Ekstracellulær acidose begrænser et-kulstofmetabolisme og bevarer T-cellestammen

Akkumuleringen af ​​sure metaboliske affaldsprodukter i tumormikromiljøet hæmmer effektorfunktioner af tumor-oppustelige lymfocytter (TIL'er). Det er dog stadig uklart, hvordan et surt miljø påvirker T-cellemetabolisme og differentiering. Her viser vi, at langvarig eksponering for syre omprogrammerer T-cellens intracellulære metabolisme og mitokondrielle fitness og bevarer T-cellestammen. Mekanistisk forringer forhøjet ekstracellulær acidose methioninoptagelse og metabolisme via nedregulering af SLC7A5, og ændrer derfor H3K27me3-aflejring ved promotorerne af centrale T-celle-stamness-gener. Disse ændringer fremmer opretholdelsen af ​​en 'stammelignende hukommelse'-tilstand og forbedrer langsigtet in vivo persistens og anti-tumor-effektivitet hos mus. Vores resultater afslører ikke kun en uventet kapacitet af ekstracellulær acidose til at opretholde de stamlignende egenskaber af T-celler, men fremmer også vores forståelse af, hvordan methioninmetabolisme påvirker T-celle-stamhed.

cistanche planteforøgende immunsystem

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Adoptiv overførsel af tumorantigen-specifikke T-celler repræsenterer et stort fremskridt inden for kræftbehandlingsområdet, da det har ført til fuldstændig regression af visse maligne sygdomme. Dens terapeutiske effektivitet afhænger i høj grad af de overførte T-cellers persistens og differentieringsstatus1,2. Mindre differentierede hukommelses-T-celler er den foretrukne population til adoptiv T-celleoverførsel (ACT) på grund af deres stamcelle-lignende egenskaber af selvfornyelse og multipotens3,4. Faktisk har brugen af ​​stamlignende hukommelses-T-celler til ACT vist sig at opnå overlegne antitumorresponser5. Sammenlignet med terminalt differentierede effektor-T-celler viser stamlignende T-celler forskellige kendetegn6. Både humane og muse stamlignende T-celler er karakteriseret ved deres ekspression af antigen-oplevede og homing-associerede molekyler, herunder høje niveauer af CD62L og CCR7 (ref. 7). Vores forståelse af de transkriptionelle profiler, epigenetiske modifikationer og metaboliske veje, der regulerer stamlignende T-celler, er steget dramatisk i de seneste år8-10. Adskillige transkriptionelle faktorer, såsom TCF1, KLF2 og LEF1, er blevet rapporteret at spille væsentlige roller i at drive eller opretholde T-celle-stamness9. TCF1 er især den vigtigste transkriptionsfaktor, der fremmer dannelsen af ​​langlivede hukommelses-T-celler11. Under kroniske infektioner opretholder en lille del af TCF1+-stamlignende T-celler T-celleresponser mod sekundær infektion1,12. Epigenetiske ændringer giver T-celler et middel til både at initiere de transkriptionelle ændringer, der ligger til grund for erhvervelsen af ​​hukommelsescellekarakteristika, og opretholde disse transkriptionelle ekspressionsmønstre13. Flere undersøgelser har vist, at trimethylering af histon H3 ved K4 (H3K4me3), en aktiveringsassocieret modifikation, opnås ved hukommelsesassocierede genloci, herunder TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 og SELL, under differentieringen af ​​naiv CD{{47 }} T-celler ind i hukommelses-T-celler, hvorimod trimethylering af H3 ved K27 (H3K27me3), en repressiv modifikation, går tabt på disse loci13-15. Omvendt viser effektor-associerede gener (GZMB, PRF1, IFNG og TBX21) nedsatte repressive og øgede aktiverende epigenetiske modifikationer ved disse loci i effektor T-celler13,16. Endelig tyder akkumulerende beviser på, at metaboliske kredsløb dikterer T-cellernes skæbnebeslutninger og former deres epigenetiske og funktionelle tilstande17. Kortlivede effektor-T-celler er meget glykolytiske og afhængige af et-kulstof-metabolisme18,19, hvorimod stamlignende hukommelses-T-celler udviser distinkte metaboliske profiler karakteriseret ved øget fedtsyreoxidation (FAO) og mitokondriel reserverespiratorisk kapacitet (SRC), kardinal egenskaber involveret i langsigtet persistens20-22. Derfor er metabolisk omprogrammering vigtig for effektiv erhvervelse af stamness og langsigtet overlevelse af T-celler.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Det immunsuppressive tumormikromiljø (TME), karakteriseret ved lav pH, hypoxi, glukosemangel og mælkesyreberigelse, er den vigtigste barriere, der hindrer korrekt T-celleudvidelse, differentiering og funktionalitet23,24. Faktisk forringer metabolisk stress påført af TME mitokondriel kapacitet og fitness, hvilket udløser intratumoral T-celle metabolisk insufficiens og dysfunktion25-28. Spændende nok er de fleste tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) dysfunktionelle, men en lille fraktion rummer stængellignende hukommelse eller prækursoregenskaber7,29. Denne stilklignende TIL-undergruppe bevarer proliferativt potentiale og persistens og er forbundet med en gunstig respons på immun checkpoint blokade (ICB) og TIL-ACT hos mennesker med cancer11,30. Tidligere undersøgelser har vist, at forhøjet ekstracellulær acidose (↑[H+]) undertrykte den cytolytiske aktivitet af T-celler både in vitro og in vivo31-33. Derudover har den sure TME en betydelig indflydelse på aktiviteten og differentieringen af ​​tumorinfiltrerende myeloidceller, såsom dendritiske celler (DC'er) og tumorassocierede makrofager (TAM'er)34-36. Imidlertid er virkningen af ​​↑[H+] på T-celle-stamhed og metabolisk kondition stort set ukendt. Her rapporterer vi, at langvarig in vitro ↑[H+] eksponering letter differentieringen af ​​humane og muse stamlignende CD8+ T-celler på bekostning af terminal effektor CD8+ T-celler. Vi fandt ud af, at langvarig ↑[H+]-behandling omformer T-cellemetabolismen og opretholder mitokondriel respirationskapacitet. Ydermere svækker vedvarende ↑[H+]-eksponering methioninoptagelse og metabolisme, hvilket efterfølgende resulterer i nedsat H3K27me3-aflejring af hukommelsesrelaterede gener, hvilket letter opretholdelsen af ​​en 'stammelignende hukommelse'-status. Endelig viser adoptiv overførsel af T-celler dyrket under ↑[H+]-betingelser potent antitumoraktivitet in vivo, i overensstemmelse med deres mindre udmattede fænotype. Således afslører vores undersøgelse den uventede rolle af ekstracellulær acidose i bevarelse af T-celle-stamhed via ombygning af cellulær metabolisme og epigenetiske mønstre.

Resultater

↑[H+ ] eksponering fremmer CD8+ T-celle-stamhed

For at bestemme, om ekstracellulær ↑[H+] påvirker stamlignende T-celledifferentiering, udførte vi flowcytometrisk analyse af nøglestamlignende fænotyper på humane T-celler dyrket i 12 dage i begge kontrolmedier, ↑[H+]-medier indeholdende 10 mM mælkesyre (efterligner laktatkoncentrationen i patofysiologiske situationer23,35) eller surt medium (~pH 6,6, ved saltsyre) (fig. 1a). En højere andel af stamlignende CD8+ T-celler, inklusive tidlig hukommelse (CD45RO− CD27+) og central hukommelse (CD45RO+ CD27+), blev set i T-celler konditioneret i ↑ [H+] versus kontrolmedium (udvidede data, fig. la). Derudover fandt vi, at T-celler dyrket i ↑[H+]-medium havde en højere procentdel af stamlignende celler (CCR7+ CD62L+) (fig. 1b). Det skal bemærkes, at vi bemærkede markant øget TCF1-ekspression, nøglefaktoren, der driver stamlignende og central hukommelsesdifferentiering, på proteinniveau i både humane og muse CD8+ T-celler udsat for ↑[H+] (fig. 1c og Udvidede data Fig. 1b). Derudover var der en [H+]-koncentrationsafhængig effekt på CCR7- og TCF1-ekspression (udvidede data, fig. 1c). I overensstemmelse med den stammelignende fænotype af ↑[H+]-konditionerede T-celler blev produktionen af ​​intracellulær interferon- (IFN-) og tumornekrosefaktor (TNF-) signifikant reduceret i disse celler (fig. 1d).

For bedre at undersøge T-celledifferentieringsstatussen udførte vi RNA-sekventeringsanalyse (RNA-seq) og fandt ud af, at langvarig in vitro ↑[H+] eksponering resulterede i en distinkt transkriptionel profil (Udvidet data Fig. 1d). Eksponering for ↑[H+] førte til bemærkelsesværdigt nedsat ekspression af gener, der koder for effektormolekyler, såsom PRF1, GZMB og IFNG, og den co-inhiberende receptor BTLA (fig. 1e,f og udvidede data, fig. 1e). I modsætning hertil viste ↑[H+]-dyrkede T-celler højere ekspression af BACH2, CCR7, LEF1 og TCF7, som korrelerer med T-celle-stamhed (fig. 1e, f og udvidede data, fig. 1e). Gensætberigelsesanalyse (GSEA) viste, at det transkriptionelle mønster induceret af ↑[H+]-eksponering svarede til det for hukommelses-T-celler (fig. 1g og udvidede data, fig. 1f). Endvidere bekræftede kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR)-analyse øget mRNA-ekspression af BACH2, KLF2, LEF1 og TCF7 efter ↑[H+]-behandling (fig. 1h). Samlet understøtter disse observationer det faktum, at ↑[H+] behandling i høj grad former T-cellernes transkriptionelle profiler for at etablere stamness. Det er værd at bemærke, at vi fandt, at ↑[H+]-behandling hæmmede T-celleproliferation og skævede cellecyklusfordelingen mod G1-fasen og væk fra S-fasen (Supplerende Fig. 1a-c). Vi undersøgte derefter T-celleaktivering efter ↑[H+]-behandling under TCR-stimulering og fandt ud af, at ↑[H+]-eksponering ikke har nogen signifikant effekt på ekspressionen af ​​T-celleaktiveringsmarkører eller cellestørrelse (Supplerende Fig. 2a,b). Derudover bekræftede vi yderligere, at ↑[H+] eksponering efter T-celleaktivering stadig kunne inducere en stamlignende tilstand af T-celler (Supplerende Fig. 2c-f). Disse fund udelukker muligheden for, at T-celler udsat for ↑[H+] simpelthen er modstandsdygtige over for stimulering, i modsætning til at adoptere en stamlignende tilstand.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Tidligere rapporter har vist, at det sure miljø akut hæmmer den cytolytiske aktivitet af T-celler både in vitro og in vivo23,31. Vi fandt også, at kortvarig ↑[H+] eksponering svækkede produktionen af ​​cytokiner, men havde ringe indflydelse på den stamlignende fænotype i T-celler (Udvidede data Fig. 1g-i og Supplerende Fig. 3a-c). Ydermere er de hæmmende virkninger af cytokinproduktion ved ↑[H+]-eksponering forbigående og reversible, fordi fjernelsen af ​​↑[H+] hurtigt genopretter cytokinproduktionen af ​​T-celler (udvidet data, fig. 1h). Således er hæmning af T-celle-effektorfunktion af det sure miljø meget hurtig, hvorimod omprogrammering af T-celle-stamhed kræver langvarig ↑[H+]-eksponering. Fordi laktat er til stede i opløsning enten i dets udissocierede form (mælkesyre) eller som et ionsalt (natriumlactat), forsøgte vi dernæst at afgøre, om natriumlactat udviste lignende virkninger på T-cellestammen, og fandt ud af, at natriumlactat også fremmede stammens signaturer, selvom dets effektivitet var meget lavere end for mælkesyrebehandling (10 mM) (Udvidede data Fig. 1j,k og Supplerende Fig. 4a-f). Disse resultater tyder på både vigtigheden af ​​↑[H+] og dens forskel fra behandling med laktationer i induktionen af ​​den stamlignende fænotype af CD8+ T-celler.

