Fisetin dæmper lipopolysaccharid-inducerede inflammatoriske reaktioner i makrofager

For mere information, kontakttina.xiang@wecistanche.com

Adskillige undersøgelser har rapporteret polyphenolers effektivitet og sikkerhed i menneskers sundhed; verifikationen af ​​deres effektivitet er dog stadig utilstrækkelig. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om fisetin, en af ​​de flavonoider, der er udbredt i frugt og grøntsager, kunne undertrykke lipopolysaccharid-(LPS-)-induceretinflammatoriskreaktioner i makrofager. LPS øgede proinflammatorisk mRNA-overflod (MCP 1, IL-1ß og iNOS), men blev undertrykt af fisetin. Forøgelsen af ​​nitrogenoxid af LPS, en oxidativ stressfaktor, blev svækket af fisetin. Derudover blev LPS-forstærket phosphorylering af mitogenaktiveret proteinkinase (ERK og JNK) reduceret. Endelig dæmpede fisetin udtrykket eller aktiviteten af ​​uPA, uP AR, MMP-2 og MMP-9, som er kendt som associerede faktorer for makrofagrekruttering eller -infiltration. Afslutningsvis,fisetiner et lovende terapeutisk middel til makrofag-relaterede inflammationssygdomme, såsom sepsis og åreforkalkning.

Klik her for at få flere oplysninger.

1. Introduktion

Den terapeutiske brug af naturlige komponenter har fået mere opmærksomhed i de sidste 2 årtier. Baseret på deres store effektivitet og lave toksicitet er 40 procent af FDA-godkendte terapeutiske midler naturligt baserede komponenter eller deres derivater [1]. Toksicitet forbundet med andre lægemidler er med succes blevet forhindret af forskellige naturlige produkter [2]. Det er derfor meget vigtigt og betydningsfuldt at udforske planteafledte naturlige forbindelser yderligere.

Polyfenolerer plantens sekundære metabolitter og er meget til stede i fødevarer og drikkevarer af vegetabilsk oprindelse, frugt, grøntsager, krydderier, te og vin. Selvom de ikke betragtes som essentielle mikronæringsstoffer, viser flere slags litteratur deres gavnlige virkninger på menneskers sundhed, især i diæter, der er forbundet med højt forbrug af frugt og grøntsager [3-5]. Adskillige undersøgelser er blevet udført over årtier til undersøgelse for farmakologiske virkninger af polyphenoler, hvilket tyder på fordele for sundheden. Voksende beviser har vist, at nogle få polyfenoler besidderanti-inflammatoriskejendomme

[6-8]. Derudover har nyere undersøgelser vist, at flere slags polyfenoler kan hæmme regulatoriske enzymer eller transkriptionsfaktorer, der er involveret i inflammation [9].

Kost påvirker forskellige stadier af inflammation og viser en vigtig indvirkning på flere inflammatoriske sygdomme[10,11]. Inflammation spiller en nøglerolle i udviklingen af ​​sygdomme som diabetes, astma, hjerte-kar-sygdomme og kræft [12]. Derfor kan kontrol af inflammation forhindre disse sygdomme. Da makrofager er vigtige mediatorer af inflammation, har de forskellige funktioner i vævshomeostase og inflammation. Således er midler, der effektivt modulerer deres funktioner, af stor klinisk værdi, eftersom afvigende aktivering af makrofager kan forårsage skadelige immunresponser. Aktuelle forskningstendenser indikerer klart, at naturlige produkter er en af ​​de vigtigste kilder til nye lægemidler [13].

Én polyphenol, isetin (3,3',4',7-tetrahydroxyflavon), er rigt indeholdt i jordbær, æble, tomat, løg, appelsin, fersken, vindrue, kiwi, persimmon, te og vin [14] . Hidtil har fisetin rapporteret stærk anti-inflammatorisk [15-17],

antioxidant [18], antitumorigen[19,20, antiangiogen [21], antidiabetisk [22], neurobeskyttende [23] og kardiobeskyttende virkninger [24] både i cellekultur og i dyremodeller, der er relevante for menneskelige sygdomme. Selvom fisetin har mange fysiologiske virkninger, er dets virkning på makrofager ikke meget rapporteret.

