Mavekræft (GC) var den første førende forekomst og anden førende dødelighed af kræft i fordøjelsessystemet

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt

Platinbehandling er en af ​​de mest fremherskende kemoterapeutiske strategier for patienter med gastrisk cancer (GC). Den terapeutiske effekt er dog mindre end tilfredsstillende, hovedsagelig på grund af den erhvervede resistens over for platinlægemidler. Derfor kan en bedre forståelse af de underliggende mekanismer i høj grad forbedre den terapeutiske effektivitet af GC. I denne undersøgelse havde vi til formål at undersøge de kemo-resistens-relaterede funktioner/mekanismer og klinisk betydning af glucose-reguleret protein 75 (GRP75) i GC. Her viste vores data, at sammenlignet med SGC7901-celler var ekspressionen af ​​GRP75 markant højere i cisplatin-resistens (celler (SGC7901 *). Knockdown af GRP75 afskaffede opretholdelsen af ​​mitokondrielt membranpotentiale (MP) og hæmmede nuklear faktor erythroid{{ 10}}relateret faktor 2 (NRF2), phosphatidylinositol 3 kinase/proteinkinase B (Pl3K/AKT), hypoxi-inducerbar faktor 1a (HIF-1a) og c-myc, hvilket resulterede i blokering af aktiveringen af deres downstream-mål. Disse processer svækkede antioxidations-/apoptoseevnerne og ændrede den metaboliske omprogrammering i SGC7901 "-celler, hvilket førte til re-sensibilisering af disse celler til cisplatin. Imidlertid forårsagede overekspression af GRP75 i SGC7901-celler de modsatte virkninger. En xenograft-model bekræftede de ovennævnte resultater Hos GC-patienter, der fik platin-kemoterapi og en meta-analyse, var et højt niveau af GRP75 positivt forbundet med aggressive karakteristika og dårlig prognose, herunder men ikke begrænset til gastr. tarmkræft, og var en uafhængig prædiktor for den samlede overlevelse. Samlet indikerede vores undersøgelse, at GRP75 var involveret i cisplatin-resistensen af ​​GC, og at GRP75 kunne være et potentielt terapeutisk mål for at genoprette lægemiddelresponset i platin-resistensceller og et nyttigt additivt prognostisk værktøj til at vejlede klinisk håndtering af GC-patienter.

Klik venligst her for at vide mere

Introduktion

Mavekræft (GC) var den første førende forekomst og næstførende dødelighed af kræft i fordøjelsessystemet i Kina. Nuværende behandlinger for fremskreden GC var operationen kombineret med systemisk kemoterapi, men den langsigtede overlevelsesrate var mindre end tilfredsstillende på grund af det høje post-kirurgiske tilbagefald2. I klinisk praksis var platinlægemidler et af de første midler til avanceret behandling. GC kemoterapi3. Men erhvervet resistens over for lægemidler opstod altid efter flere cyklusser af platinbaseret behandling og indikerer en dårlig prognose.cistanchDerfor var det påtrængende vigtigt at belyse de potentielle mekanismer og identificere de nye terapeutiske strategier til at overvinde platinlægemiddelresistens hos GC-patienter.

Cistanche kan anti-aging

Glucose-reguleret protein 75 (GRP75) var den stress-inducerbare molekylære chaperon, der tilhørte varmechokproteinfamilien4. Overekspression af GRP75 var tæt forbundet med tumorprogression i forskellige humane kræftformer5-7. Her fandt vi ved at udforske en meta-analyse, at et højt niveau af GRP75 indikerede en signifikant dårlig prognose i flere kræftformer i fordøjelsessystemet (kolorektal cancer, kolangiocarcinom og bugspytkirtelkræft). For lægemiddelresistens vendte inhibering af GRP75 cisplatin- og doxorubicin-resistensen i hepatocellulært carcinom og ovariecancer. GRP75 sekvestrerede klassisk p53 i cytoplasmaet, hvilket førte til inaktivering af p53-funktionen og undertrykkelse af app-tosis10. En tidligere undersøgelse rapporterede, at GRP75 positive tumorer havde en dårligere prognose sammenlignet med GRP75-negative tumorer i GC med normal p53-funktion. Imidlertid var p53 et af de hyppigst muterede gener i GC (påvirker mere end 50 procent af patienterne) l2-15. Så vi antog en hypotese at ud over den klassiske undertrykkelse af p53-aktivitet kan GRP75 være involveret i at inducere/vedligeholde platinlægemiddelresistensen i GC via en 53-uafhængig måde.

