk kontrol. For eksempel øger raffinose mTOR-uafhængig autofagi og reducerer celledød i UVB-bestrålede keratinocytter, hvilket indikerer, at det naturlige middel raffinose har potentiel værdi til at begrænse fotoskader [16]. Trehalose og saccharose er nye aktivatorer af autofagi i humane keratinocytter gennem en mTOR-uafhængig vej [17]. Disse fund giver ny indsigt i den sukkermedierede regulering af autofagi i keratinocytter. I tilfælde af glukose blev topisk glukose vist at inducere claudin-1 og filaggrinekspression i en musemodel af atopisk dermatitis og keratinocytkultur, hvilket indikerer, at det har en antiinflammatorisk effekt ved at reparere hudbarrierefunktionen [18]. Derudover hæmmer glucose proliferation og øger differentieringen af ​​hudkeratinocytter [19]. Derfor regulerer glucose forskellige aspekter af epidermal fysiologi, såsom hudbarrierefunktioner og keratinocythydreringsniveauer.

Sukker kan fungere som depigmenterende midler via flere forskellige mekanismer, der involverer tyrosinase. For eksempel hæmmer nogle midler tyrosinasemodning, mens andre midler inducerer hæmningen af ​​tyrosinase-genekspression eller aktivitet [5,8-10]. Imidlertid har få undersøgelser undersøgt de mekanismer, der ligger til grund for depigmenteringseffekterne af glukose.

For at bestemme effekten af ​​glukose på melanogenese fokuserede vi tidligere på lever X-receptorer (LXR'er), som er ligandaktiverede nukleare receptorer, der spiller en central rolle i lipidmetabolisme og kolesterolhomeostase [20]. Vi fandt ud af, at lever X-receptoraktivering hæmmer melanogenese gennem accelerationen af ​​ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK)-medieret mikrophthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF) nedbrydning [21]. Desuden er glucose en endogen LXR-ligand [22]. Således antog vi, at glucose har anti-melanogene virkninger på grund af aktiveringen af ​​en LXR-afhængig vej. Som vist i figur 3C ændrede glucose imidlertid ikke ekspressionsniveauerne af tyrosinase eller MITF, selvom LXR-aktivering reducerede ekspressionsniveauerne af disse proteiner i melanocytter.

Derfor konkluderede vi, at glucose havde depigmenterende virkninger på melanocytter uafhængigt af LXR-aktivering.

Glucose er det vigtigste substrat for energiproduktion, og det hydrolyseres via serielle reaktioner af flere enzymer, kendt som glykolyse. Talrige undersøgelser har vist, at glykolyse kun har ét slutprodukt, mælkesyre, uanset om det er under aerobe eller anaerobe forhold. Under aerobe forhold (O2) anvendes laktat som substrat for mitokondriel laktatdehydrogenase (MLD). LDH'er omdanner det til pyruvat, der kommer ind i tricarboxylsyrecyklussen (TCA). Under anaerobe forhold (N2) ophobes laktat i cytosolen. Derfor begynder glykolysevejen med glukose som substrat og slutter med produktionen af ​​lactat som hovedslutprodukt [23]. Derudover har David et al. målte fraktionen af ​​glucose, der blev omdannet til mælkesyre eller pyruvat i den normale humane melanocyt [24]. De fleste af metabolitterne af glucose var mælkesyre snarere end pyruvat.

Mælkesyre er en alfa-hydroxysyre (AHA); disse syrer bruges i vid udstrækning i kosmetiske formuleringer som overfladiske peelingsmidler [25]. Derudover undertrykker mælkesyre melanindannelsen ved direkte at hæmme tyrosinaseaktiviteten, en virkning uafhængig af dens sure natur, hvilket betyder, at mælkesyrens virkning på pigmentlæsioner ikke kun skyldes accelerationen af ​​epidermal celleomsætning, men også direkte hæmning af melanindannelsen i melanocytter [15]. Således ræsonnerede vi, at glucose kan udøve sin anti-melanogene effekt via mælkesyreproduktion, fordi glucose kan omdannes til mælkesyre. Som forventet fandt vi, at glukosebehandling resulterede i mælkesyreproduktion i melanocytter (figur 5A).

