Ekstraktion, fysisk-kemiske egenskaber, anti-aldring og antioxidantaktiviteter af polysaccharider fra industrielle hamprester, del 1

Abstrakt: En stor mængde hamppolysaccharider forbliver i industrielle hamprester (IHR) efter cannabidiolekstraktion, hvilket resulterer i spild af ressourcer. Derfor er den systematiske undersøgelse af hamppolysaccharider gavnlig for udviklingen af ​​IHR i fremtiden. I denne undersøgelse blev udvindingen af ​​industrielle hamprester polysaccharider (IHRP'er) optimeret ved et enkeltfaktoreksperiment og ortogonalt eksperimentelt design. De optimale opvarmningsekstraktionsbetingelser var ekstraktionstemperatur 98 ◦C, faststof-væske forhold 1:10, ekstraktionstid 1 time, antal successive ekstraktioner ved 2 og pH ved 4. Ekstraktionsforholdet og polysaccharidindholdet var 20,12 ± 0,55 procent og 12,35 ± 0,26 procent ved betingelserne. Desuden var de bedste alkoholudfældningsbetingelser pumpning med 2 L/h, konstant omrøring og is-vandbad i 4 timer. De rå IHRP'er blev yderligere oprenset ved søjlekromatografi, og polysaccharid/proteinindholdet af oprensede IHRP'er var 34,44 procent og 1,61 procent. IHRP'er bestod hovedsageligt af ti monosaccharider og nogle ikke-sukkerkomponenter, herunder organiske syrer, flavonoider, steroider og glycosider. FT-IR demonstrerede polysaccharidskelettet af IHRP'er. Desuden var DPPH- og ABTS-opfangningshastighederne for IHRP'er 76,00 procent og 99,05 procent ved koncentrationerne på 1 mg/ml. IHRP'er kunne fremme epidermal celleproliferation og heling af celle ridser. I mellemtiden kunne IHRP'er fremme ekspressionen af ​​anti-aging-relaterede gener. Samlet set kunne IHRP'er være en ønskværdig naturlig kilde til antioxidanter og anti-aldringsprodukter i mange aspekter.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på spermmembranfunktionen. Cistanche-polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescerende mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og kan opfange reaktive oxygenarter, forhindre frie radikal-induceret kollagennedbrydning og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin fra frie radikaler.

Klik på rou cong rong fordele

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nøgleord: industriel hamp; polysaccharid; udvinding; antioxidant aktivitet; anti-aging aktivitet

1. Introduktion

Hamp (Cannabis sativa L.), en årlig urt fra Cannabis-familien, er blevet brugt i tusinder af år [1]. Indholdet af tetrahydrocannabinol (THC) i industriel hamp er mindre end 0,3 vægtprocent, hvilket er forskelligt fra medicinsk marihuana og rekreativ marihuana [2,3]. Derfor kunne industrihamp lovligt dyrkes i stor skala. Den kemiske sammensætning af industriel hamp er meget kompleks, herunder cannabinoider, terpenoider, alkaloider og flavonoider [4]. De mest bioaktive forbindelser er cannabinoider, der omfatter mere end 130 terpenphenolforbindelser, som hovedsageligt akkumuleres i blomstertoppene [5]. De vigtigste cannabinoider er THC, cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN), cannabigerol (CBG), cannabidivarin (CBDV), cannabidiol (CBT) og cannabicyclol (CBL) [6]. Blandt dem er THC, en psykoaktiv forbindelse, der er begrænset i forskellige lande, og CBD de mest undersøgte cannabinoider for deres betydelige bioaktiviteter [7], såsom neurobeskyttende, antiepileptiske, anticancer og immunregulerende aktiviteter [8]. Eksistensen af ​​disse forbindelser øger vigtigheden af ​​industriel hamp. På nuværende tidspunkt er industriel hamp blevet meget brugt inden for daglige kemikalier, materialer, energi og medicin [9]. Den nuværende behandling af industrielle hamprester (IHR) kasserer dem direkte, hvilket ikke kun forurener miljøet, men også forårsager spild af ressourcer [10].