I nærværende undersøgelse undersøgte vi de gavnlige virkninger af fisetin på det inflammatoriske respons af makrofager aktiveret aflipopolysaccharid(LPS).

2. Materialer og metoder

2.1. Isolering af residente peritoneale makrofager.

BALB/c-mus blev opnået fra Institute of Medical Science ved University of Tokyo og holdt i Animal Resource Center på Okayama University. Alle dyreforsøg blev udført for at overholde NIH-retningslinjerne (Guide for Care and Use of Laboratory Animals). Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Ethics Review Committees for Animal Experimentation ved Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry, and Pharmaceutical Sciences (OKU-2018449). Alle mus blev holdt i en barrierefacilitet og fodret med en normal laboratoriefoder. Han- og hun-BALB/c-mus, 16±4 uger gamle, blev bedøvet med isofluran og aflivet via cervikal dislokation. Makrofager blev høstet via peritoneal lavage under anvendelse af saltvand (5 ml). Den peritoneale skylleopløsning blev centrifugeret ved 1500 rpm i 5 minutter. Sedimentet blev suspenderet i en lille DMEM (SIGMA, Kat. Nr. D6046). Røde blodlegemer blev lyseret under anvendelse af en opløsning af ammoniumchlorid. Antallet af makrofager blev beregnet ved hjælp af et hæmocytometer, derefter resuspenderet i DMEM indeholdende varmeinaktiveret FBS (10 procent vv), penicillin (10 U/mL) og streptomycin (10 mg/ml) og udpladet i 6-brønd plader (Corning Incorporated, kat. nr. 3516) [25,26].

2.2. Cellekulturbetingelser.

Efter serumsult natten over blev makrofager inkuberet med udvalgte koncentrationer af fisetin (10, 30 og 100 μM; SIGMA, kat. nr. F4043) eller vehikel i 3 timer og inkuberet i nærvær eller fravær af LPS(10ng/ml; SIGMA, kat.nr. L4391) i et passende tidsrum. Derefter blev mediet og cellerne opsamlet. Mediet blev brugt til nitrogenoxid (NO) assay og gelatine zymografi. Cellelysater blev brugt til kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og western blotting.

2.3. Polymerasekædereaktion i realtid.

mRNA'er blev ekstraheret fra makrofager under anvendelse af RNeasy Mini Kits (QIAGEN, kat. nr. 74104). Omvendt transkription blev udført under anvendelse af et iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, kat. nr. 1708891). qPCR blev udført med et ABI Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems, QuantStudio 3) under anvendelse af en Fast SYBR Green Real-time PCR Mixture (Applied Biosystems, Cat. No. 4385612)[27). Primere for monocyt kemotaktisk protein 1(MCP-1)(Takara Bio Inc., kat.nr. MA066003), interleukin 1 beta(IL-1)(Takara Bio Inc., kat.nr. MA025939), inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS)(Takara Bio Inc, Kat. nr. MA083369), matrixmetalloproteinase-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., Kat. nr. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., Kat. nr. MA031311), og 18S ribosomalt RNA(18S) (Takara Bio Inc., Kat. nr. MA050364) var kommercielt tilgængelige. Hver prøve blev normaliseret til værdier for 18S mRNA-ekspression (AACT-metoden) [27].