Fig. 1|↑[H+] eksponering letter differentieringen af ​​stamlignende CD8+ T-celler. en Skematisk af human T-celleaktivering under de angivne forhold: pH 7,4 (–↑[H+], kontrol), pH 6,6 (+↑[H+], saltsyre) eller 10 mM mælkesyre (+↑[H+ ]). PBMC'er, mononukleære celler fra perifert blod. b, Repræsentative CCR7- og CD62L-ekspressionsprofiler i humane CD8+ T-celler under forskellige betingelser på dag 12. n=3 uafhængige prøver. c, Repræsentative histogrammer og kvantificering af TCF1-ekspression i humane CD8+ T-celler under forskellige betingelser på dag 12. n=3 uafhængige prøver. MFI, middel fluorescensintensitet. d, Humane T-celler blev ekspanderet som i a i 12 dage og stimuleret med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) indeholdende brefeldin A (BFA) i 4,5 timer. Den intracellulære ekspressionsprofil af IFN- og TNF- er afbildet for T-celler i tilstanden pH 7,4 (venstre), 10 mM mælkesyre (midten) eller pH 6,6 (højre). n=3 uafhængige prøver. e,f, RNA-seq-analyse af humane T-celler, der blev ekspanderet i kontrol (pH 7,4) eller mælkesyre (10 mM). Varmekort over udvalgte gener (e) og vulkanplot af alle gener, hvor gener forbundet med hukommelse, effektor og udmattede T-celler var mærket (f). I vulkanplottet repræsenterer x-aksen de log2-transformerede foldændringsværdier (FC) for celler behandlet med mælkesyre i forhold til kontroller på dag 12, og y-aksen repræsenterer de justerede P-værdier. n=4 uafhængige prøver. g, GSEA-plot, der sammenligner kontrol med mælkesyrekonditionerede T-celler for berigelse af effektor versus hukommelse. NES, normaliseret berigelsesscore. h, Kvantitativ mRNA-ekspression af transkriptionsfaktorer forbundet med T-celle-stamhed (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) i T-celler under de angivne betingelser. n=3 uafhængige prøver. Data præsenteres som middel ± sem Statistiske analyser blev bestemt ved uparret to-halet Students t-test (b–d,h). Nominelle P-værdier og falske opdagelseshastigheder (FDR'er) blev beregnet med standardmetoden for GSEA-softwaren (g).

Forhøjet [H+] udløser metabolisk omprogrammering

Ud over de særskilte transkriptionsprogrammer erhverver stamlignende T-celler også fortrinsvis unikke metaboliske egenskaber, herunder forhøjet FAO og begrænset glykolytisk metabolisme17,20,37. For at udforske de metaboliske egenskaber af langsigtede in vitro ↑[H+]-eksponerede T-celler, udførte vi Gene Ontology (GO) berigelsesanalyse og fandt signifikante forskelle i ekspressionen af ​​gener relateret til metaboliske veje, såsom små molekyle metabolisme og glykolyse (fig. 2a). Faktisk udviste langsigtede ↑[H+]-konditionerede T-celler reduceret glykolyse og aminosyremetabolisme i modsætning til øget langkædet fedtsyremetabolisme (Udvidede data Fig. 2a,b). I modsætning til langvarig ↑[H+]-eksponering hæmmede kortvarig ↑[H+]-behandling kun glykolyse, men havde ingen signifikant effekt på FAO (Supplerende Fig. 5a). Kvantitativ PCR-analyse bekræftede yderligere, at glykolysegenerne SLC2A1, SLC2A3 og LDHA var signifikant reduceret i ↑[H+]-eksponerede T-celler (udvidet data, fig. 2c). Omvendt fremmede ↑[H+]-konditionering ekspressionen af ​​carnitin palmitoyltransferase 1 (kodet af CPT1A), et hastighedsbegrænsende enzym involveret i FAO (udvidet data, fig. 2c). For yderligere at belyse de metaboliske ændringer induceret af ↑[H+] udførte vi en objektiv metabolomisk analyse og fandt 285 forskellige mellemprodukter i T-celler dyrket med ↑[H+] versus kontroller (Udvidet data, fig. 2d). Især udsættelse for ↑[H+] reducerede signifikant de glykolytiske mellemprodukter og visse essentielle aminosyrer i stedet for at øge flere carnitin-arter, den aktiverede form af fedtsyrer, der overføres til mitokondrier for oxidation (Udvidede data Fig. 2e-g). Metabolisk fluxanalyse under anvendelse af [13C6]glucose eller [13C16]palmitat viste, at ↑[H+]-eksponering drastisk hindrede [13C6]glucose-inkorporering i TCA-mellemprodukter og mælkesyre, mens den fremmede [13C16]palmitat-inkorporering i acetyl-CoA og citratet, hvilket understøttede at ekstracellulær acidose undertrykker glykolyse og forstærker FAO i T-celler (fig. 2b-e). Disse ↑[H+]-konditionerede T-celler udviste begrænsninger med hensyn til næringsstofoptagelse, hvilket fremgår af det reducerede forbrug af [13C6]glukose og absorption af lipidanaloger (BODIPY FL C16), et fund, der kan skyldes en øget elektrokemisk gradient (Udvidede data Fig. 2h, i).

Den begrænsede næringsstofoptagelse og cellulær metabolisme-omskiftning kan føre til ændringer af signalnetværket i T-celler. GO-berigelsesanalyse af T-celler behandlet med mælkesyre afslørede, at de fleste af de berørte gener primært er involveret i PI3K-AKT, mTOR og TCR-signalering (Udvidet data Fig. 3a). mTOR-signalering spiller en central rolle i at integrere immunsignaler og metaboliske signaler til korrekt aktivering af T-celler, og inhibering af mTOR-signalering skæver celler mod dannelse af hukommelse CD8+ T-celler i stedet for effektordifferentiering38-40. Vores GSEA-analyse viste, at aktiviteten af ​​både AKT-mTOR- og NF-кB-signalering i ↑[H+]-konditionerede T-celler var reduceret sammenlignet med aktiviteten i kontrol-T-celler (fig. 2f og udvidede data, fig. 3b). Dette blev yderligere bekræftet af den reducerede phosphorylering af S6 (ved Ser235 og Ser236), 4EBP1 (ved Thr37 og Thr46), AKT (ved Ser473) og NF-кB (ved Ser536) i ↑[H+]-konditionerede T-celler (fig. 2g,h og udvidede data Fig. 3c). mTOR er kendt for at være en kritisk regulator af forskellige biologiske processer, herunder cellestørrelse, energigenerering og proteinsyntese41. Faktisk fandt vi, at cellestørrelsen af ​​↑[H+]-konditionerede T-celler var reduceret sammenlignet med den for kontrol-T-celler (udvidede data, fig. 3d). Vi vurderede derefter bioenergiafhængig proteinsyntese i ↑[H+]-konditionerede T-celler ved hjælp af SCENITH, en nyudviklet metode, der bruger puromycin-inkorporering som en udlæsning af proteinsynteseniveauer42. Som forventet undertrykte ↑[H+] eksponering energiintensiv proteinsyntese (fig. 2i), hvilket tyder på, at energimetabolismen i CD8+ T-celler blev ændret. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater om, at inhibering af mTOR-aktivitet med rapamycin øgede ekspressionen af ​​stamness-associerede transkriptionsfaktorer (Udvidede data Fig. 3e,f). Tager vi vores resultater sammen, konkluderer vi, at langvarig ↑[H+] eksponering orkestrerer en metabolisk switch og undertrykker mTOR-aktivitet, hvilket letter erhvervelsen og vedligeholdelsen af ​​T-celle-stamness.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

↑ [H+ ]-medieret begrænsning af methioninmetabolisme bevarer epigenetisk stamness