I denne undersøgelse bidrog den højere ekspression af GRP75 til cisplatinresistens i SGC7901-celler og i en xenograft-model. Mekanistisk inducerede/vedligeholdt GRP75 cisplatinresistens via regulering af antioxidations-/apoptotiske evner og metaboliske omprogrammeringsegenskaber.cistanche AustralienHos GC-patienter bidrog overekspression af GRP75 til de aggressive egenskaber og dårlig prognose. Vores resultater indikerede, at GRP75 fremmede cisplatinresistensen i GC og kunne være en biomarkør til at forudsige responsen på platinlægemiddelbehandling.cistanche fordeleMålretning mod GRP75 kan give en ny forståelse af GC systemisk kemoterapi.

Resultater

Effekter af GRP75 på cisplatin-resistens i GC-cellelevedygtighedsassays blev anvendt til at verificere resistensen af ​​SGC7901~-celler, Ipsos (uM) for cisplatin for SGC7901- og SGC7901CR-celler var: 5.518 vs. 72.46 (Fig. 72.46). Baseret på KM-Plotter-databaser indikerede den øgede ekspression af GRP75 en dårlig prognose (fig. 1B). Desuden markant øgede GRP75-ekspressioner i SGC7901CR-celler sammenlignet med dets forældre-SGC7901-celler (fig. 1C), hvilket tyder på, at GRP75 kan bidrage til cisplatin-resistensen. For at bekræfte denne hypotese blev SGC7901~-celler transficeret med scramble- eller GRP75-siRNA, og IC50'erne (uM) for cisplatin for scrambled- eller GRP75-siRNA-transficerede SGC7901CK-celler var: 50,83 vs.20, hhv.{{29} 1D). I modsætning,

overekspression af GRP75 ved at transficere GRP75-plasmiderne ind i SGC7901-celler viste, at IC50'erne for cisplatin for scramble- eller GRP75-plasmider transficerede SGC7901-celler var 3.825 vs. 6.98 (fig. 1E). Samlet afslørede disse resultater, at GRP75 spillede afgørende roller i at opretholde/inducere cisplatin-resistens i GC, men mekanismerne forblev yderligere undersøgelser.

Potentielle mekanismer bag GRP75 forårsagede cisplatin-resistens

Vi downloadede mikroarray-datasæt GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) og GSE14209 (væv, cisplatin-resistente vs. cisplatin-sensitive) fra GEO, derefter udførte vi den GO-biologiske proces og KEGG-Pathway-berigelse baseret på DAVID-berigelse og top 10-analyse. resultater blev vist i fig. 2A-D. De væsentlige forskelle i biologiske processer mellem SGC7901C*-celler og SGC7901-celler omfattede oxidationsreduktion, apoptotisk proces (Fig. 2A), KEGG-Pathway-berigelsesanalyse viste, at DEGs-sæt var tæt korreleret med metaboliske veje og phosphatidylinositol 3-kinase/proteinkinase B-kinase. (PI3K/AKT) pathway (fig. 2B). Respons på lægemidlet var inkluderet i de væsentlige forskelle i biologiske processer mellem cisplatin-resistente og cisplatin-følsomme tumorvæv, og den metaboliske vej var også kerneleddet i KEGG-Pathway berigelsesanalyse (Fig.2C, D). Desuden blev et netværk af 60 proteiner, der signifikant interagerede med GRP75, konstrueret ved hjælp af String-databasen, hvorefter KEGG-Pathway-analyse udførte, at metaboliske veje spillede en vigtig rolle mellem GRP75 og dets interaktorer (fig. 2E). Baseret på disse resultater formodede vi, at antioxidation/apoptose og metabolisk omprogrammering kunne fremme overlevelse og vækst af GC, hvilket fører til cisplatin-resistens. Imidlertid krævede mekanismerne for GRP75-deltagelse i regulering yderligere undersøgelse (fig. 2F).