Derudover bekræftede vi, at mælkesyre kraftigt og direkte hæmmede tyrosinaseaktivitet (figur 5B). Usuki et al. opdagede også, at mælkesyre nedsatte intracellulær tyrosinaseaktivitet i B16-celler og humane HM3KO-celler [15]. I rapporten blev mRNA- og proteinniveauer af tyrosinase og Tyrp-1 ikke påvirket af mælkesyre. Tilsammen indikerer disse data, at glucose øger mælkesyreproduktionen, og at denne mælkesyre direkte hæmmer tyrosinaseaktivitet uden at påvirke genekspressionsniveauer, hvilket indikerer, at glucose har en anti-melanogen effekt i melanocytter via indirekte tyrosinase-inaktivering afhængig af mælkesyreproduktion. Imidlertid er yderligere eksperimenter nødvendige for at validere mælkesyrens og glukoses rolle i depigmentering.

Samle data fra denne undersøgelse giver foreløbige beviser, der understøtter anvendeligheden af ​​topisk glukose som en effektiv blegning såvel som et fugtgivende reagens, der sikkert kan bruges i kosmetik og medicinske formuleringer.

4. Materialer og metoder

4.1. Materialer

D-glucose, -MSH, kojinsyre (KA), L-tyrosin, L-DOPA og mælkesyre blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Antistoffer mod tyrosinase og actin blev købt fra Abcam (Cambridge, UK). Antistof mod Tyrp-1 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Antistof mod MITF blev købt fra Proteintech (city, IL, USA).

4.2. Cellekultur og levedygtighedsanalyse

Vi købte B16 murine melanomceller, Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og føtalt bovint serum (FBS) fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). B16-celler blev dyrket i DMEM indeholdende 4500 mg/L høj glucose (ATCC 30-2002) som anbefalet af producenten (ATCC) suppleret med 5 procent FBS og inkuberet ved 37 ◦C i en fugtig atmosfære indeholdende 95 procent luft og 10 procent CO2. Mørkt pigmenterede primære NHM'er blev købt fra Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, USA). Celler blev dyrket i medium 254 (#M254500) suppleret med humant melanocytvæksttilskud (#S0025) og inkuberet ved 37 ◦C under en 5 procent CO2-atmosfære. Til eksperimenter blev primære NHM'er mellem passager 4 og 7 brugt. Levedygtigheden af ​​dyrkede celler blev vurderet ved hjælp af et celletællingskit-8 (CCK-8) som beskrevet af producenten (DOJINDO, Tokyo, Japan).

4.3. Måling af melaninindhold

Melaninindholdet blev bestemt som beskrevet i tidligere rapporter [2-4]. Kort fortalt blev B16-celler behandlet med de angivne koncentrationer af glucose i nærvær af -MSH (200 nM) i 72 timer. NHM'er blev behandlet med de angivne koncentrationer af glucose i 4 dage. Derefter blev alle celler vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og opløst i 1 N NaOH ved 60 ◦C i 1 time. Cellelysater blev overført til en 96-brøndplade, og absorbansen blev målt ved 405 nm. Værdierne blev normaliseret baseret på proteinkoncentrationerne i hver prøvebrønd.

4.4. Svampetyrosinaseaktivitetsanalyse

Vi undersøgte de direkte virkninger af de angivne koncentrationer af glucose på svampe-tyrosinase-aktivitet. Kort fortalt blev 100 µL phosphatbuffer indeholdende glucose blandet med svampetyrosinase (10 enheder/brønd) og kombineret med 50 µL 0,03 procent L-tyrosin eller L-DOPA i destilleret vand. Derefter blev blandingen inkuberet sammen ved 37 ◦C i 10 minutter, og absorbansen blev målt ved 405 nm. Kojic acid (KA), et velkendt anti-tyrosinasemiddel, blev brugt som referenceforbindelse.

4.5. Intracellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse

Kort fortalt blev B16-celler eller NHM'er behandlet med de angivne koncentrationer af glucose i de angivne tider. Derefter blev cellerne vasket med PBS og lyseret ved inkubation i 50 mM phosphatbuffer (pH 6,8) indeholdende 1 procent Triton X-100 og 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid. Cellulære lysater blev derefter centrifugeret ved 12,000 rpm ved 4 ◦C i 20 min. Supernatanten indeholdende cellulær tyrosinase blev opsamlet, og proteinindholdet blev bestemt til normalisering. Det cellulære ekstrakt blev inkuberet med L-DOPA i phosphatbuffer, og dopakromdannelse blev overvåget ved at måle absorbans ved 405 nm inden for 30 minutter.