Akkumulerende linjer af bevis tyder på, at et-kulstof-metabolisme dikterer T-celle skæbnebeslutninger og former deres funktionelle tilstande43,44. Vores RNA-seq-analyse viste dårlig berigelse for den metaboliske proces med et kulstof og methionincyklussignatur i T-celler udsat for langvarig, snarere end kortvarig,↑[H+]-behandling (Fig. 3a, Udvidede Data Fig. 4a, og Supplerende Fig. 5b). Følgelig hæmmede ↑[H+]-eksponering ekspressionen af ​​gener, der koder for enzymer relateret til methionincyklus (MTR, AHCY og BHMT) såvel som folatmetabolisme (SHMT1 og SHMT2) (udvidet data, fig. 4b). Yderligere metabolomisk analyse afslørede, at T-celler dyrket i mælkesyre viste et markant fald i intracellulære metabolitter involveret i methionincyklussen, inklusive methionin, S-adenosylmethionin (SAM) og S-adenosylhomocystein (SAH), men øgede niveauer af serin og homocystein (udvidet Data Fig. 4c). [13C5]methioninsporing bekræftede yderligere, at optagelsen og intracellulær overflod af methionin, 13C-mærket intracellulær SAM (m+5), SAH (m+4) og 5'-methylthioadenosin (MTA, m +1) blev signifikant reduceret i ↑[H+]-eksponerede T-celler (fig. 3b-d og udvidede data, fig. 4d). Det er værd at bemærke, at eksogen methionin-tilskud genoprettede optagelsen og intracellulær overflod af [13C5]methionin såvel som de relevante mellemprodukter i ↑[H+]-eksponerede T-celler (fig. 3c,d og udvidede data, fig. 4d), hvilket tyder på, at exogen methionin tilskud kunne genoprette methioninoptagelse og metabolisme af ↑[H+]-eksponerede T-celler. Vi undersøgte derefter, om methionin-restriktion kan drive T-celle-stamness. Vi fandt ud af, at methionin-deprivation faktisk fremmede induktionen af ​​TCF1+ CD8+ T-cellepopulationen, men havde ingen effekt på ekspressionen af ​​CD62L og CD44 (Udvidede data Fig. 4e,f). For yderligere at studere methioninmetabolismens rolle i ↑[H+]-induceret T-celle-stamhed, dyrkede vi T-celler med ↑[H+]-medium suppleret med methionin, SAM eller SAH. Fænotypen af ​​T-celle-stamhed induceret af ekstracellulær acidose var faktisk delvist forbudt ved tilskud med methionin eller SAM, men ikke SAH (Fig. 3e og Udvidede Data Fig. 4g-i). Intracellulær methionin omdannes til SAM, en vigtig methylgruppedonor til DNA- og histonmethyleringsreaktioner (Udvidede data Fig. 5a). Således karakteriserede vi histonmethyleringsmønstre og fandt ud af, at forhøjede [H+] i høj grad reducerede de totale H3K27me3-niveauer i T-celler, men ikke havde en signifikant effekt på ekspressionen af ​​andre histonmethyleringsmarkører (fig. 3f og udvidede data, fig. 5b). Som forventet genoprettede methionintilskud til T-celler under ↑[H+] eksponering det totale niveau af H3K27me3-ekspression (fig. 3f). Den specifikke reduktion af H3K27me3-niveau observeret i T-celler, der gennemgik langtids↑[H+]-behandling, fik os til at antage, at ↑[H+]-eksponering selektivt regulerer den methyltransferase, der er specifik for aflejringen af ​​H3K27me3. Faktisk observerede vi signifikant reduceret ekspression af EZH2, en nøgle-methyltransferase for H3K27me3, både på mRNA- og proteinniveau i ↑[H+]-eksponerede T-celler (Udvidede data Fig. 5c,d). Desuden øgede inhibering af EZH2-aktivitet af en meget specifik inhibitor, GSK126, ekspressionen af ​​TCF1, såvel som procentdelen af ​​CCR7+ CD62L+ CD8+ T-celler (Udvidede data Fig. 5e,f) , hvilket var i tråd med en tidligere rapport om, at EZH2 kunne regulere hukommelse-T-cellepotentiale gennem selektive epigenetiske modifikationer45. For at identificere genom-omfattende ændringer i epigenetiske mønstre af ↑[H+]-induceret T-celle-stamness, udførte vi CUT&Tag-seq assayet og fandt minimale ændringer i proportionaliteten af ​​H3K4me3 og H3K27me3 aflejring blandt forskellige behandlede grupper langs promotoren, genkroppen og intergene regioner (udvidede data, fig. 5g). Specifikt afslørede epigenomisk profilering et reduceret niveau af repressiv histonmarkør H3K27me3 ved hukommelsesassocierede gen-loci (for eksempel TCF7, CCR7, ID3, LEF1 og KLF2) i langtids-↑[H+]-behandlede T-celler (fig. 3g). . Det er vigtigt, at tilføjelsen af ​​methionin under ↑[H+] eksponering delvist genoprettede H3K27me3-niveauet ved ovenstående loci, såvel som deres genekspression, hvilket tyder på en vigtig rolle for methionin i den epigenetiske modulering af disse hukommelsesassocierede gener (fig. 3g og Udvidede data Fig. 5h). I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse14 opnåede effektorgener såsom PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 og NR4A2 positivt et aktiverende histon-methyleringsmønster (H3K4me3hi og H3K27me3lo) (fig. 3g). Det skal bemærkes, at belægningerne af H3K4me3 ved promotorregioner af disse effektorgener blev svækket i T-celler dyrket under ↑[H+] eksponering og blev genoprettet ved methionintilskud (fig. 3g). Samlet set indikerer disse fund, at ↑[H+]-medieret forstyrrelse af methionincyklussen fremmer epigenetisk bevarelse af T-celle-stamhed.

Adskillige methionintransportører (SLC'er), herunder SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 og SLC43A2, kan formidle methionintransport46. For at undersøge, hvordan ↑[H+] eksponering nedsætter methioninoptagelse og metabolisme i T-celler, analyserede vi ekspressionsmønstrene for forskellige SLC'er og fandt ud af, at ↑[H+] dramatisk nedregulerede ekspressionen af ​​SLC7A5 og SLC38A2, men havde ringe indflydelse på SLC38A1-ekspression (Extended). Data Fig. 6a,b). Ydermere reducerede ↑[H+]-eksponering ekspressionen og aktiviteten af ​​MYC (Udvidede data Fig. 6c,d), som er blevet rapporteret at regulere ekspressionen af ​​methionintransportører som SLC7A5 (ref. 47). Vi påviste yderligere en høj belægning af MYC på SLC7A5-promotoren og i mindre grad på SLC38A2-promotoren (Udvidede data Fig. 6e). Det er vigtigt, at signifikant reduceret MYC-binding til disse loci blev observeret i langtids-↑[H+]-behandlede T-celler (udvidede data, fig. 6e). I overensstemmelse med disse observationer genoprettede overekspression af MYC bemærkelsesværdigt ekspressionen af ​​SLC7A5 og SLC38A2 i ↑[H+]-eksponerede T-celler (udvidet data, fig. 6f). Disse resultater understøtter MYC's vigtige rolle i reduceret ekspression af methionintransportører ved ↑[H+] eksponering. Interessant nok fandt vi ud af, at tilskuddet af methionin også kan genoprette ekspressionen af ​​MYC og SLC7A5 i ↑[H+]-eksponerede T-celler (Udvidede data Fig. 6g), hvilket tyder på, at methionintilskud kan genoprette T-cellers methioninoptagelsesevne ved at opregulering af methionintransporter SLC7A5-ekspression på en MYC-afhængig måde. En tidligere undersøgelse har vist, at SLC7A5 er den mest udbredte methionintransportør i aktiverede T-celler47. Dette sammen med vores tidligere resultater tyder på, at SLC7A5 kan spille en vigtig rolle i ↑[H+]-induceret methioninrestriktion og opretholdelsen af ​​en stilklignende tilstand. Faktisk fandt vi, at overekspression af SLC7A5 delvist svækkede den ↑[H+]-inducerede stamlignende fænotype (Udvidede data Fig. 6h, i), hvilket yderligere understøttede involveringen af ​​methionintransportøren SLC7A5 i ↑[H+]-induceret T-cellehukommelse -lignende fænotype. Ved at analysere forskellige tumorinfiltrerende CD8+ T-celle subpopulationer fandt vi reduceret ekspression af både MYC og SLC7A5 i hukommelseslignende CD8+ TIL'er (Udvidet Data Fig. 7a,b), som er på linje med vores in vitro fund. Disse resultater tyder således på, at MYC-SLC7A5-methionin-aksen potentielt kan bidrage til at bevare TIL'ers hukommelseslignende status.

Fig. 2|↑[H+] eksponering udløser metabolisk omprogrammering og undertrykker mTOR-signalering. a, GO-analyse ved hjælp af RNA-seq-data, der viser repræsentative differentielt udtrykte metaboliske gener i kontrol- og mælkesyre-konditionerede humane T-celler (justeret P-værdi < 4,23 × 10-2). b, Skematisk af [13C6]glucose eller [13C16]palmitatmærkningsmønstre. c, Procentdel af det angivne m+3 laktat ud af total laktat eller af m+3 pyruvat ud af totalt pyruvat i T-celler. n=3 uafhængige prøver. d, Procentdel af isotopomer for TCA-mellemprodukterne, såsom citrat (m+2), malat (m+2) og succinat (m+2), afledt af [13C6]glucose. n=3 uafhængige prøver. e, Procentdel af den angivne m+2 acetyl-CoA ud af total acetyl-CoA eller af m+2 citratisotop ud af total citrat i T-celler fra [13C16] palmitat. n=4 uafhængige prøver. f, GSEA med statistisk analyse af gensættet forbundet med mTORC1-signalering i kontrol versus mælkesyrekonditionerede (venstre) eller pH 6.6-konditionerede (højre) humane T-celler. g,h, Flowcytometrisk analyse og kvantificering for S6 phosphoryleret ved Ser235 og Ser236 (g) og 4EBP1 phosphoryleret ved Thr37 og Thr46 (h) i humane CD8+ T-celler under de angivne betingelser. n=3 uafhængige prøver. I, Flowcytometrisk analyse og kvantificering af energiintensiv proteinsyntese i kontroller eller mælkesyre- eller pH 6.6-konditionerede humane T-celler. n=3 uafhængige prøver. Data præsenteres som middel ± sem Statistiske analyser blev bestemt ved ensidig Fisher eksakt test med Benjamini-Hochberg multiple-sammenligningstest (a) eller uparret to-halet Student's t-test (c-e,g-i). Nominelle P-værdier og FDR'er blev beregnet med standardmetoden i GSEA-softwaren (f).