Polysaccharid er en polymer, der består af mere end 10 monosaccharider [11]. Det er et af de mest essentielle biologiske makromolekyler. I de senere år har mange artikler rapporteret, at de naturlige polysaccharider fra planter har gode biologiske aktiviteter, herunder anticancer [12], anti-inflammatoriske [13], antioxidant [14], immunmodulerende [15], hypoglykæmiske [16] og antivirale aktiviteter [17]. Den molekylære sammensætning og rumlige struktur af polysaccharider har generelt betydelige effekter på deres egenskaber og aktiviteter [18]. Med udviklingen af ​​separations-, oprensnings- og strukturanalyseteknologi af polysaccharider er det generelt accepteret, at polysaccharider har store anvendelsesværdier inden for lægemiddel-, kosmetik- og fødevareområder [19]. Indholdet af polysaccharider fra industrielle hamprester er omkring 10 procent –15 procent. Hamppolysaccharider har mange fremragende fysisk-kemiske egenskaber, fordi de indeholder masser af hydrofile hydroxyler, såsom stærk vandabsorptionsevne, emulgerende egenskaber og god filmdannende evne. I mellemtiden har hamppolysaccharider fugttilbageholdelse, antibakterielle og ikke-toksiske virkninger. Derfor har de omfattende anvendelsesmuligheder på kosmetikområdet. De fermenterede produkter af hamppolysaccharider (oligosakkarider eller nogle sukkeralkoholer), som rapporteres at have gode antioxidant-, anti-aldrings- og anti-træthedsaktiviteter, er blevet brugt til at udvikle funktionelle drikkevarer [20]. Sammensætningen af ​​hamppolysaccharider er relativt kompleks, og den spænder fra monosaccharider til 5 × 104 Da polysaccharider.

Der er få rapporter om adskillelse og ekstraktion af hamppolysaccharider. Hillestad et al. isolerede to glykoproteiner fra hamp. Bindingsstrukturen af ​​glucosidekæden og forbindelsen mellem kæden og proteinet blev analyseret ved methylering og Smith-nedbrydning [21]. JW Groce et al. målte kulhydratindholdet i hamp dyrket i henholdsvis USA, Thailand og Vietnam. Det blev påpeget, at der var store forskelle i type og indhold af forbindelser mellem sorterne fra forskellige områder [22]. Zheng et al. analyserede monosaccharidsammensætningen og strukturen af ​​HSP0 og HSP0.2, to komponenter af hampefrøpolysaccharid, ved HPLC og FT-IR. Det blev fundet, at HSP0 og HSP0.2 begge indeholdt sulfatradikaler [23]. Bi et al. opnåede to hampefrøpolysaccharider HS1 og HS2 ved gelfiltreringskromatografi. De vigtigste monosaccharider var D-arabinose, D-xylose, D-mannose, D-galactose og D-glucose, og deres molære forhold var 0.12, 0.09 , 0.15, 0.11 og 0.12 henholdsvis [24]. Guo et al. fremstillede polysaccharider fra industrielle hampblade og undersøgte virkningerne af ultraviolet lys, temperatur og pH på deres antibakterielle aktivitet. Det blev fundet, at den minimale bakteriedræbende koncentration og den minimale hæmningskoncentration af polysacchariderne mod S. aureus var henholdsvis 6,25 og 3,125 mg/ml. Derudover var den antibakterielle aktivitet den højeste, når pH var 7.

I denne undersøgelse blev IHR efter cannabidiolekstraktion brugt som råmateriale til polysaccharidekstraktion. Ekstraktions- og oprensningsprocessen af ​​industrielle hamprester polysaccharider (IHRP'er) blev optimeret. Derefter blev strukturen og sammensætningen af ​​IHRP'er analyseret. Desuden blev ABTS- og DPPH-opfangningsevnen hos IHRP'er evalueret. Dens anti-aldringsaktivitet blev også undersøgt på celleniveau. Det er håbet, at IHRP'er kan bruges i vid udstrækning inden for kosmetik og funktionelle fødevarer.