Effekter af GRP75 på antioxidation og anti-apoptose Her var det intracellulære ROS-niveau forhøjet i SGC7901CR-celler sammenlignet med dets modstykker fra forældrene (fig. 3A), hvilket tyder på, at SGC7901Ck-celler blev udsat for relativt højere oxidative stressforhold. En tidligere undersøgelse afslørede, at GRP75 var involveret i stabiliseringen af ​​MMP, en vigtig kilde til ROS-generering. Her afskaffede knockdown af GRP75 opretholdelsen af ​​MMP i SGC7901CK-celler induceret af cisplatin, og overekspression af GRP75 havde den modsatte effekt i SGC7901-celler (fig. 3B).cistanche kolesterolDerefter validerede vi forholdet mellem GRP75 og antioxidation og anti-apoptose. Som vist i fig. 3C reducerede knockdown af GRP75 niveauet af nuklear faktor erythroid-2-relateret faktor 2 (NRF2) og dets nedstrøms målgener (HO-1 og NQO-1) i SGC7901 ~-celler og overekspression af GRP75 viste den modsatte effekt i SGC7901-celler. Desuden forbedrede knockdown af GRP75 eller NRF2 i SGC7901CR-celler yderligere de intracellulære ROS-generationer, apoptose (fig. 3D) og caspase-3-aktiviteter (supplerende fig. S1) induceret af cisplatin. I modsætning hertil svækkede overekspression af GRP75 i SGC7901-celler signifikant cisplatin-inducerede ROS-generationer, celleapoptose (Fig. 3E) og caspase-3-aktiviteter (Supplerende Fig. S1). Disse resultater afslørede, at GRP75 opretholdt/induceret cisplatin-resistens kan være via inducering af antioxidation og anti-apoptose i GC-celler.

Effekter af GRP75 på metabolisk omprogrammering Dernæst undersøgte vi yderligere, hvorved GRP75 inducerede ændring af metabolisk omprogrammering. Stigende beviser viste, at metabolismen af ​​tumorceller ikke var en unormal ændring i en enkelt metabolisk vej, men en omprogrammering af hele det cellulære metaboliske netværk17. Mange klassiske onkogener eller signalveje var involveret direkte eller indirekte i metabolisk omprogrammering, såsom PI3K/AKT, hypoxi-inducerbar faktor la (HIF-la), c-myc og så videre"'819. Derfor verificerede vi, om GRP75 var involveret i den metaboliske omprogrammering af GC-celler. Som vist i fig. 4A observerede vi forhøjede p-AKT-, HIF-la- og c-myc-niveauer i SGC7901CR-celler sammenlignet med dets forældre-SGC7901-celler. Desuden, i SGC7901CR-celler, knockdown af GRP75 reducerede de cisplatin-inducerede p-AKT-, HIF-la- og c-Myc-proteinniveauer og deres downstream-mål relateret til glykolyse (HK2: hexokinase 2; PDK1: pyruvatdehydrogenasekinase l; og LDHA: lactatdehydrogenase A-kæde). Tværtimod viste overekspression af GRP75 i SGC7901-celler den modsatte effekt (Fig. 4B, C). Yderligere viste knockdown af GRP75 eller AKT i SGC7901CR-celler et signifikant fald i glukoseoptagelse og cellelevedygtighed/vækst induceret af cisplatin; overekspression af GRP75 i SGC7901-celler markant øget evnen til glucoseoptagelse og cellelevedygtighed/vækst forårsaget af cisplatin (fig. 4D-F). Samlet indikerede disse data, at GRP75 opretholdt/induceret cisplatin-resistens i GC-celler kan være via deltagelse i p-AKT, HIF-la og c-myc-medieret metabolisk omprogrammering.

Bekræftelse af in vitro-dataene i en xenograft-model Derefter undersøgte vi den potentielle kliniske relevans af GRP75 in vivo. Xenograft-dataene indikerede, at behandling med cisplatin alene eller knockdown af GRP75 alene kunne hæmme tumorvæksten; cisplatinbehandling kombineret med GRP75-knockdown lettede imidlertid signifikant den cisplatin-inducerede inhibering af tumorvækst (fig. 5A). Desuden viste IHC- og qPCR-assays, at cisplatin plus GRP75 siRNA signifikant reducerede udtryk for Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT og downstream-mål sammenlignet med cisplatinbehandling alene, men øgede apoptosen (som bestemt ved TUNEL-farvning, Fig. 5B , C). Samlet indikerede disse resultater, at GRP75 via regulering af antioxidations-/anti-apoptose-evnerne og metabolisk omprogrammering stimulerede in vivo-overlevelsen og væksten, hvilket igen førte til cisplatin-resistens af GC.