Fig. 3|Øget [H+] ændrer T-cellens methioninmetabolisme for at bevare epigenetisk stamhed. et GSEA-plot af gensættet associeret med et-carbon-metabolisme og cystein- og methionin-metabolisme i kontrol versus mælkesyre-konditionerede humane T-celler. b, Skematisk af [13C5]methioninmærkningsmønstre. c, procentdel af intracellulær SAM (m+5), SAH (m+4) og MTA (m+1) ​​afledt af [13C5]methionin, ud af deres respektive samlede puljer, i T-celler dyrket under kontrolbetingelser eller med 10 mM mælkesyre eller 10 mM mælkesyre suppleret med methionin (10 mM + Met). n=3 uafhængige prøver. d, Relativ forekomst af [12C5]methionin og [13C5]methionin i T-celler. e, Repræsentativt histogram og kvantificering af TCF1 i humane CD8+ T-celler dyrket under forskellige forhold. n=3 uafhængige prøver. f, Effekter af methionintilskud på histonmethylering i humane T-celler. H3K4me3, histon H3 trimethyleret ved K4; H3K79me2, H3 dimethyleret ved K79; H3K27me3, H3 trimethyleret ved K27; H3K9me2, H3 dimethyleret ved K9. n=3 uafhængige prøver. g, genomsporingsvisning af repræsentative genloci, der viser H3K27me3 (rød, over linjen) eller H3K4me3 (blå, under linjen) toppe. CUT&Tag-seq-data er fra to uafhængige prøver. Data præsenteres som middel ± sem Nominelle P-værdier, og FDR'er blev beregnet med standardmetoden for GSEA-softwaren (a). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af to-vejs variansanalyse (ANOVA) med Tukeys multiple-sammenligningstest (c-f).

Eksponering for ↑[H+ ] opretholder mitokondriel kondition 

I betragtning af den reducerede energiintensive proteinsyntese i ↑[H+]-konditionerede T-celler antog vi, at langvarig eksponering for ↑[H+] kunne resultere i betydelige ændringer i cellulær energimetabolisme. Både kontrol- og ↑[H+]-konditionerede T-celler blev analyseret under anvendelse af SCENITH42 for at beregne glucoseafhængighed, mitokondriel afhængighed, glykolytisk kapacitet og FAO- og aminosyreoxidationskapacitet (fig. 4a og udvidede data, fig. 8a). I overensstemmelse med vores metabolomics og isotopsporingsresultater observerede vi øget mitokondriel metabolisme i ↑[H+]-eksponerede T-celler, hvorimod glykolysehastigheder blev reduceret (fig. 4b,c og udvidede data, fig. 8b), hvilket indikerer en omprogrammering af intracellulært energisk metabolisme i ↑[H+]-konditionerede T-celler. Søhesteanalyse afslørede yderligere, at ↑[H+ ]-konditionerede T-celler viste en højere iltforbrugshastighed (OCR) såvel som SRC, et kardinaltræk ved langlivede hukommelse CD8+ T-celler22 og en lavere ekstracellulær forsuringshastighed ( ECAR) (fig. 4d–h og udvidede data fig. 8c–f). Da øget mitokondriel masse/fusion og nedsat mitokondrielt membranpotentiale (Δψm) er vigtige for opretholdelsen af ​​T-celle-stamness48-50, undersøgte vi yderligere mængden og kvaliteten af ​​mitokondrier af ↑[H+]-konditionerede T-celler og fandt ud af, at ↑[H+ ] behandling forbedrede mitokondriel masse i både humane og muse T-celler (fig. 4i, j og udvidede data, fig. 8g, h), som også opretholder en lavere Δψm (fig. 4k og udvidede data, fig. 8i). Ultrastrukturanalyse ved elektronmikroskopi (EM) afslørede, at ↑[H+]-eksponerede T-celler havde store, tætpakkede mitokondrier spredt i cytoplasmaet og havde mange tætte, smalle cristae sammenlignet med kontrol-T-celler, hvilket er i overensstemmelse med offentliggjorte resultater relateret til til mitokondriermorfologi i hukommelses-T-celler (fig. 4l,m). I overensstemmelse med dette fund observerede vi også øget genekspression af adskillige kritiske regulatorer af mitokondriel fusion i ↑[H+]-konditionerede T-celler (Udvidet data Fig. 8j), hvilket er blevet foreslået at spille en nødvendig rolle for hukommelses-T-cellegenerering50. Alt i alt indikerer disse resultater, at ↑[H+] eksponering øger mitokondriel masse/fusion og fitness for at fremme dannelsen af ​​stamlignende T-celler.

cistanche planteforøgende immunsystem

↑[H+ ] eksponering øger CD8+ T-celle antitumoraktivitet 

Stamlignende T-celler favoriserer engraftment, ekspansion og antitumoreffektivitet i adoptiv immunterapi51. For at undersøge, om langsigtede in vitro ↑[H+]-vedligeholdte CD8+ T-celler udviser øget ekspansion eller persistens ved overførsel, CD45.1+ OT-I T-celler, der blev ekspanderet i kontrol eller ↑[ H+]-konditioneret medium blev adoptivt overført til CD45.2+C57BL/6N-mus uden implanteret tumor (fig. 5a). Selvom et let øget antal af apoptotiske celler blev påvist ved ↑[H+]-konditionering (Udvidede data, fig. 9a), var der en signifikant højere procentdel af T-celler i det perifere blod hos mus, der blev overført med T-celler ekspanderet i ↑[H+]-tilstanden sammenlignet med dem ekspanderet i kontrolmedium (kontrol-T-celler) (fig. 5b). Tilsvarende blev der påvist signifikant højere frekvenser af T-celler i milten og lymfeknuderne (LN'er) (Udvidede data Fig. 9b, c). Derudover fandt vi signifikant øget T-celleakkumulering i tumorer, milt og drænende lymfeknuder i B16-OVA-tumorbærende mus, hvor ↑[H+]-ekspanderede celler var blevet adoptivt overført sammenlignet med mus, der modtagne kontrolceller, hvilket tyder på, at CD8+ T-celler bevaret i ↑[H+] har forbedret persistens (fig. 5c–e og udvidede data, fig. 9d). I overensstemmelse med disse resultater blev procentdelen af ​​hukommelses-T-celler signifikant forøget i milten og LN'erne hos mus, der modtog ↑[H+]-konditionerede T-celler (fig. 5f og udvidede data, fig. 9e). Navnlig udviste ↑[H+]-udvidede OT-I T-celler signifikant forsinket tumorvækst sammenlignet med kontrol-T-celler (fig. 5g). Vi undersøgte derefter den terapeutiske effektivitet af ↑[H+]-ekspanderede CD19 kimære-antigen-receptor-modificerede (CAR) T-celler med en in vivo tumormodel, hvor CD19-K562 tumorceller blev subkutant injiceret i flankerne af NCG-mus (fig. 5h). Vi fandt ud af, at ↑[H+]-eksponering også fremmede CAR-T-cellestamhed, men havde ingen effekt på apoptose (Udvidede data Fig. 9f), som det fremgår af de signifikant øgede procenter af CCR7+ CD62L+-stamlignende CAR-T celler såvel som den opregulerede ekspression af TCF1 (udvidet data fig. 9g,h). Derudover var der en højere hastighed af CAR-T-celleakkumulering i tumorsteder og milte fra NCG-mus efter infusion med ↑[H+]-konditionerede T-celler (fig. 5i). Som forventet viste NCG-mus, der blev adoptivt overført med CAR-T-celler, der var blevet udvidet i ↑[H+], en større clearance af implanteret CD19+-tumor sammenlignet med dem, der modtog CAR-T-celler, der var blevet udvidet i kontrolmedium (fig. 5j). Tilsammen viste disse data, at ↑[H+] behandling fremmer in vivo persistens og antitumoraktivitet af T-celler.

Eksponering for ↑[H+] begrænser udmattelse af T-celler

For yderligere at udforske virkningerne af vedvarende ↑[H+]-eksponering på T-celleudmattelse in vitro, målte vi LAG-3- og TIM-3-ekspression i ↑[H+]-primede humane T-celler, der gennemgik flere runder af yderligere stimulering med anti-CD3-antistoffer og blev konditioneret i kontrolmedium (fig. 6a). Vi fandt, at både LAG-3- og TIM-3-ekspression var reduceret i ↑[H+]-eksponerede T-celler (fig. 6b og udvidede data, fig. 10a), hvilket indikerer, at ↑[H+]-behandling resulterer i reduceret T-celle udmattelse. Desuden fandt vi, at en høj koncentration af methionin fører til en stigning i ekspressionen af ​​hæmmende markører, såsom PD-1, LAG-3 og TIM-3, hvorimod behandling med en lav methioninkoncentrationen reducerede ekspressionen af ​​disse markører lidt (Supplerende Fig. 6a-c). Navnlig ved langvarig in vitro ↑[H+] eksponering var hyppigheden af ​​TIM-3+ LAG-3+ infiltrerende OT-I T-celler og CD19-CAR T-celler i tumorerne stort set reduceret efter adoptiv overførsel (fig. 6c-e og udvidede data fig. 10b), hvilket er i overensstemmelse med deres lavere udmattelse in vitro og forbedret tumorkontrolkapacitet in vivo. Desuden viste vi, at langtids-↑[H+]-konditionerede T-celler viste signifikant reduceret TOX-ekspression både in vitro og in vivo (fig. 6f, g og udvidede data, fig. 10c, d). Som beskrevet tidligere kan udmattede T-celler generelt opdeles i en progenitor-udmattet eller terminalt udmattet undergruppe, som bestemt af TCF1 og TIM-3-ekspression52,53. Som sådan målte vi ekspressionsmønstret for TCF1 og TIM-3 i CD45.1+ TIL'er og bemærkede, at frekvensen af ​​TCF1− TIM-3+ terminalt udmattede T-celler stort set var reduceret, med en signifikant øget procentdel af TCF1+ TIM-3– progenitor-T-celler under ↑[H+]-konditionering (fig. 6h). Desuden påviste vi en øget LY108+ TIM-3– progenitor T-cellepopulation (Udvidet data Fig. 10e) samt en øget frekvens af IFN- + TNF- + T celler (Udvidet Data Fig. 10f), hvilket yderligere understøtter det faktum, at langtids in vitro ↑[H+]-ekspanderede adoptivt overførte T-celler begrænser udmattelse og bevarer stamhed.

Diskussion

Tumorspecifik ACT er en lovende tilgang til behandling af individer med refraktære tumorer, men de terapeutiske virkninger er stort set begrænset af T-celledysfunktion i TME. For nylig er der blevet lagt stor vægt på at prækonditionere T-celler med forbigående glukosesult, glutaminrestriktion eller forhøjet ekstracellulært kalium (↑[K+]) under in vitro-dyrkning for at bevare T-celle-stammen og forbedre terapeutiske resultater54-56. I denne undersøgelse påviste vi, at dyrkning af CD8+ T-celler under høje niveauer af [H+] under priming overraskende fremmede erhvervelsen af ​​T-celle-stamhed og øgede modstandsdygtighed over for T-celleudmattelse, hvilket i høj grad forbedrede antitumoreffekterne af adoptivt overførte T-celler.

