Fine partikler 2.5 opregulerer melanogenese i A375 humane melanomceller
Jul 19, 2023
Til redaktøren: Epidemiologiske undersøgelser har vist, at eksponering for fine partikler 2.5 (PM2.5) øger risikoen for hudhyperpigmentering.[1] En nylig undersøgelse viste, at PM2.5 kunne inducere melanogenese ved at regulere tyrosinase (TYR) og tyrosinase-relateret protein 1 (TYRP1) og 2 (TYRP2) ekspression via aryl carbonhydrid receptor (AhR)/mitogen-aktiveret protein kinase signalering aktivering.[ 2] AhR er udbredt i hudceller og dens ligering kontrollerer oxidation/antioxidation, epidermal barrierefunktion, foto-induceret respons, medfødt immunitet og melanogenese. Det kan aktiveres af dioxin og polycykliske aromatiske kulbrinter (bestanddelene af PM2.5), og dets aktivering inducerer transkriptionen af gener, der koder for både fase I og fase II xenobiotiske metabolismeenzymer (cytokromer P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 og CYP1B1). [3,4] BaP og farlige dioxiner aktiverer AhR med generering af robuste reaktive oxygenarter (ROS), som i det mindste delvist medieres af CYP1A1. Desuden er CYP1A1-medieret oxidativt stress ansvarlig for produktionen af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom interleukin (IL)-1, IL-6 og IL-8 i miljøet kontaminant-behandlede humane keratinocytter.[3,5] Der er dog meget få undersøgelser af de toksiske virkninger af PM2.5 på melanogenetiske celler. Heri behandlede vi humane melanomceller A375 med forskellige koncentrationer af PM2.5 for at undersøge, om PM2.5 kan fremme melanogenese og dets forhold til AhR-signalering, oxidativt stress og inflammatorisk respons.
Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på spermmembranfunktionen. Cistanche-polysaccharider kan øge aktiviteten af SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescerende mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og har evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikal-induceret kollagen-nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin frie radikaler.
Klik på Cistanche Tubulosa Supplement
【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2.5 blev indsamlet om vinteren (fra december til januar) i Beijing. HY-1000 intelligent storstrømsprøvetager til total suspenderede partikler (TSP) (valgfri PM2.5-skærer, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Kina) blev brugt til prøveudtagning af kvartsfilter. Kvartsmembranen blev nedsænket i 75 procent ethanol efterfulgt af ultralydsrystning. Sterilt vand blev brugt til at fremstille en højkoncentreret stamopløsning. Humane melanomceller A375 blev dyrket i 5 procent CO2 ved 37 grader i almindeligt Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, USA) indeholdende føtalt bovint serum (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). A375-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af PM2.5 (0, 100, 200 og 400 ug/mL) i 24 timer, og cellerne blev brugt til følgende undersøgelser. Ikke-parret Students t-test og envejsvariansanalyse blev brugt til statistisk analyse, og P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
For at undersøge indflydelsen af PM2.5 på A375-celler blev celleproliferation påvist ved hjælp af et CCK-8-kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og celleapoptose blev påvist ved hjælp af Annexin V fluorescein isothiocyanat/ propidiumiodid (FITC/PI) apoptosekit (Multisciences, USA), baseret på producentens instruktioner. Resultaterne indikerede, at PM2.5 udviste koncentrationsafhængig cytotoksicitet over for A375-celler, men ikke påvirkede apoptosen [Supplerende figur 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
NaOH-metoden blev brugt til at bestemme melaninindholdet. De PM2.5-behandlede A375-celler blev vasket med phosphatbuffer-saltvand (PBS) og lyseret med vand. Lysaterne blev centrifugeret ved 12, 000 r/min i 5 minutter, vasket med 10 procent trichloreddikesyre (500 ml) (Sigma, St. Louis , MO, USA) og 75 procent ethanol (500 ml) og blev derefter klaret igen. Derefter blev 50 ml 1 mol/L NaOH indeholdende 10 procent dimethylsulfoxid tilsat til pellets i 1 time ved 80 grader. Absorbansen ved 490 nm (OD 490) blev målt under anvendelse af en mikropladelæser. Da TYR er det vigtigste melanogene enzym, detekterede vi derefter TYR-aktiviteten ved hjælp af levodopa (L-DOPA) assay. Seksbrøndsplader (Corning, USA) blev podet med A375-celler ved en tæthed på 3 105 celler/brønd. Cellerne blev derefter vasket med PBS og lyseret med 0,5% natriumdeoxycholat (Sigma). Lysatet blev opdelt i tre grupper, og 0,1 procent L-DOPA (Sigma) blev tilsat til hver prøve. Efter 5 minutter blev OD 490 målt, og 0,1 procent L-DOPA blev anvendt som standard. Vi