2.4. Nitrogenoxidanalyse.

De individuelle cellekultursupernatanter blev opsamlet og centrifugeret 10 minutter ved 14,000rpm ved 4 grader. Derefter blev supernatanten anvendt til nitrogenoxid (NO) assayet. NO-analysen blev udført som beskrevet i de kommercielt tilgængelige kits (BioAssay Systems, Kat. Nr. D2NO-100). BioAssay Systems' QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit er et kolorimetrisk assay til bestemmelse af NO-produktion efter reduktion af nitrat til nitrit ved brug af den forbedrede Griess-metode.

2.5. Western Blotting.

Helcelleproteiner blev ekstraheret fra makrofager under anvendelse af en lysisbuffer (Cell Signaling, Cat. No. 9803). Hver prøve blev påført i 10 procent SDS-PAGE og overført til en polyvinylidenfluoridmembran, immunoblottet med primære antistoffer (phosphoryleringen af ​​den ekstracellulære signalregulerede kinase(p-ERK); Cell Signaling, Cat. No. 9101, phosphoryleringen af c-Jun N-terminal kinase(p-JINK); Cell Signaling, kat.nr. 9251, urokinaseplasminogenaktivatoren(uPA); Abcam, kat.nr.

ab20789, urokinaseplasminogenaktivatoren og receptoren (uPAR); R&D, kat.nr. AF534 og -actin; Sigma kat. nr. A5441)[28]. Membraner blev derefter inkuberet med passende sekundære antistoffer, og immunkomplekser blev visualiseret på kemiluminescens (Merck Millipore, Kat. nr. WBLUF0100, Kat. nr. WBLUC0100) og kvantificeret ved hjælp af en General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini)[29].

2.6. Gelatine Zymografi.

Cellekultursupernatanter blev opløst under ikke-reducerende betingelser ved hjælp af SDS-PAGE (10 procent vægt/vol) polymeriseret i nærværelse af gelatine (0,1 procent vægt/vægt) for at evaluere aktiviteterne af MMP{ {4}}. Geler blev vasket med Triton X-100(2,5 procent vol/vo) i 60 minutter og destilleret vand i 15 minutter to gange. Geler blev derefter inkuberet natten over ved 37 grader Cin 50mM Tris-buffer indeholdende calciumchlorid(5mM)pH8.0. Efter inkubation blev geler farvet med Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, kat.nr.{ {18}}) i 30 minutter ved stuetemperatur, derefter efterfulgt af affarvning med Coomassie Brilliant Blue R-250 affarvningsopløsning (Bio-Rad, kat.nr.161-0438), indtil der fremkom klare bånd. Gelbilleder blev kvantificeret ved anvendelse af en General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); de ufarvede, gennemskinnelige fordøjede regioner repræsenterede områder med MMP-aktivitet [30].

2.7. Statistikker.

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, Californien, USA). Data præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdien. Statistisk signifikans mellem flere grupper blev vurderet ved en- eller to-vejs variansanalyse efterfulgt af Holm-Sidak post hoc test eller Student-Newman-Keuls post hoc test. pværdi<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultater

3.1. Fisetin svækkede inflammatoriske mediatorer i makrofager stimuleret med LPS.

Da aktiverede makrofager producerer proinflammatoriske cytokiner og inflammatoriske mediatorer såsom NO[8], undersøgte vi virkningerne af fisetin på inflammatoriske mediatorer i makrofager stimuleret med LPS. For det første, for at undersøge, om fisetin udøver den antiinflammatoriske effekt på transkriptionsniveau, bestemte vi mRNA A-ekspressionsniveauer af inflammatoriske gener såsom MCP-1, IL-1 og iNOS (figur 1(a) ). Som forventet blev ekspressionerne af disse inflammatoriske gener undertrykt af fisetin på en dosisafhængig måde. For at bekræfte, om fisetin undertrykker inflammatorisk respons i makrofager, evaluerede vi dets evne til at undertrykke NO-produktion i LPS-behandlede makrofager (figur 1(b)). Som forventet reducerede fisetin produktionen af ​​NO på en dosisafhængig måde.