Overdreven mælkesyreakkumulering i TME har længe været betragtet som en nøglefaktor i tumorimmunescape. For eksempel er mælkesyre og det sure TME blevet påvist at undertrykke CD{{0}} T-celle cytolytisk aktivitet og cytokinproduktion31-33,57. I overensstemmelse med disse resultater fandt vi også, at kortvarig eksponering for ↑[H+] in vitro var nok til dybt at hæmme effektorcytokinproduktion, men havde ingen effekt på TCF1-ekspression eller stamness-associerede metaboliske træk. Alligevel fremmede langvarig ↑[H+]-behandling uventet TCF1-ekspression og opretholdt fænotypen af ​​stamlignende T-celler gennem metabolisk omprogrammering og epigenetisk ombygning. Eksponering af T-celler for ↑[H+] efter deres fulde aktivering kan også inducere en stam-lignende fænotype, og dermed udelukke muligheden for, at T-celler udsat for lav pH simpelthen er blevet refraktære over for stimulering, snarere end at have antaget en stam-lignende tilstand. Den fysiologiske mælkesyrekoncentration i blodet hos raske personer er omkring 1,5-3,0 mM, men den kan stige til 10 mM til 40 mM i TME35,58. Ved hjælp af en vedvarende anti-CD3/CD28-stimuleringsmodel, Feng et al. har for nylig rapporteret, at en høj koncentration af natriumlactat øger H3K27ac-niveauerne på TCF7 super-enhancer locus gennem hæmning af histon deacetylase aktivitet, hvilket fører til øget TCF1 ekspression og fremme af CD8+ T-cellestamness59. I modsætning hertil fandt vi, at langvarig eksponering for en relativt lav koncentration af mælkesyre (10 mM), men ikke natriumlactat, let kan udløse en stammelignende signatur af T-celler gennem begrænsning af methioninmetabolisme og regulering af H3K27me3 aflejring ved stamness-associerede gen-loci, som klart understøtter distinkt epigenetisk regulering af natriumlaktat og mælkesyre. Behandling med lav surhedsgrad (pH 6,9) har imidlertid ikke en signifikant indvirkning på TCF1-ekspression under vedvarende anti-CD3/CD28-stimulering, hvilket tyder på, at de stamlignende signaturer af CD8+ T-celler induceret af ↑[H+ ] eksponering kan tilsidesættes af TCR-stimulering. TCR-aktivering kan øge methioninoptagelsen og omprogrammere methioninmetabolismen for at hjælpe T-celleaktivering19,60. Vi spekulerede i, at TCR-stimulering kan forstærke optagelsen af ​​methionin i ↑[H+]-behandlede T-celler, som havde begrænset methioninmetabolisme, og derfor forstyrrede ↑[H+]-induceret epigenetisk stamness. Derudover kunne T-celler bruge lactationer som en ekstracellulær kulstofkilde for at lette erhvervelsen af ​​stamness i nærvær eller fravær af vedvarende TCR-stimulering. Metabolisk aktivitet er tæt forbundet med T-celledifferentiering, og visse metaboliske indgreb kan i høj grad fremme langvarig hukommelse-T-celledannelse21,37,61,62. Derfor understøtter vores metabolomics og isotopsporingsanalyser ideen om, at langvarig ↑[H+] eksponering fører til slående metabolisk omprogrammering, såsom reduceret optagelse af glukose og nedsat glykolyse og TCA-cyklusmetabolisme. Adskillige undersøgelser har vist, at CD8+ T-hukommelsesceller bruger FAO til at opfylde deres energibehov, selvom dette sandsynligvis er en tilpasning til differentieringen af ​​hukommelseslinjen, og overekspression af Cpt1 fremmer T-cellernes levetid21,22,63,64. I deres model af T-celle-specifik genetisk deletion af Cpt1a, Raud et al. for nylig demonstreret, at LC-FAO stort set er uundværlig til T-celleaktivering og dannelse af CD8+ T-hukommelsesceller65. Det er fortsat en udfordring at forklare en sådan uoverensstemmelse. I forbindelse med vores undersøgelse spekulerer vi i, at omprogrammeringen af ​​fedtsyremetabolisme drevet af ekstracellulær acidose sandsynligvis er forbundet med dannelsen af ​​hukommelses-T-celler, selvom den præcise mekanisme, der ligger til grund for denne hypotese, kræver yderligere undersøgelse. Desuden fandt vi, at ↑[H+] eksponering hæmmede mTOR-aktivitet, som kan induceres af glykolytisk hæmning. Navnlig kan undertrykkelse af mTOR-signalering også bidrage til det metaboliske skift fra glykolyse til mitokondriel respiration. Faktisk udviste disse ↑[H+]-udvidede T-celler forbedret mitokondriel fitness, som det fremgår af markant øget SRC og mitokondriel masse og nedsat Δψm. Disse mitokondrielle signaturer, som er beriget med stamlignende T-celler og er relateret til lang levetid og overlegen antitumoraktivitet in vivo, er tæt moduleret af mitokondriel fusion og fissionsdynamik22,48,50. Mitokondrisk indre membranfusionsprotein OPA1 spiller en uundværlig rolle i hukommelse-T-cellegenerering50. I overensstemmelse hermed fandt vi, at ekstracellulær acidose også fremmede OPA1-ekspression i T-celler, hvilket til sidst resulterede i den morfologiske ligevægt mod fusion i T-celler. Mange cellulære metabolitter har vist sig at bidrage direkte til epigenetiske modifikationer. For eksempel kan et-kulstofmetabolisme generere den universelle methyldonor SAM til histonmethylering66.

Fig. 4|Mitokondriel fitness opretholdes i T-celler udsat for ↑[H+]. en SCENITH-analyse af de humane T-celler i kontrol- eller mælkesyre-konditionerede T-celler. Et repræsentativt oversættelsesniveau (anti-Puro) vises (n=3 uafhængige prøver). Den stiplede linje repræsenterer baggrundsniveauet opnået efter 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) behandling. b,c, Kvantitativ analyse af glykolytisk kapacitet (b) og mitokondriel afhængighed (c) inden for a. n=3 uafhængige prøver. d–f, OCR (d) af kontrol- og mælkesyre-konditionerede T-celler blev målt i realtid under basale forhold som reaktion på de angivne inhibitorer. FCCP, carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon; ROT/AA, rotenon og antimycin A. Repræsentativ statistisk analyse af basal OCR (e), maksimal respiration (e) og SRC (f). n=9 tests; 3 uafhængige prøver blev analyseret, og hver prøve blev målt 3 gange. g, h, ECAR (g) af kontrol- eller mælkesyre-konditionerede T-celler målt som respons på de angivne inhibitorer. Repræsentativ statistisk analyse af basal ECAR og understreget ECAR (h). n=9 tests; 3 uafhængige prøver blev påvist, og hver prøve blev målt 3 gange. i, Immunoblot-analyse af COXIV og TIM23 i humane T-celler under de angivne betingelser. Actin blev brugt som en ladningskontrol. j,k, Repræsentative histogrammer eller konturplot og statistisk analyse af henholdsvis mitokondriel masse (MTG) (j) og mitokondriel membranpotentiale (TMRM) (k), i kontrollen eller mælkesyre- eller pH 6.{{30} }konditionerede humane T-celler. n=3 uafhængige prøver. l,m, Repræsentativ mitokondriel morfologi af T-celler dyrket i kontroltilstanden, mælkesyre eller pH 6,6-tilstanden i 12 dage, analyseret ved EM (skala bar, 1 μM) (l). Arealet af individuelle mitokondrier i T-celler (m), n=45 celler. Data præsenteres som middel ± sem Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af uparret to-halet Student's t-test.

Fig. 5|↑[H+]-udvidede T-celler viser forbedret antitumoraktivitet. a,b, kontrol eller mælkesyre-ekspanderede CD8+ T-celler blev analyseret for persistens efter adoptiv overførsel (n=6 mus). Frisk isoleret muse-CD45.1+ OT-I T-celler blev aktiveret med muse-IL-2 og pladebundne anti-muse CD3- og anti-muse CD28-antistoffer i 2 dage og derefter holdt i et dyrkningsmedium med mus IL-2 indtil adoptiv overførsel (CD3&CD28+IL-2). Et skema over dyreforsøget (a) samt repræsentative FACS-plot og statistisk analyse af CD45.1+ og CD45.2+ T-celler i blodet er vist i (b). c–g, CD45.1+ OT-I T-celler blev ekspanderet i kontrol- eller mælkesyremedium i 7 dage og overført til B16-OVA-tumorbærende mus, og infiltrationen af ​​forholdet blev evalueret (n=5 mus). Et skema over dyreforsøget med B16-OVA-tumorbærende mus (c), samt repræsentative FACS-plot (venstre) og statistik for antallet (højre) af overførte CD45.1+ OT- I T-celler i tumoren (d). sc, subkutan injektion. Statistik for procentdelen af ​​CD45.1+ T-celler (e) og repræsentative data (venstre) og statistik for procentdelen (højre) af CD62L+ CD44+ CD45.1+ T-celler (f ) i milten er vist. Tumorvækstkurve (g) (n=5 mus, dag 14). h–j, CD19-CAR T-celler blev ekspanderet i kontrol- eller mælkesyremedium i 12 dage og overført til CD19-overudtrykkende K562-tumorbærende NCG-mus, og infiltrationsforholdet i tumor og milt var evalueret (n=6 mus). Et skematisk billede af dyreforsøget (h), en repræsentativ procentdel af overførte T-celler i tumoren og milten (i) og tumorvækstkurver (j) er vist (n=6 mus, dag 10). Data præsenteres som middel ± sem Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af uparret to-halet Student's t-test.