2. Resultater og diskussion

2.1. Enkeltfaktoreksperimenter med ekstraktion for IHRP'er

2.1.1. Effekter af ekstraktionsmetoder på polysaccharidekstraktion

Virkningerne af perkolationsekstraktion, varmeekstraktion og ultralydsassisteret ekstraktion på polysaccharidekstraktion er vist i figur 1a. Det kunne ses, at polysaccharidindholdet i perkolationsekstraktion var tæt på 0 procent, hvilket indikerede, at næsten intet polysaccharid blev ekstraheret, og ekstraktet hovedsageligt bestod af pigment og andre vandopløselige komponenter. Resultaterne skyldtes, at perkolationsekstraktionen var meget skånsom, og at cellevæggen i IHR ikke blev brudt. Polysacchariderne kunne således ikke ekstraheres fra celler, hvilket medførte, at polysaccharidindholdet og ekstraktionsforholdet ved perkolationsekstraktion var meget lavt. Ekstraktionsforholdet for varmeekstraktion var højere end for ultralydsassisteret ekstraktion. Imidlertid var polysaccharidindholdet i varmeekstraktion (11,27 procent) lavere end ved ultralydsassisteret ekstraktion (13,81 procent). Varmeudvinding er en af ​​de mest anvendte ekstraktionsmetoder på grund af processens enkelhed og lave omkostninger. Opvarmningsudtrækningstiden er dog relativt lang, og udvindingsforholdet er ikke højt. Ekstraktionstemperatur har generelt stor indflydelse på ekstraktionsforholdet. Det højere ekstraktionsforhold for varmeekstraktion i dette arbejde skyldtes, at varmeekstraktionen blev udført ved 98 ◦C, mens den ultralydsassisterede ekstraktion blev udført ved 60 ◦C. Ultralydsassisteret ekstraktion kunne forkorte ekstraktionstiden, fordi kavitationseffekten og den mekaniske effekt kunne ødelægge cellevægge, forbedre penetrationen af ​​opløsningsmidlet og fremskynde overførslen af ​​polysaccharider til opløsningsmidlet [25]. Polysaccharidindholdet i ultralydsassisteret ekstraktion var således højere end ved varmeekstraktion. Varmeekstraktionen blev valgt til følgende eksperimenter givet procesenkelhed og industrialisering.

2.1.2. Effekter af ekstraktionstemperatur på polysaccharidekstraktion

Effekterne af ekstraktionstemperatur på polysaccharidekstraktion blev vist i figur 1b, når faststof-væske-forholdet var 1:10, ekstraktionstiden var 1 time, antallet af successive ekstraktioner var 2, og pH var 7. Ekstraktionsforholdet og polysaccharidindholdet var begge øges med stigningen i temperaturen. Da temperaturen var 98 ◦C, var det højeste ekstraktionsforhold og polysaccharidindhold henholdsvis 14,99 procent og 12,03 procent.

2.1.3. Virkninger af faststof-væskeforhold på polysaccharidekstraktion

Når ekstraktionstemperaturen var 98 ◦C, ekstraktionstiden var 1 time, antallet af successive ekstraktioner var 2, og pH var 7, virkningerne af faststof-væskeforhold på polysaccharidekstraktion blev vist i figur 1c. Ekstraktionsforholdet steg gradvist med faststof-væske-forholdet fra 1:6 til 1:10 og blev derefter glat. Imidlertid var polysaccharidindholdet næsten ikke påvirket af forholdet mellem faststof og væske. Desuden kunne opløsningen bare nedsænke råmaterialet, når forholdet mellem faststof og væske var 1:5 på grund af den lave tæthed af planteblade. Derfor blev forholdet mellem faststof og væske på 1:6 primært undersøgt.

2.1.4. Effekter af pH på polysaccharidekstraktion

Når ekstraktionstemperaturen var 98 ◦C, ekstraktionstiden var 1 time, antallet af successive ekstraktioner var 2, og forholdet mellem faststof og væske var 1:10, blev virkningerne af pH på polysaccharidekstraktion vist i figur 1d. Når opløsningen blev syrnet eller gjort alkalisk gradvist, blev ekstraktionsforholdet i nogen grad forbedret. Polysaccharidindholdet havde dog en faldende tendens med stigningen i pH, hvilket indikerede, at den sure tilstand var gavnlig for ekstraktion af IHRP'er.

2.1.5. Effekter af ekstraktionstid på polysaccharidekstraktion

Når ekstraktionstemperaturen var 98 ◦C, pH var 7, antallet af successive ekstraktioner var 2, og forholdet mellem faststof og væske var 1:10, blev virkningerne af ekstraktionstid på polysaccharidekstraktion vist i figur 1e. Ekstraktionsforholdet faldt let, når ekstraktionstiden oversteg 1 time. Ydermere var polysaccharidindholdet næsten ikke påvirket af de forskellige ekstraktionstider.