Identifikation af GRP75 som en karakteristisk kræftfremmende faktor og den kliniske betydning af GRP75 i GC

Vi evaluerede derefter GRP75-ekspression i på hinanden følgende sektioner af GC-prøver. Som vist i fig. 6A, sammenlignet med tilstødende ikke-tumormavevæv, blev der observeret en betydelig stigning i GRP75-ekspression i GC-væv. Overekspression af GRP75 blev påvist i GC-væv ved IHC-intensitetsscore (fig. 6B). Stærkere farvning for GRP75 blev også observeret med stigende TNM-klassificering af maligne tumorer (fig. 6C, D). Derefter delte vi disse 116 GC-prøver i to grupper ("GRP75 lav" vs." GRP75 høj", ifølge IHC-intensiteten, Fig. 6E). De tværgående diametre af tumorer i "GRP75 høj"-gruppen var signifikant større end dem i "GRP75 lav"-gruppen (fig. 6F). Vi validerede yderligere den kliniske prognose for GRP75 i GC. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste også, at GC-patienter i "GRP75 high"-gruppen havde en dårligere samlet overlevelse end dem i "GRP75 low"-gruppen (fig. 6G).

Multivariat analyse identificerede, at GRP75 var en uafhængig prædiktor for samlet overlevelse (tabel 1).cistanche deserticola bivirkninger,Sammenfattende antydede disse resultater, at GRP75 havde en karakteristisk rolle i ledende GC-progression, cisplatinresistens og dårlig prognose. Meta-analyse af det høje niveau af GRP75 med prognose Flowdiagram af litteratursøgning og udvælgelse og meta-analyse blev vist i Supplerende Fig. S2. Tilfældig-effekt-modellen og fast-effekt-modellen blev brugt til at beregne og analysere HR-værdien, begge viste, at høje niveauer af GRP75 er signifikant forbundet med dårlige patientresultater. Den samlede HR var 1,91 (95 procent CI 1,62 til 2,25), med heterogenitet (I'=0.0 procent,p =0.559)(fig. 7A). Derefter lavede vi en undergruppeanalyse, som viste, at ekspressionsniveauet af GRP75 i gastrointestinal cancer (poolet HR var 1,99,95 procent CI 1,64 til 2,43), har en signifikant sammenhæng med dårlig overlevelsesprognose. Ganske vist blev lignende resultater også fundet i andre tumorer (poolet HR var 1,74,95 procent CI 1,29 til 2,33) (fig. 7B). Begge

Beggs tragtplot og Eggers test blev brugt til at vurdere de inkluderede undersøgelsers mulige publikationsbias. I analysen af ​​sammenhængen mellem GRP75 og OS var p-værdien af ​​Beggs test og Eggers test 0.0 henholdsvis 76 og 0,024 (fig. 7C og D). Eggers test har dog en højere følsomhed til at evaluere publikationsbias. Trim and fill metoden blev således brugt til at gøre vores resultater mere troværdige. Som vist i fig. 7E var den justerede HR i modellen med fast effekt 1,785 (95 procent CI 1,530 til 2,081, p.<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Diskussion

I denne undersøgelse brugte vi et af de første kemoterapeutiske midler til patienter med GC, platinlægemidler. Klassisk set kunne platinlægemidler kovalent binde til guanin på DNA-kæden og dermed blokere replikationen og transkriptionen af ​​DNA2. På grund af lægemiddelresistens og uønskede bivirkninger var det påtrængende vigtigt at identificere nye terapeutiske strategier til at vende resistens hos GC-patienter. Derudover udviklede GC-patienter lægemiddelresistens efter at have modtaget adskillige kurser med cisplatin, og vores resultater viste, at SGC7901-celler udviste signifikant resistens over for cisplatin i sammenligning med SGC7901-celler.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) spillede en nøglerolle i reguleringen af ​​initiering og progression af humane kræftformer-7. For nylig var det blevet klart, at GRP75 også havde en afgørende rolle i kemoterapiresistens. "Ud over GRP75 spillede andre varmechokproteiner en kritisk rolle i cisplatinresistens gennem PI3K/AKT/NF-KB og andre veje21-24 Den molekylære mekanisme for GRP75 og cisplatinresistens blev dog sjældent rapporteret. Her viste vores undersøgelse, at GRP75 fremmede antioxidations-/apoptoseevner og ændrede metabolisk omprogrammering, hvilket førte til cisplatinresistens i GC-celler. Vi fandt også, at GRP75 var opreguleret i SGC7901~ celler og i vævsprøver fra patienter, og var korreleret med lægemiddelresistens, pro-overlevelse, vækst og dårlige resultater. I mellemtiden identificerede multivariat analyse, at GRP75 var en uafhængig prædiktor for samlet overlevelse. Desuden indikerede meta-analyse, at en højt niveau af GRP75 viste dårlig prognose inklusive men ikke begrænset til GC, hvilket var meget i overensstemmelse med vores forskning. Alle ovenstående resultater validerede, at målretning af GRP75 kunne forventes at blive en ny tilgang til at vende cisplatinresistensen og forbedre prognosen for GC-patienter.