3.2. Fisetin-reduceret mitogen-aktiveret proteinkinase i makrofager stimuleret med LPS.

Da fisetin blev rapporteret at hæmme mitogenaktiverede proteinkinase(MAPK)-veje i forskellige celletyper [31, 32], undersøgte vi virkningerne af fisetin på MAPK'er i makrofager. Først blev aktivering af MAPK'er induceret af LPS i makrofager observeret (figur 2(a)). Stigningen i p-ERK ved LPS toppede ved 15 minutter efter stimulering, mens stigningen af ​​p-JNK ved LPS toppede ved 30 minutter. I de efterfølgende forsøg blev makrofager således stimuleret med LPS i 30 minutter. Samtidig behandling med fisetin reducerede signifikant LPS-induceret forstærkning af p-ERK og p-JNK (figur 2(b) og 2(c)).

3.3. Fisetin Reduceret uPA og uPAR i makrofager stimuleret med LPS.

Makrofageaktivering er tæt korreleret med cellernes invasivitet. Derudover bidrager uPA og uPAR i makrofager til infiltration af celler. Således blev virkningen af ​​fisetin på ekspressionen af ​​uPA og uPAR undersøgt. LPS inducerede proteinoverfloden af ​​uPA (figur 3(a)) og uPAR (figur 3(b)). Samtidig behandling af fisetin reducerede stigningen af ​​uPA (figur 3(a)) og uPAR med LPS (figur 3(b)).

3.4. Fisetin-reduceret MMP-2 og MMP-9 i makrofager stimuleret med LPS.

For at belyse effekten af ​​fise-tin på MMP'er undersøgte vi desuden MMP-2 og MMP-9 udtryk, downstream mediatorerne af uPA/uPAR. Med hensyn til mRNA-niveauet øgede LPS signifikant MMP-2- og MMP-9-mRNA-ekspression sammenlignet med vehikelbehandlingen (figur 4(a)). Fisetin reducerede forøgelsen af ​​disse genekspressioner af MMP-2 eller MMP9 induceret af LPS på en dosisafhængig måde (figur 4(a)). Desuden blev proteinaktiviteterne af MMP-9 evalueret ved hjælp af zymografi (figur 4(b)). Proteinaktiviteterne af MMP-9(92kDa) blev øget ved LPS-stimulering, som blev reduceret af fisetin (figur 4(b)).

4. Diskussion

Vi fandt en vigtig effekt af fisetin mod betændelse i makrofager. Den nuværende undersøgelse viste, at fisetin svækkede induktionen af ​​inflammatoriske komponenter såsom MCP-1, IL-1, iNOS og NO, induceret af LPS i makrofager. Derudover undertrykte fisetin aktiveringen af ​​MAPK og svækkede den LPS-inducerede stigning af uPA- og uPAR-ekspression. Desuden svækkede fisetin stigningen i mRNA-overflod af MMP-2 og MMP-9 og aktiviteten af ​​MMP-9.

Ved sepsis forårsaget af gram-negativ infektion er LPS almindeligvis anerkendt som årsagen til sepsis. I mange undersøgelser er LPS blevet brugt som en model for sepsis såvel som inflammation. Desuden inducerer kronisk inflammation tidlig cancer ved aktivering af inflammatoriske celler og ukorrekt produktion af en proinflammatorisk mediator som iNOS og transkriptionsfaktorer som den nukleare transkriptionsfaktor kappa B (NF-xB)[33]. Desuden er det også blevet rapporteret, at oxidativ stress reduceres ved at dæmpe udtrykket af iNOS [34]. Vores undersøgelse viste, at fisetin kan være effektiv til forebyggelse og behandling af sepsis og septisk shock på grund af den undertrykkende effekt på mRNA-overflod af pro-inflammatoriske gener og produktionen af ​​NO. I denne undersøgelse undertrykte fisetin NO-produktion ved at reducere ekspressionen af ​​mRNA fra det proinflammatoriske gen (iNOS); derfor var det sandsynligt, at fisetin svækkede oxidativt stress. Følgelig understøttede disse resultater de antiinflammatoriske, antitumorigene og antioxidante virkninger af fisetin.