2.1.6. Virkninger af antallet af successive ekstraktioner på polysaccharidekstraktion

Når ekstraktionstemperaturen var 98 ◦C, ekstraktionstiden var 1 time, pH var 7, og forholdet mellem faststof og væske var 1:10, blev virkningerne af flere successive ekstraktioner på polysaccharidekstraktion vist i figur 1f. Udvindingsforholdet faldt til 5,11 procent, da råvaren blev udvundet anden gang. Desuden var polysaccharidindholdet meget lavt, da råvaren blev ekstraheret tredje gang.

2.2. Ortogonalt eksperimentelt design af ekstraktion til IHRP'er

It could be seen that extraction temperature, solid–liquid ratio, number of successive extractions, and pH had a great influence on polysaccharide extraction based on the single-factor experiments. Therefore, the orthogonal experiments were carried out to further optimize the extraction conditions. As shown in Table 1, the order of effect of individual factors on polysaccharide extraction was: extraction temperature > several successive extractions>faststof-væske forhold > pH. Gruppe 5 (faststof-væske-forholdet var 1:8, antallet af successive ekstraktioner var 3, ekstraktionstemperaturen var 80 ◦C, og pH-værdien var 4) havde det højeste polysaccharidindhold (12,79 procent), mens gruppe 9 (faststof-væske-forholdet var 1) :10, antallet af successive ekstraktioner var 2, ekstraktionstemperaturen var 98 ◦C, og pH var 4) havde det næsthøjeste polysaccharidindhold (12,26 procent). I betragtning af energiforbruget og driftsevnen blev sammenligningsvalideringen mellem gruppe 5 og 9 udført for at bestemme de mest passende ekstraktionsbetingelser. Som vist i tabel 2 viste de verificerede forsøg, at polysaccharidindholdet mellem gruppe 5 og 9 var meget tæt. For at spare energiforbrug blev ekstraktionsbetingelserne i gruppe 9 således udvalgt til at udvinde IHRP'er til dets anvendelse i følgende eksperimenter: faststof-væske forholdet var 1:10, ekstraktionstemperaturen var 98 ◦C, antallet af successive ekstraktioner var 2, og pH var 4.

2.3. Skærm af IHRPs alkoholudfældningsforhold

IHRPs ekstraktionsopløsningen blev opnået i henhold til ekstraktionsbetingelserne optimeret med 2.2. Virkningerne af forskellige alkoholudfældningsbetingelser blev vist i tabel 3. Sammenlignet med engangstilsætning og omrøring i 0.5 timer, kunne pumpning og omrøring kontinuerligt forbedre polysaccharidindholdet yderligere. Effekten af ​​afkølingshastigheden på polysaccharidindholdet var imidlertid ikke indlysende. Derfor blev alkoholudfældningsbetingelserne for gruppe 4 valgt til fremstilling af IHRP'er.

2.4. Polysaccharidudbytte og kemisk sammensætning af rensede IHRP'er

De rå IHRP'er blev affarvet og oprenset ved henholdsvis aktivkuladsorption, membranfiltrering, søjlekromatografi og separationsmetode. Som vist i figur 2 havde behandlingen med 8 procent aktivt kuladsorption den bedste affarvningseffekt, efterfulgt af søjlekromatografibehandlingen. Desuden havde selvage-metoden og membranfiltrering næsten ingen affarvningseffekt. I betragtning af industrialiseringen og enkelheden af ​​processen blev søjlekromatografi med anionbytterharpiks brugt til at oprense IHRP'er i dette manuskript. Desuden, som vist i tabel 4, var IHRP'ernes vægt 15,26 g, når oprensningen blev udført efter alkoholudfældningen, mens IHRP'ernes vægt var 12,74 g, når oprensningen blev udført direkte efter opvarmningsekstraktion. Imidlertid var den faktiske polysaccharidvægt af de to processer meget tæt på (4,69 g og 4,38 g). For at spare omkostninger kunne søjlekromatografirensning derfor udføres direkte efter opvarmningsekstraktion.