Fig. 6|↑[H+] eksponering begrænser udmattelse af T-celler. en Skematisk af kronisk stimulering af humane T-celler in vitro. b, Repræsentative FACS-plot for LAG-3 og TIM-3 i kronisk stimulerede humane T-celler dyrket under kontrol- eller mælkesyrebetingelser. n=3 uafhængige prøver. c, ekspressionen af ​​LAG-3 og TIM-3 i CD45.1+ TIL'er fra B16-OVA tumorbærende C57BL/6N mus (n=5 mus ). d, Kvantificering af ekspressionen af ​​LAG-3, TIM-3 og PD-1 i CD45.1+ TIL'er fra B16-OVA-tumor-bærende C57BL/ 6N mus (n=5 mus). e, ekspressionen af ​​LAG-3 og TIM-3 i tumorinfiltrerende CD19-CAR T-celler fra CD19-K562 tumorbærende NCG-mus, som bestemt ved flowcytometri (n=6 mus). f, ekspressionen af ​​TOX i CD45.1+ TIL'er fra B16-OVA tumorbærende C57BL/6N mus (n=5 mus). g, Histogrammerne og statistisk analyse af TOX i tumorinfiltrerende CD19-CAR T-celler fra CD19-K562 tumorbærende NCG-mus (n=6-mus). h, venstre, repræsentative flowcytometriplot for TIM-3 og TCF1 i CD45.1+ TIL'er fra B16-OVA-tumorbærende C57BL/6N-mus (n=5-mus) . Højre, procentdelen af ​​TCF1+ TIM-3- eller TCF1- TIM-3+-populationer. Data præsenteres som middel ± sem Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af uparret to-halet Student's t-test.

Metabolitter, såsom S-2-hydroxyglutarat og -hydroxybutyrat, er blevet rapporteret at fungere som epigenetiske regulatorer af memory-T-celledifferentiering67,68. Vores resultater viste, at vedvarende ↑[H+]-behandling begrænser methioninoptagelse og methioninmetabolisme med nedsat intracellulær methionin, SAM og SAH gennem inhibering af ekspressionen af ​​methionintransportører. Disse resultater kan delvist forklare, hvorfor T-celler ikke er i stand til at udkonkurrere tumorceller for methioninoptagelse i TME69. Mekanistisk viste vi, at ↑[H+] eksponering dramatisk reducerede MYC-ekspression og dets binding til SLC7A5-promotoren, hvilket resulterede i nedsat SLC7A5-ekspression og forringet methioninmetabolisme i T-celler. Spændende nok kan methionintilskud genoprette ekspressionen af ​​MYC og SLC7A5 såvel som fluxen af ​​methionincyklussen i ↑[H+]-eksponerede T-celler, hvilket tyder på, at genoprettelsen af ​​methioninoptagelsesevnen sandsynligvis skyldtes opregulering af methionintransporteren SLC7A5 på en MYC-afhængig måde. mTOR-aktivitet er blevet rapporteret at regulere MYC-oversættelse70. Derfor spekulerede vi i, at ↑[H+]-induceret nedregulering af MYC sandsynligvis skyldes translationel undertrykkelse gennem den progressive inhibering af mTOR og den svækkede optagelse af methionin. En sådan undertrykkelse kan vendes ved eksogent methionintilskud, selvom den præcise mekanisme kræver yderligere undersøgelse. SAM afledt af methionincyklussen er blevet anset for at mediere histonmethylering og epigenetisk remodellering under effektor-T-celledifferentiering8,71. I overensstemmelse med faldet af intracellulær SAM i ↑[H+]-udvidede T-celler fandt vi, at den totale overflod af H3K27me3 og dens belægning ved promotoren af ​​T-celle-stamme-loci begge var stærkt reduceret. H3K27me3 og H3K4me3 modificeres selektivt på en måde, der korrelerer med ekspressionen af ​​gener, der er centrale for effektor- eller stamness-programmet for T-celler14. Faktisk var der en lavere berigelse af H3K4me3 i effektor-gen-promotorer i ↑[H+]-ekspanderede T-celler. Således fører de reducerede niveauer af methyldonor-SAM som følge af nedsat methioninoptagelse og metabolisme under ↑[H+]-tilstanden til epigenetiske ændringer, der i sidste ende favoriserer T-celledifferentiering til hukommelsesstatus. Interessant nok redder tilsætningen af ​​methionin under ↑[H+]-eksponering ikke kun ekspressionen af ​​MYC og SLC7A5 i ↑[H+]-eksponerede T-celler, men genopretter også det totale niveau af H3K27me3-ekspression, hvilket understøtter en vigtig rolle for MYC-SLC7A5 -methionin-metabolismeakse til regulering af ↑[H+]-induceret epigenetisk stamness. Faktisk fandt vi, at overekspression af SLC7A5 delvist svækkede den ↑[H+]-inducerede stamness-lignende fænotype, hvilket yderligere understøttede den kritiske rolle af methionintransporteren SLC7A5 i erhvervelsen af ​​den T-cellehukommelseslignende fænotype under ↑[H+] eksponering.

De fleste TIL'er har historisk været antaget at være udmattede på grund af kontinuerlig TCR-eksponering i tumorer, men paradoksalt nok bevarer en lille undergruppe af T-celleklonotyper i TIL'er, der udtrykker transkriptionsfaktoren TCF1, stamcelle-lignende egenskaber. Vores resultater afslørede, at ↑[H+] eksponering udligner T-celle-effektorfunktion og bevarer T-celle-stamhed via MYC-SLC7A5-methionin-metabolismeaksen, hvilket giver en mulig forklaring på det nuværende paradoks, hvorfor en lille del af TIL'er stadig har stam- som hukommelse eller forløberegenskaber. Faktisk er lignende resultater blevet rapporteret, hvorved kaliumioner i TME spiller en dobbelt rolle, der påvirker både T-celle-effektorfunktion og stamness56,72, hvilket yderligere understøtter de komplekse virkninger af TME-immunsuppressive faktorer (f.eks. kronisk TCR-stimulering, hypoxi og lav glucose) på T-cellefunktion og differentiering. Derudover er de sure regioner i tumorer meget dynamiske og både rumligt og tidsmæssigt reguleret, og T-cellers egnethed tilpasset til ekstracellulær acidose overskygges sandsynligvis, når de støder på andre barske TME-faktorer, der kan påvirke intratumoral T-celle-effektorfunktion og differentiering. Derudover observerede vi højere ekspression af MYC i terminalt udmattede T-celler (LY108− TIM-3+) end i progenitor-udmattede T-celler (LY108+ TIM-3–), hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at MYClo T-celler fortrinsvis erhverver hukommelsesskæbnen73. I overensstemmelse med nedsat SLC7A5-ekspression og methioninoptagelse i ↑[H+ ]-eksponerede T-celler, var ekspressionen af ​​SLC7A5 også signifikant reduceret i LY108+ TIM-3-progenitor-udmattet T-cellepopulation i tumorer, hvilket tyder på, at MYC-SLC7A5-methionin-regulatoraksen også kan fungere in vivo. Det er nu tydeligt, at mindre differentierede stamlignende hukommelses-T-celler har overlegne antitumor-terapeutiske virkninger på grund af deres langsigtede persistens og modstand mod udviklingen af ​​dysfunktion51,74. Vi har heri leveret overbevisende beviser for, at langtids-↑[H+]-konditionerede CD8+ T-celler viste forbedret persistens og overlegen antitumorevne in vivo med en reduceret terminalt udmattet T-cellepopulation (TCF1− TIM{ {39}} ) og øget stamlignende progenitor-undergruppe (TCF1+ TIM-3–) i tumorer. Som konklusion giver vores nuværende undersøgelse indsigt i de multidimensionelle virkninger af ↑[H+] eksponering på undertrykkelsen af ​​T-celle-effektorfunktion og dens sammenfaldende indflydelse på T-celle-stamhed.

Metoder

Mus og cellelinjer

Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Suzhou Institute of Systems Medicine (ISM-IACUC-0151-R), og dyrene blev anbragt i specifikke patogenfrie musefaciliteter. Mus blev anbragt i standardforhold med 12-t/12-t lys/mørke cyklusser og en kontrolleret temperatur på 22-24 grader og luftfugtighed på 60 % med ubegrænset mad og vand tilgængelighed og blev undersøgt dagligt. Alle tumorbyrder oversteg ikke den tilladelse, der blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Suzhou Institute of Systems Medicine. CD45.1+ OT-I TCR-transgene hunmus på en C57BL/6N-baggrund blev anbragt sammen. CD45.2+ C57BL/6N hunmus i alderen 6-8 uger blev købt fra Vital River som modtagere. NCG-hun (NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) mus i alderen 6-8 uger blev købt fra GemPharmatech. Til et uafhængigt eksperiment in vivo blev CD45.1+- og CD45.2+-musene (6-12 uger) kønsmatchede. HEK-293T-celler fra American Type Culture Collection (ATCC) blev opretholdt i DMEM-medium suppleret med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % penicillin-streptomycin. Musemelanomcellelinjen B16, fra ATCC, blev transduceret til at udtrykke OVA og opretholdt i DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. K562-celler fra ATCC blev transduceret til at udtrykke human CD19 og dyrket i RPMI 1640-medium suppleret med 10 % FBS, 1 % penicillin-streptomycin, 1 % GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1 % ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 50-pyruvat μM -mercaptoethanol. Alle ovennævnte reagenser blev købt fra Gibco.

Primær T-celleisolering, aktivering og retroviral transduktion

Muse-CD{{0}} T-lymfocytter blev isoleret fra milten fra 6-12 ugers han- eller hun-OT-I-mus ved at bruge et CD8-naivt T-celleisoleringskit (BioLegend) og dyrket i RPMI{{5} } medium suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 M HEPES og 50 μM -mercaptoethanol i nærværelse af muse-IL -2 (20 U/ml, Peprotech). Til et uafhængigt eksperiment in vitro blev de anvendte han- og hunmus (6-12 uger) kønsmatchede. Oprensede celler blev aktiveret af anti-muse CD3 (2 ug/ml, BioLegend) og anti-muse CD28 (1 ug/ml, BioLegend) antistoffer i 48 timer. Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) fra raske donorer blev købt fra Sailybio og dyrket i RMPI-1640 medium suppleret med 5% Human Serum AB (Gemini), 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1 % GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 M HEPES og 50 μM -mercaptoethanol i nærværelse af human IL-2 (100 U/ml, Peprotech). Anti-humant CD3 (1 ug/ml, BioLegend) og anti-humant CD28 (1 ug/ml, BioLegend) monoklonale antistoffer blev brugt til at aktivere PBMC'er i 3 dage. Oprensede muse- og humane T-celler blev aktiveret og ekspanderet under de angivne dyrkningsbetingelser: pH 7,4, pH 6,6, mælkesyre (Sangon) eller natriumlactat (Sangon). Følgende metabolitter blev brugt til at supplere pH 6,6 eller mælkesyre (10 mM) medium: methionin 800 μM (MCE), SAM 100 μΜ (MCE) eller SAH 100 μM (Sigma). Til viral transduktion blev 1 × 106 PBMC'er aktiveret pr. brønd i 24-brøndsplader. Efter 48 timers aktivering blev størstedelen af ​​mediet erstattet med en ukoncentreret retroviral supernatant med 10 ug/ml polybren (Santa Cruz). Efter centrifugering ved 600 g i 90 minutter ved 30 grader blev celler dyrket i inkubatoren i 24 timer med frisk medium. Transduktionen blev gentaget 24 timer senere og derefter returneret til et frisk medium til dyrkning. Lavaffinitetsnervevækstfaktorreceptor (LNGFR) blev brugt til at kvantificere infektionseffektiviteten.