Adskillige undersøgelser har rapporteret, at LPS inducerede phosphoryleringen af ​​MAPK'er, herunder ERK og JNK [35]. Derudover er det blevet rapporteret, at fisetin hæmmer migration og invasion af humane cervikale celler ved at nedregulere uPA-ekspression gennem undertrykkelse af MAPK[36]. -fager, er få rapporter tilgængelige om effekten af ​​fisetin på ekspressionen og aktiviteten af ​​uPA og uPAR. Vores undersøgelse viste for første gang, at fisetin undertrykte ekspressionen af ​​uPA og uPAR induceret af LPS ved at undertrykke MAPK-signalering i makrofager, som tidligere rapporteret i cancerceller.

MMP'er er en familie af proteaser, hvis udtryk er relateret til visse processer, såsom udvikling, fysiologi og patologi. Til fælles er MMP-9 blevet anerkendt som en markør for forskellige inflammatoriske sygdomme, såsom aterosklerose, gigt og systemisk lupus erythematosus [37]. Derudover var MMP-9 tæt forbundet med cellemigration [38,39]. Adskillige undersøgelser har især rapporteret, at MMP-2 og MMP-9 er involveret i aterogenese og spiller en vigtig rolle i stabiliseringen af ​​aterosklerotiske plaques 40-42]. På dette punkt tyder vores resultater på, at inhibitorer af MMP-9 kan give løfte som en terapeutisk tilgang til stabilisering af sårbare plaques. Desuden har nyere undersøgelser vist, at sårheling i huden er svækket af overdreven aktivering af MMP-9 [43]. Derfor blev det foreslået, at fisetin også har potentiale som en terapeutisk tilgang til heling i huden. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at belyse dens detaljer om molekylære mekanismer.

En nylig tendens i medicinalindustrien er at opdage strategier til at udvikle selve den naturlige plante som det nye lægemiddel. Faktisk har to nyere dyreforsøg vist, at LPS-induceret akut lungebetændelse og kollagen-induceret arthritis blev forbedret ved fisetinbehandling |32,44. En anden ex vivo undersøgelse viste også, at fisetin var i stand til at dæmpe LPS-induceret cytokinfrigivelse fra leukocytter fra patienter med kronisk obstruktiv lungesygdom eller type 2 diabetes[45]. Mange immunsuppressive lægemidler er blevet udviklet til at dæmpe inflammatoriske og autoimmune sygdomme[46-50]; ikke desto mindre udviser de fleste forbindelser betydelige bivirkninger. Da polyfenoler almindeligvis er til stede i kostens frugter og grøntsager, kan de formodentlig være sikrere immunsuppressive midler [51, 52]. Frugt og grøntsager indeholder en bred vifte af fytokemikalier, herunder sesquiterpenlaktoner, terpenoider, polysaccharider og phenolforbindelser. Vores resultater, der viser fisetins anti-inflammatoriske, antitumorigene og antioxidante virkninger, indikerer kraftigt, at det kan udvikles som et nyt lægemiddel. Selvom fisetin er en lovende kandidat til immunterapi, skal potentialet for naturlige produkter indeholdende fisetin som et terapeutisk middel mod en bestemt sygdom verificeres yderligere i det kliniske miljø.

5. Konklusioner

Den nuværende undersøgelse viste, at fisetin svækkede stigningerne påinflammatoriskgener (MCP-1, IL-1b og iNOS), produktionen af ​​NO og phosphoryleringen af ​​MAPK,uPA, uPAR og MMP'er, induceret af LPS i makrofager. Disse resultater antydede, at fisetin kan være et terapeutisk middel til adskillige makrofag-relaterede sygdomme.