2.5. FT-IR spektroskopi af IHRP'er

Nogle strukturelle karakteristika af polysaccharider kunne udledes baseret på de karakteristiske absorptionstoppe af FT-IR [26]. FT-IR-spektret af IHRP'er er vist i figur 3, og den typiske absorption af polysaccharid kunne observeres. Toppen omkring 3378 cm−1 blev tilskrevet -OH-strækvibrationer, hvilket indikerer eksistensen af ​​-OH [27]. Den svage top ved 2932 cm−1 var CH-strækvibration, inklusive vibrationen af ​​-CH2 og -CH3 [28]. Den stærke top på omkring 1600 cm−1 var relateret til -C=O-strækningsvibrationen [29], og toppen omkring 1413 cm−1 blev angivet for CO-strækningsvibrationen, hvilket indikerer eksistensen af ​​-COOH. Desuden svarer den relativt stærke top ved 1080 cm−1 meget sandsynligt til OH-bøjningsvibrationen. FT-IR-spektret af IHRP'er viste mange karakteristiske absorptionstoppe af polysaccharider, hvilket demonstrerer polysaccharidskelettet af IHRP'er.

2.6. Monosaccharidsammensætningsanalyse af IHRP'er

Bioaktiviteten af ​​polysaccharider er ofte relateret til monosaccharidsammensætninger. I denne undersøgelse blev monosaccharidsammensætningen af ​​IHRP'er erhvervet ved ionkromatografi som vist i figur 4. Ifølge monosaccharidstandarderne var IHRP'er sammensat af fucose, arabinose, rhamnose, galactose, glucose, xylose, ribose, galacturonsyre, guluronsyre, og glucuronsyre. Deres kvalitetsprocenter var henholdsvis 1,33, 19,60, 10,41, 20,87, 27,42, 4,23, 3,12, 6,22, 0,28 og 2,37. Det kunne konstateres, at arabinose, rhamnose, galactose og glucose var de vigtigste monosaccharider i IHRP'er. Glukose var et dominerende monosaccharid i IHRP'er, og resultatet var i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [30]. Indholdet af uronsyre kunne have gjort polysaccharider negativt ladede. Dette resultat havde en betydelig indflydelse på bioaktiviteterne af polysaccharider [31]. Desuden var polysaccharidindholdet i IHRP'er mellem 30 procent og 35 procent. Ikke-sukkerkomponenterne var hovedsageligt organiske syrer, flavonoider, steroider og glycosider. I mellemtiden var indholdet af hver ikke-sukkerkomponent relativt lavt.

2.7. Antioxidantaktivitetsundersøgelse

ABTS og DPPHs evne til at fjerne frie radikaler er blevet grundigt undersøgt for at evaluere antioxidantaktiviteten af ​​polysaccharider [32]. Opfangningskapaciteten af ​​IHRP'er mod ABTS og DPPH er vist i tabel 5. Som vist i tabel 5 steg skyllehastigheden for DPPH og ABTS begge med stigningen i IHRP's koncentration. Når koncentrationen af ​​IHRP'er var 1,0 mg/mL, var DPPH-opfangningshastigheden 76,00 procent, mens ABTS-opfangningshastigheden var 99.{{10}}5 procent . Efter beregning blev EC50-værdierne for ABTS og DPPH bestemt til 0,34 og 0,47 mg/mL. Så vidt vi ved, er der ingen rapport om antioxidantaktiviteten af ​​IHRP'er. Antioxidantaktiviteten af ​​blomsterstandene fra 12 Cannabis sativa L. monoecious kultivarer blev undersøgt [33]. Blandt dem havde ananas den stærkeste rensende aktivitet mod DPPH (EC50=60.00 µg/mL), mens Kc-Virtus havde den stærkeste renseevne mod ABTS (EC50=304.77 µg/ ml). Med hensyn til antioxidantaktiviteten af ​​cannabidiol-fuldspektrumolie blev det rapporteret, at dens DPPH EC50 var 158,0 µg/ml [34]. Derudover blev DPPH EC50 for CBD rapporteret at være 0,937 mM [35]. CBDV's opfangningskapacitet for frie radikaler blev også undersøgt, dvs. ABTS EC50 var 406,3 µM, mens DPPH EC50 var 3736 µM [36]. Ovenstående resultater indikerede, at IHRP'er viste stor antioxidantaktivitet

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】