4.6. RNA-isolering og realtids kvantitativ omvendt transkription-polymerasekædereaktion (qRT-PCR)

For at bestemme den relative mRNA-ekspression af udvalgte gener blev totalt RNA isoleret med TRIzol (Invitrogen, CA, USA) i henhold til producentens instruktioner, og 4 µg RNA blev revers-transskriberet til cDNA ved anvendelse af RT-premix (Bioneer, Seoul, South Korea). Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af et ABI 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qRT-PCR-primersættene for tyrosinase og Tyrp-1 blev købt fra Applied Biosystems, og TaqMan Gene Expression Assay-kits (Applied Biosystems) blev brugt til amplifikation. Målgenekspression blev normaliseret til den for husholdningsgenet, der koder for ribosomalt protein lateral stilk-underenhed P0 (RPLP0). Relativ kvantisering blev udført ved hjælp af den komparative ∆∆Ct-metode i henhold til producentens instruktioner.

4.7. Western Blotting

Celler blev vasket to gange med kold PBS og derefter lyseret i iskold modificeret RIPA-buffer (Cell Signaling Technology, MA, USA) indeholdende proteaseinhibitorer (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Den samlede proteinkoncentration blev bestemt, og proteinerne blev opløst ved SDS-PAGE på 4-12 procent gradient Bis-Tris geler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), overført til nitrocellulosemembraner (Thermo Fisher Scientific). Efter overførsel blev membraner blokeret i en 5 procent blokerende opløsning. Membraner blev inkuberet med primære antistoffer ved 4 ◦C i 24 timer, vasket med Tris-bufret saltvand indeholdende 0.1 procent Tween-20 (TBST) og eksponeret for peroxidase-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev skyllet tre gange med TBST. Et kemiluminescerende signal blev udviklet under anvendelse af Western blotting ECL-reagens (GE Healthcare, Hatfield, UK).

4.8. Tredimensionel (3D) Human Hud Equivalent

Vi brugte MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA) som en human hudvævsmodel. Denne levedygtige, rekonstituerede 3D-hudækvivalent var afledt af sorte donorer og indeholder normale melanocytter og keratinocytter. MelanoDerm blev dyrket ved luft-væske-grænsefladen i EPI-100-NMM-113-medium (MatTek Corp, Ashland, MA, USA). Før glucosebehandling blev væv vasket med 1 ml PBS for at fjerne resterende forbindelser. Glucose blev opløst i PBS. Den endelige koncentration af glucose var 2 procent. Kontrolprøven blev kun behandlet med PBS. Glucose blev påført MelanoDerm på dag 1, 4, 6, 8, 11, 13 og 15. Efter 18 dage blev MelanoDerm-væv fikseret i 4 procent bufret formaldehyd, indlejret i paraffin, skåret til en tykkelse på 3 µm og underkastet til H&E og F&M farvning. Levedygtigheden af ​​vævsprøverne blev vurderet ved hjælp af et celletællingskit-8 (CCK-8) som beskrevet af producenten (DOJINDO, Tokyo, Japan). Pigmenteringen af ​​MelanoDerm blev vurderet ved at sammenligne ændringen i L*-værdien.

4.9. To-Photon Excitation Fluorescence (TPEF) billeddannelse

For at visualisere fordelingen af ​​melanin i 3D-hudækvivalenten udførte vi TPEF-billeddannelse, som beskrevet i vores tidligere rapporter [3,4]. Kort fortalt blev hvert MelanoDerm-præparat fikseret i 4 procent formalin i 24 timer ved 4 ◦C og derefter vasket med PBS/0,1 procent BSA (bovint serumalbumin, Merck, Branchburg, NJ, USA). TPEF-billederne blev erhvervet fra basallaget for at måle intracellulært melanin i melanocytlaget. Relative TPEF-signalintensiteter for melanin i målevolumenet blev kvantificeret ved hjælp af Image-Pro Premier 3D-software (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

4.10. L-lactat assay

B16-celler blev podet ved 1.0 × 105 celler pr. brønd i en 12-brøndsplade. Efter behandling med glucose i 3 dage blev ekstracellulære lactatniveauer kvantificeret under anvendelse af et L-lactat kolorimetrisk assaykit (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) i henhold til producentens protokol.

4.11. Statistisk analyse

Data are expressed as means ± SDs (standard deviations), and statistical significance was determined by Student's t-test. A p-value < 0.05 was considered statistically significant.

Forfatterbidrag:

Konceptualisering, H.-JK, JL og CSL; Datakuration, SHL; Efterforskning, SHL; Metodologi, SHL, I.-HB og E.-SL; Supervision, JL og CSL; Skrivning – originalt udkast, SHL og CSL; Skrivning – gennemgang og redigering, JL Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering:

Denne forskning blev finansieret af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (Grant Number: 2018R1D1A1B07049402).