Flowcytometri

Celler blev farvet med fluorescerende antistoffer og derefter analyseret ved flowcytometri. Til overflademarkørfarvning blev celler farvet med fluorescerende konjugerede antistoffer og Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) i FACS-buffer (phosphatbufret saltvand (PBS) med 2% FBS), derefter fikseret med 2% paraformaldehyd (Casmart) i 20 min. ved stuetemperatur. Til intracellulær farvning af phosphoproteiner blev præ-farvede celler fikseret med en fikseringsbuffer (BioLegend) og derefter farvet med phosphospecifikke antistoffer i en permeabiliseringsbuffer (Invitrogen). Til påvisning af intracellulære cytokiner blev celler stimuleret med phorbolmyristatacetat (PMA) i nærvær af Brefeldin A (BFA) (BioLegend) i 4,5 timer. Derefter blev de præ-farvede celler fikseret og farvet med cytokinantistoffer i en permeabiliseringsbuffer. Til intracellulær transkriptionel-faktor-farvning blev celler præfarvet med Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit og fluorescenskonjugerede antistoffer i FACS-buffer for at detektere overflademarkører. Cellerne blev derefter fikseret i 30 minutter på is under anvendelse af FOXP3/Transcription Factor Fixation Buffer (Invitrogen) og farvet med transkriptionsfaktorantistoffer i Permeabilization Buffer. Efter farvning blev celler resuspenderet i FACS-buffer til flowcytometri. Flowcytometridata blev indsamlet af BD LSR Fortessa og BD FACSDiva (v8.0.2) og analyseret med FlowJo (v10.4) software. Repræsentative gating-strategier er tilvejebragt i udvidede data, figur 10b.

RNA-sekventering

RNA-seq-analyse blev udført under anvendelse af 12-dag-ekspanderede T-celler dyrket under de angivne betingelser som vist i fig. 1a. Kort fortalt, 12 dage efter T-celleekspansion blev total-RNA ekstraheret ved homogenisering i TRIzol (Takara) og frysning i RNase-fri rør med flydende nitrogen. RNA-integriteten blev evalueret ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotekerne blev konstrueret ved hjælp af TruSeq RNA prøveforberedelseskit (FC-122-1001, Illumina). Bibliotekerne blev derefter sekventeret ved hjælp af en Illumina NovaSeq 6000 (PE150) platform, og ca. 40 millioner parrede ende-læsninger blev genereret (Novogene). De rå læste tællinger blev ekstraheret og derefter normaliseret ved deres biblioteksstørrelsesfaktorer under anvendelse af DESeq2 (v1.28.1). Den regulariserede logaritme (r-log) transformation blev brugt til at stabilisere variansen på tværs af prøverne. GO og KEGG pathway berigelsesanalyse af differentielt udtrykte gener blev udført med klyngeprofil (v3.16.0). Ekspressionsvarmekort blev genereret med R-pakken 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA v.4.0 blev brugt til GSEA-analyse.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq blev udført som tidligere beskrevet75 under anvendelse af Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina (TD903, Vazyme). Kort fortalt blev humane T-celler udvidet i 12 dage under kontrolbetingelser, mælkesyre eller mælkesyre med 800 μM methionin. Derefter blev 1 x 105 T-celler lyseret til ekstraktion af nukleinmaterialer og blev inkuberet med ConA-perler ved stuetemperatur i 10 minutter. Celler blev resuspenderet i 50 µL antistofbuffer forblandet med primært antistof (anti-H3K27me3 eller anti-H3K4me3) og inkuberet natten over ved 4 grader. Prøverne blev inkuberet med det sekundære antistof ved stuetemperatur i 30 minutter og blev derefter co-inkuberet med protein A/G-Tn5 transposasen ved stuetemperatur i 1 time for at forstyrre DNA-fragmenteringen. Oprenset DNA blev anvendt til biblioteksfremstilling og sekventeret under anvendelse af PE150 af Illumina Nova6000 sekventeringsapparat.

CUT&Tag-seq analyse

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) blev brugt til at kontrollere sekventeringslæsekvaliteten. Aflæsninger blev kvalitetstrimmet til et minimum Phred-score på 20 ved hjælp af trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Alle læsninger produceret af CUT&Tag-seq af H3K27me3 og H3K4me3 blev justeret til det humane hg38-genom ved hjælp af Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) med muligheder: –local– very-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. Prøverne uden spike-in-DNA blev normaliseret ved hjælp af ChIPseqSpikeInFree-metoden, som er en ny normaliseringsmetode til effektivt at bestemme skaleringsfaktorer for prøver på tværs af forskellige tilstande og behandlinger76. For H3K27me3 blev peaks kaldt ved hjælp af MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_calling_macs .html) med muligheder '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. Til H3K4me3 brugte peak calling MACS2 med parametrene '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. Toppe blev kommenteret med ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), og visualiseringer blev oprettet ved hjælp af deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en) /develop/) og pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

QRT-PCR

Totalt RNA blev isoleret med TRIzol (Takara) og revers transkriberet til cDNA med HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme) i henhold til producentens instruktioner. Til kvantitativ realtids-PCR blev ABI prisme 7500 realtids-PCR-systemet (Thermo Fisher) og 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) brugt i henhold til producentens instruktioner. ACTB blev brugt som en intern standard. Den relative ekspression af mRNA blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden. Primersekvenser brugt til qPCR kan findes i supplerende tabel 1.

Western blotting

Til proteinekspressionsanalyse blev celler opsamlet og vasket med kold PBS, og det totale protein blev ekstraheret ved at bruge 1% SDS (Sangon) på is. Proteinkoncentration blev målt med et BCA-proteinassay-kit (Merck). Proteinprøver blev adskilt af SDS-PAGE-geler og derefter overført til PVDF-membraner (Millipore). Membraner blev blokeret med 5 % fedtfri mælk i PBS indeholdende Tween20. Efter blokering blev membraner inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 grader og HRP-koblede sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur. HRP-signalet blev udviklet ved elektrokemiluminescens (ChemeMINI610) og opsamlet af Sage Capture (v2.19.12). Dataanalyse blev udført ved hjælp af ImageJ (v1.8.0) software.

Mitokondriel morfologisk analyse

I hver brønd på {{0}}brøndsplader blev PBMC'er aktiveret af humane anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer i 3 dage og blev dyrket i RPMI-1640-medium under forskellige betingelser i 12 dage. Derefter blev 1 x 106 PBMC'er opsamlet og fikseret i en forafkølet fikseringsbuffer (2,5% glutaraldehyd, 0,1 M phosphatbuffer (PB), pH 7,4) natten over ved 4 grader. Efter at være blevet vasket med PBS tre gange, blev cellerne efterfikseret i 1 % osmiumtetroxid i PBS i 2 timer, dehydreret og indlejret i Spurrs harpiks ifølge standardproceduren. Ultratynde snit blev farvet med uranylacetat og blycitrat. Mitokondriel morfologi blev afbildet ved hjælp af Hitachi HT-7800 transmissionselektronmikroskopi (TEM) (v01.20) og AMT-XR81DIR-kamera.

Antistoffer og reagenser

Antistoffer anvendt til flowcytometrisk analyse var som følger. APC anti-human NGFR (kat. nr. 345108, 1:1,000 for FACS), FITC anti-human CD4 (kat. nr. 357406, 1:200 for FACS), Pacific Blue anti-human CD8 (kat. nr. 300928, 1:200 for FACS), APC-Cy7 anti-human/mus CD44 (kat. nr. 103028, 1:200 for FACS), PE anti-human CCR7 (kat. nr. 353204, 1 :200 for FACS), PE anti-human TNF- (kat. nr. 502909, 1:200 for FACS), PE-Cy7 anti-human CD45RO (kat. nr. 304230, 1:200 for FACS), APC anti- human IFN- (kat. nr. 502512, 1:200 for FACS), PE-Cy7 anti-human LAG-3 (kat. nr. 369310, 1:200 for FACS), PE anti-human TIM{{ 52}} (kat. nr. 345006, 1:200 for FACS), BV711 anti-human PD-1 (kat. nr. 329928, 1:200 for FACS), Percp-Cy5.5 anti-human CD62L (kat. nr. 304824, 1:200 for FACS), APC anti-human CD27 (kat. nr. 302810, 1:200 for FACS), BV711 anti-mus CD8 (kat. nr. 100748, 1:200 for FACS ), PE-Cy7 anti-mus CD62L (kat. nr. 104418, 1:200 for FACS), APC-Cy7 anti-mus CD45.2 (kat. nr. 830789, 1:200 for FACS), Pacific Blue anti- mus CD45.1 (kat. nr. 110722, 1:200 for FACS), APC anti-mus Ly108 (kat. ingen. 134610, 1:200 for FACS), PE anti-mus LAG-3 (kat. nr. 125207, 1:200 for FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC antistof (kat. nr. 626811, 1 :200 for FACS), PE anti-mus TNF- (kat. nr. 506306, 1:200 for FACS) og APC anti-mus IFN- (kat. nr. 505810, 1:200 for FACS) blev købt fra BioLegend . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 anti-mus PD-1 (kat. nr. 46-9981-82, 1:200 for FACS), PE phosphor-S6 (Ser235/236) (kat. .nr. 12-9007-42, 1:200 for FACS), PE anti-menneske/mus TOX (kat. nr. 12-6502-82, 1:200 for FACS) og PE-Cy7 anti-mus TIM{ {149}} (kat. nr. 25-5870-82, 1:200 for FACS) blev købt hos Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (kat. nr. 6709, 1:200 for FACS) og phosphor-4E-BP1 (Thr37/46) (kat. nr. 2846, 1:200 for FACS) blev købt hos Cellesignalteknologi. Alexa Fluor 647 anti-puromycin (kat. nr. MABE343-AF647, 1:800 for FACS) blev købt hos Merck. Antistoffer anvendt til western blots var som følger. Kanin anti-phospho-Akt (Ser473) (kat. nr. 4060, 1:1,000 for IB), anti-phospho-NF-κB p65 (Ser536) (kat. nr. 3033, 1:1 ,000 for IB), anti-c-MYC (kat. nr. 18583, 1:1,000 for IB), anti-EZH2 (kat. nr. 5246, 1:1,{ {200}} for IB), anti-tri-methyl-histon H3 (Lys27) (kat. nr. 9733, 1:1,000 for IB), anti-tri-methyl-histon H3 (Lys4) (kat. nr. 9751, 1:1,000 for IB), anti-di-methylhiston H3 (Lys9) (kat. nr. 4658, 1:1,000 for IB) , anti-di-methyl-histon H3 (Lys79) (kat. nr. 5427, 1:1,000 for IB), anti-histon H3 (kat. nr. 9715, 1:1,{{242 }} for IB), anti-COXIV (kat. nr. 850, 1:1,000 for IB), anti-kanin IgG (HRP-bundet) (kat. nr. 7074, 1:2,{ {253}} for IB), og anti-muse IgG (HRP-linked) (kat. nr. 7076, 1:2,000 for IB) blev købt fra Cell Signaling Technology. Mus anti-Tim23 (kat. nr. 611223, 1:1,000 for IB) var fra BD Biosciences. Muse anti- -aktin (kat. nr. 66009-1-Ig, 1:5,000 for IB), anti-SLC7A5 (kat. nr. 67951-1-Ig, 1: 1,000 for IB), og kanin-anti-SLC38A1 (kat. nr. 12039-1-AP, 1:1,000 for IB) var fra Proteintech. Kanin anti-SLC38A2 (kat. nr. BMP081, 1:1,000 for IB) blev købt fra Medical & Biological Laboratories.