Under fysiologiske forhold blev celler uundgåeligt udsat for ROS fra eksterne faktorer og intracellulær aerob metabolisme. Som et tveægget sværd var passende ROS vigtige signalmolekyler, der regulerer cellernes normale funktion, mens overdreven ROS førte til apoptose. Derfor eksisterede et præcist antioxidantreguleringssystem i kroppen for at opretholde redoxbalance og apoptotiske procedurer 20. Men i modsætning til fysiologiske tilstande var ROS-niveauer af tumorer generelt signifikant højere end normale kontroller af samme vævsoprindelse, hvilket bestemte eksistensen af ​​en speciel antioxidantsystem i tumorceller, især for lægemiddelresistente tumorceller27-29. Vores resultater bekræftede, at SGC7901CR-celler udviste et relativt højere niveau af ROS i sammenligning med SGC7901-celler, og at GRP75 forhøjede kapaciteten af ​​antioxidation/apoptose. Tumorceller havde en lang historie med metaboliske abnormiteter. Allerede i 1930'erne opdagede Otto Warburg, at tumorceller foretrækker glykolyse. Selv under oxygentilstrækkelige betingelser opretholdt tumorceller stadig høje glykolysehastigheder til ATP-generering. Dette unormale stofskiftemønster blev kaldt "Warburg-effekten"3031. De Warburg-effekt-ledede metaboliske ændringer var for nylig blevet omtalt som metabolisk omprogrammering, og undersøgelser af disse ændringer gav en dybere forståelse af GC-cellernes metabolisme. Det var blevet påvist, at GC-celler og normale celler udviste metaboliske forskelle, ikke kun i glukosemetabolismen, men også i metabolismen af ​​lipider og aminosyrer³2-35. I denne forskning fandt vi ud af, at ændringer i glukosemetabolismen var en af ​​kernerne forbindelser, der opretholder cellevækst, hvilket i sidste ende fører til GC-cisplatinresistens.

Som vi nævnte, var klassiske onkogener og signalveje som PI3K/AKT, HIF-la og c-myc direkte eller indirekte involveret i metabolisk omprogrammering. Aktivering af PI3K/AKT-vejen i tumorceller forbedrede mange af de metaboliske aktiviteter. For det første tillod det celler at optage glukose, aminosyrer og andre næringsstoffer. For det andet øgede AKT glykolyse og laktatproduktion via dens virkninger på genekspression og enzymaktivitet og var tilstrækkelig til at inducere en War-burg-effekt i kræftceller. For det tredje øgede aktivering af denne vej biosyntesen af ​​makromolekyler og stimulerede ekspressionen af ​​lipogene gener og lipidsyntese'7. Ydermere inhiberede GRP75-aktiveret AKT og ekstracellulære signalregulerede proteinkinaser 1 og 2 Bax-konformationelle ændringer og apoptose 8. Tumorceller tilpasset til hypoxi, der involverer metabolisk omprogrammering via opregulerende HIF-la-målgener for at stimulere glukoseoptagelse, glykolyse, produktion og sekretion af mælkesyre, glykogenlagring, glutamin kat-abolisme³ og fremme akkumulering af triglycerider i lipiddråber³. For nylig var det blevet klart, at GRP75 kunne binde specifikt til HIF-la og målrette den ydre mitokondriemembran, forbundet med VDAC1 og HK2, som forhindrede apoptose'. C-myc kunne mediere metabolisk omprogrammering på en række måder, og c-myc-medieret metabolisk omprogrammering blev stort set opnået ved at påvirke mitokondrier. På den ene side fremmede c-myc også glykolyse ved direkte at regulere ekspressionen af ​​glykolytisk-relaterede enzymer, herunder LDHA, HK2 og PDK11938. På den anden side fremmede c-myc-aktiverede enzymer involveret i glutaminmetabolisme via transkription udnyttelsen af glutamin af mitokondrier i tumorceller. Denne effekt kaldes "glutaminolyse". Desuden reducerede GRP75-overekspression Cyclin-B1 og opregulerer Cyclin-D1 og c-myc for at fremme ovariecancercellevækst*. Baseret på vores nuværende resultater gav vi en ny forståelse af GC-cisplatinresistens gennem GRP75 som et potentielt vigtigt led i reguleringen af ​​tumormetaboliske omprogrammeringsnetværk.