målte også mRNA- og proteinekspressionsniveauerne for TYR. Total RNA blev ekstraheret under anvendelse af et RNeasy mini-kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Omvendt transkription blev udført ved hjælp af ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO, Japan). Derefter blev kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (qRT-PCR) udført på Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japan). Primerne fra Invitrogen er præsenteret i supplerende tabel 1, http://links. lww.com/CM9/A917, og ekspressionsniveauet for hvert mRNA blev beregnet ved hjælp af 2*DDCT-metoden. Proteinekspressionsniveauerne blev analyseret ved Western blotting. Celler blev vasket med PBS og lyseret i RIPA-buffer (Beyotime, Kina) indeholdende phenylmethylsulfonylfluorid (proteaseinhibitorblanding, 20:1, Sigma-Aldrich). Proteinkoncentrationerne blev målt under anvendelse af et BCA-proteinassay-kit (Beyotime, Kina). Det samlede protein blev kogt ved 70 grader i 10 minutter, adskilt i en 4 procent –12 procent gel ved 200 V i 40 minutter, overført til en membran ved 4 grader ved brug af 120 mA i 75-100 minutter og derefter inkuberet med 5 procent fedtfri mælk i 1 time. Membraner blev derefter probet med anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 og anti-CYP1B1 antistoffer (Abcam) natten over ved 4 grader. Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse IgG-antistof (Proteintech, USA) blev anvendt som et sekundært antistof. Resultaterne indikerede, at PM2.5 øgede melaninindholdet og TYR-aktiviteten på en dosisafhængig måde. Både mRNA- og proteinekspressionsniveauer af TYR blev opreguleret [Supplerende figur 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 kan opregulere TYR-aktivitet ved at aktivere AhR-vejen. For at bestemme, om PM2.5 påvirker AhR-signalering, detekterede vi transkriptionsniveauerne af AhR og dets klassiske nedstrømsgener CYP1A1 og CYP1B1 ved qRT-PCR og western blotting. Resultaterne viste, at PM2.5 opregulerede mRNA-ekspressionsniveauerne for AhR og CYP1A1, såvel som proteinekspressionen af CYP1A1 [Supplerende figur 2 E-G, http://links.lww.com/CM9/A917].
AhR-aktivering forårsager ROS-generering, som også kan øge TYR-aktiviteten.[5] Derfor evaluerede vi ROS-produktionen ved hjælp af 20,70 -dichlorfluoresceindiacetat (DCFHDA) og flowcytometri. Efter 24 timers behandling med PM2.5 blev A375-celler inkuberet med DCFH-DA (5 mmol/L) i 30 minutter ved 37 grader i mørke. Celler blev vasket to gange i PBS, og fluorescensen blev målt med et flowcytometer. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet blev kvantificeret ved hjælp af FACS Diva 6.0-softwaren (BD Bioscience, New York, NY, USA). Da CYP1A1-induceret ROS-produktion menes at være ansvarlig for det inflammatoriske respons,[5] mRNA-ekspressionsniveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} og tumornekrosefaktor [TNF]-a) blev målt. Det blev fundet, at PM2.5 øgede ROS-produktion, såvel som IL-1a, IL-6 og IL-8 mRNA-niveauer i A375-celler [Supplerende figur 2 H og I, http ://links. lww.com/CM9/A917].
Resultaterne af denne undersøgelse indikerede, at PM2.5 fremmede melanogenese og øgede både aktivitet og ekspression af TYR i A375-celler. Desuden kunne PM2.5 aktivere AhR-signalering og inducere oxidativt stress og inflammatorisk respons, som kan være en melanogen signaleringskaskade, der er ansvarlig for hyperpigmentering.
Anerkendelser
Vi udtrykker vores oprigtige tak til følgende: Prof. Dr. Masutaka Furue og Prof. Dr. Tsuji Gaku fra Kyushu Universitetshospital, som forbedrede manuskriptet og hjalp med AhR-relaterede oplysninger. Vi er også taknemmelige for den engelske redigering leveret af prof. Dr. Robert Schwartz fra Rutgers New Jersey Medical School.
Finansiering
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (nr. 2101000271).
Interessekonflikt
Ingen.
Referencer
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Eksponering for fine partikler forbundet med senil lentigo hos kinesiske kvinder: en tværsnitsundersøgelse. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. Partikler fremmer hyperpigmentering via AhR/MAPK-signalaktivering og ved at øge a-MSH parakrine niveauer i keratinocytter. Environ Pollut 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. PM2.5's potentielle rolle i melanogenese. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Aryl-carbonhydridreceptor (AhR) et muligt mål til behandling af hudsygdomme. Med Hypoteser 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Indvirkning af luftbårne partikler på huden: en systematisk gennemgang fra epidemiologi til in vitro undersøgelser. Del Fiber Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