Interessekonflikt:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Forkortelser

-MSH -melanocytstimulerende hormon

Tyrp-1 tyrosinase-relateret protein 1

MITF mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor

NHMs normale humane melanocytter

TPEF to-foton excitationsfluorescens

LXR lever X-receptor

AHAs alfa-hydroxysyrer

H&E hæmatoxylin og eosin

F&M Fontana-Masson

Referencer

1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Undersøgelse af melanins rolle i UVA/UVB og hydrogenperoxid-induceret cellulær og mitokondriel ROS-produktion og mitokondriel DNA-skade i humane melanomceller. Fri Radik. Biol. Med. 2012, 52, 626-634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Et nyt adamantylbenzylbenzamidderivat, AP736, undertrykker melanogenese gennem inhibering af cAMP-PKA-CREB-aktiveret mikrophthalmia-associeret transkriptionsfaktor og tyrosinaseekspression. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762-764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Åh, SG; et al. Antimelanogen virkning af Melasolv (3,4,5-Trimethoxycinnamate Thymol Ester) i melanocytter og tredimensionel human hudækvivalent. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190-196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Mannosylerythritollipider hæmmer melanogenese via undertrykkelse af ERK-CREB-MITF-Tyrosinase-signalering i normale humane melanocytter og en tredimensionel human hudækvivalent. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738-741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Udviklingen af ​​sukkerbaserede anti-melanogene midler. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogenese-hæmmere. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924-931. [CrossRef]

7. Ando, ​​H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Hearing, VJ Tilgange til at identificere inhibitorer af melaninbiosyntese via kvalitetskontrol af tyrosinase. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751-761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MIN; Yoon, TJ Afbrydelse af tyrosinaseglycosylering af N-acetylglucosamin og dets depigmenterende virkninger i marsvinehud og menneskehud. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199-201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Depigmenteringseffektivitet af galacturonsyre gennem tyrosinaseregulering i B16 murine melanomceller og en tredimensionel human hudækvivalent. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708-712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Effekter af et ikke-cyclodextrin cyklisk kulhydrat på musemelanomceller: Karakterisering af en ny type hypopigmenteret sukker. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Nye tyrosinasehæmmere fra naturressourcer – deres beregningsstudier. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262-2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: En opdateret gennemgang af biologiske, kemiske og kliniske aspekter. Pigment. Celle. Res. 2006, 19, 550-571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Forskellige virkninger af fem depigmentære forbindelser, rhododendron, hindbærketon, monobenzon, rucinol og AP736 på melanogenese og levedygtighed af humane epidermale melanocytter. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44-49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Glukosemetabolisme i pattedyrcellekultur: Ny indsigt til justering af vintage-stier. Trends. Biotechnol. 2010, 28, 476-484. [CrossRef]

15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Den hæmmende virkning af glykolsyre og mælkesyre på melaninsyntese i melanomceller. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43-50. [CrossRef]

16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Raffinose øger autofagi og reducerer celledød i UVB-bestrålede keratinocytter. J. Photochem. Fotobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehalose, saccharose og raffinose er nye aktivatorer af autofagi i humane keratinocytter gennem en mTOR-uafhængig vej. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Topisk glukose inducerer Claudin-1- og Filaggrin-ekspression i en musemodel af atopisk dermatitis og i keratinocytkultur, der udøver anti-inflammatoriske virkninger ved at reparere hudbarrierefunktionen. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19-25. [CrossRef]

19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Glukosevirkninger på hudkeratinocytter: Implikationer for diabeteshudkomplikationer. Diabetes 2001, 50, 1627-1635. [CrossRef]

20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Nukleare receptorer i makrofagbiologi: Ved krydsfeltet mellem lipidmetabolisme og inflammation. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455-480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Søn, ED; Park, YH; Lim, KM Lever X-receptoraktivering hæmmer melanogenese gennem accelerationen af ​​ERK-medieret MITF-nedbrydning. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063-1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Den nukleare receptor LXR er en glukosesensor. Nature 2007, 445, 219-223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Carbohydrate; IntechOpen: London, Storbritannien, 2017; s. 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Sammenlignende metabolisk Flux-profilering af melanomcellelinjer: Ud over Warburg-effekten. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626-42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Dobbelte virkninger af alfa-hydroxysyrer på huden. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com