Konklusioner

Som konklusion viste vi, at overekspression af GRP75 kunne fremme overlevelse/vækst i GC-celler ved at regulere antioxidation/apoptose og metaboliske omprogrammeringsnetværk og derved inducere cisplatin-resistens

Materialer og metoder

Celler, reagenser og dyrkningsbetingelser

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 procent renhed), blev købt fra Sigma-Aldrich (Shanghai, Kina). Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Gibco, Grand Island, NY, USA), suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin (Gibco) og inkuberet i 5 procent CO2 ved 37 grader. Til vedligeholdelse af cisplatin-resistensfænotypen blev SGC7901CR-celler inkuberet i et medium indeholdende cisplatin (5μM).

Xenografts og behandlinger

Denne undersøgelse blev godkendt af Nanjing Medical University Institutional Animal Care and Use Committee, og dyrene blev behandlet humant og med hensyn til lindring af lidelse. De nøgne BALB/c-mus blev opnået fra SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, Kina) og holdt konventionelt som vi beskrev tidligere*l. Til xenograft-undersøgelsen blev 2 x 10 grader SGC7901CK-celler i 100 ul matrigel injiceret subkutant i flankerne af musene i 5 uger. For at bestemme virkningerne af GRP75 på cisplatinresistensen af ​​GC udførte vi den intratumorale og intraperitoneale injektionsanalyse. Kort fortalt blev mus tilfældigt opdelt i 4 grupper (5 mus pr. gruppe): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK＋cisplatin og (4） GRP75 KD＋cisplatin. 100 ul siRNA (si-Con eller si-GRP75, 100 nM) var intratumorale injektioner hver 3. dag. Grupperne udsat for cisplatin (5 mg/kg) terapi var intraperitoneale injektioner 3 gange om ugen, og de andre grupper blev perfunderet med et lige så stort volumen saltvand. Tumorer blev målt hver uge, og deres volumener blev beregnet ved hjælp af formlen: V=Y (bredde2 længde). Efter 5 uger blev musene aflivet, og tumorvæv blev fjernet til yderligere undersøgelse.

Patienter og vævsprøver

Denne undersøgelse blev godkendt af den medicinske etiske komité på det andet tilknyttede hospital, Nanjing Medical University og det tilknyttede Changzhou nr. 2-hospital ved Nanjing Medical University, og deltagerens skriftlige informerede samtykke blev indhentet fra hver patient. De klinisk-patologiske data blev opført i supplerende tabel S1. Vævsmikroarrayet blev konstrueret af Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, Kina), som vi tidligere har beskrevet*

Celletransfektion

Til transfektion, scrambled og pcDNA-3.1-GRP75-Flag blev syntetiseret af General Biotech (Shanghai, Kina); mens siRNA'er var opført i supplerende tabel S2. Celler blev forbigående transficeret via lipofectamine 3000-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev celler udpladet på 6-brøndsplader med en tæthed på 1×10 graders celler i RPMI 1640-medium indeholdende 10 procent FBS uden antibiotika. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne forbigående transficeret med 5 ng/ml forvrænget eller GRP75-Flag eller 20 nM si-Con eller si-GRP75 i 12 timer. Efter transfektion blev cellerne dyrket i et frisk medium suppleret med 10 procent FBS i yderligere 24 timer, før de blev brugt til andre eksperimenter.

Kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qPCR) De anvendte primere blev opført i supplerende tabel S3. Isoleringen af ​​totalt RNA, transkriptionen af ​​RNA til cDNA og ydeevnen af ​​qRT-PCR med Applied Biosystems 7300HT-maskine var alle i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse 2. -actinet blev amplificeret for at sikre cDNA-integritet og for at normalisere ekspression. Foldændringer i ekspression af hvert gen blev beregnet ved en sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode ved hjælp af formlen 2-(4ACt)

Denne artikel er uddraget af Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w