T-celle metabolisk assay

For at kontrollere BODIPY FL C16-optagelsen i kontrol- eller ↑[H+]-behandlede T-celler blev T-celler dyrket med frisk opløst 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) i 1 time, derefter vasket to gange med PBS før overfladefarvning. For yderligere at udforske den metaboliske afhængighed i forskellige behandlingsgrupper blev eksperimenter udført ved hjælp af SCENITH-metoden (enkeltcellet energisk metabolisme ved profilering af translationsinhibering)42. Kort fortalt blev T-celler podet i 96-brøndsplader ved 1 x 106 celler/ml. Derefter blev celler behandlet med kontrol (Ctrl), 2-deoxy-d-glucose (slutkoncentration 100 mM), oligomycin (slutkoncentration 5 μM) eller en blanding af inhibitorerne ved de endelige koncentrationer i 40 minutter ved 37 grad. Puromycin (slutkoncentration 10 ug/ml) blev tilsat i løbet af de sidste 30 min. Efter puromycinbehandling blev cellerne vasket med kold PBS og præfarvet med Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit og antistoffer mod overflademarkører. Farvningen af ​​intracellulær puromycin blev efterfulgt af farvningsprocessen for intracellulære transkriptionsfaktorer.

Metabolomisk analyse med LC-MS/MS

Metabolomisk analyse og prøveindsamling blev udført som i tidligere rapporter77. Kort fortalt blev PBMC'er aktiveret individuelt i 24-brøndsplader af humant anti-CD3/CD28 i 3 dage og blev dyrket i RPMI 1640 medium med kontrol eller mælkesyre til dag 12. Derefter 8 × 106 celler pr. prøve (n=4 uafhængige prøver pr. gruppe) blev opsamlet og overført til et 1.5-ml rør til centrifugering ved 300 g i 5 minutter ved 4 grader og derefter vasket med kold PBS. Efter centrifugering ved 300 g i 5 minutter igen, blev 80% kold methanol tilsat og kraftigt vortexet for at afbryde cellepelleten fuldstændigt, og derefter blev cellerne overført til en fryser ved -80 grader. Prøver blev centrifugeret ved 12,000 g i 10 minutter ved 4 grader. Supernatanten blev opsamlet. Til sidst blev ekstrakterne lyofiliseret og analyseret ved UHPLC-MS/MS i Novogene. De rå datafiler genereret af UHPLC–MS/MS blev behandlet ved hjælp af Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) til at udføre topjustering, topplukning og kvantificering for hver metabolit. Metaboanalytiker (v5.0) software blev brugt til yderligere dataanalyse, og derefter blev signifikant berigede veje udvalgt ved brug af P < 0,05.

Eksperimenter med stabil-isotop-mærkning

Den 13C metaboliske flux blev udført på T-celler ved hjælp af tidligere beskrevne metoder60,78,79. Kort fortalt blev PBMC'er aktiveret pr. brønd i 24-brøndsplader med humant anti-CD3/CD28 i 3 dage som beskrevet ovenfor. Til [13C6] glucosesporing blev mediet efter 11 dage skiftet til glucosefri RPMI (Gibco) suppleret med 10% dialyseret FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 50 μM -mercaptoethanol og 0,1 M HEPES, indeholdende 11 mM [13C6]glucose (Cambridge Isotope Laboratories) med kontrol eller 10 mM mælkesyre, i 24 timer. Til [13C16]palmitatsporing blev 2 × 107 T-celler aktiveret og anbragt i et komplet medium med kontrol- eller 10 mM mælkesyrebetingelser som beskrevet ovenfor på dag 12, indeholdende 200 μM [13C16]palmitat (Cambridge Isotope Laboratories) i 8 h. Til sporing af [13C5]methionin blev T-celler udvidet under kontrol, mælkesyre eller mælkesyre med 800 μM methioninbetingelser i 12 dage. Derefter blev 4 × 107 T-celler skiftet til methioninfrit komplet RPMI-medium (Gibco) og dyrket under kontrolbetingelser, mælkesyre eller mælkesyre suppleret med methionin (indeholdende 100 μM, 100 μM eller 800 μM [13C5]methionin) (Cambridge Isotope Laboratories), i 8 timer. De respektive supernatanter blev opsamlet og derefter opbevaret ved -80 grader. Celler blev pelleteret ved centrifugering (300 g, 4 grader, 5 minutter), vasket to gange med saltvand og straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 grader. Metabolitter blev ekstraheret ved at bruge iskold HPLC-kvalitet 80% methanol og vortexbehandles kort efterfulgt af tilsætning af 200 ml HPLC-kvalitet vand, derefter 500 ml HPLC-kvalitet chloroform (methanol:vand:chloroform-forhold, 5:2:5 ). Blandingen blev vortexet og centrifugeret for at opnå faseadskillelse. Supernatanterne blev tørret ved vakuumspin til efterfølgende derivatisering og derefter inkuberet med 2% (vægt/vol) methoxyaminhydrochlorid (226904, Sigma-Aldrich) i pyridin i 60 minutter ved 37 grader og silyleret med N-methyl-N-( tert-butyldimethylsilyl) trifluoracetamid med 1 % tert-butyldimethylchlorsilan (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) i 30 minutter ved 45 grader. [13C6]glucosederivaterne blev analyseret med GC-HRMS, Trace 1310-gaskromatografen (Thermo Fisher) med DB-35MS-søjlen (Agilent Technologies) og Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS-systemet (Thermo Fisher). GC–MS/MS metabolomiske assays blev udført af Metabo-Profile. Metabolitterne blev identificeret og kvantificeret af Xcalibur (v4.1) og TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), inklusive retentionstid, ladning-til-masse-forhold mellem ionfragmenter og topintensitet. [13C16]palmitat- og [13C5]methioninderivaterne blev analyseret ved ultrahøjtryksvæskekromatografi-tredobbelt kvadrupol massespektrometer (UPLC-TQMS). De rå data fra UPLC-TQMS blev analyseret ved hjælp af Waters' MassLynx-software (v4.1, Waters) til topekstraktion, integration, identifikation og kvantificering af metabolitterne. R-sprog (v4.1.1) blev brugt til efterfølgende statistisk analyse.

B16 tumormodel og adoptiv celleoverførselsimmunterapi

For at undersøge antitumoraktiviteten af ​​T-celler in vivo blev 0.2 × 106 B16-OVA melanomceller subkutant injiceret i C57BL/6N hunmus. Ni dage efter tumorimplantation blev mus intravenøst ​​injiceret med 5 x 106 T-celler fra hun-OT-I-mus ekspanderet i 7 dage under forskellige betingelser. Tumorbærende mus modtog 5 Gy subletal bestråling før ACT. Tumorområdet blev målt hver anden dag og beregnet som længde (mm) x bredde (mm). Mus med et tumorområde, der nærmede sig 300 mm2, blev aflivet. For at udforske persistensen af ​​ekspanderede T-celler under forskellige forhold blev 4 × 106 CD45.1+ T-celler fra hun-OT-I-mus adoptivt overført til hun-C57BL/6N-mus. En uge senere blev mus aflivet, og cellerne fra isoleret blod, milte og lymfeknuder blev talt. Andelen af ​​overførte T-celler blev bestemt ved gating på T-celler, der udtrykker CD45.1+ og CD45.2+ gennem flowcytometri.

NCG-musemodel og CD19-CAR-T-terapi

NCG-hunmus blev implanteret subkutant med 1 × 106 CD19-K562-celler. Når tumorvolumener nåede 75 mm3, modtog mus 5 × 106 ikke-transducerede T-celler og CD19-CAR T-celler dyrket i kontrol- eller 10 mM mælkesyreholdigt medium. Tumorvækst blev målt hver 2. dag med elektroniske skydelære og beregnet ved længde (mm) × bredde (mm). Mus med et tumorareal større end 300 mm2 blev aflivet. Tumorerne blev opsamlet, fordøjet og behandlet med Percoll (Sigma), og derefter blev T-cellefunktionen og fænotypen bestemt ved flowcytometri.

Basal iltforbrugshastighed og ekstracellulær forsuringshastighedsanalyse

Til analyse af metaboliske karakteristika blev OCR og ECAR vurderet med søhest XF24 analysator (Agilent). Kort fortalt blev humane T-celler dyrket under forskellige betingelser i 12 dage forbehandlet med ikke-pufret XF-medium (ikke-pufret RPMI 1640 indeholdende 10 mM glucose, 1 mM natriumpyruvat og 2 mM glutamin) . Derefter blev humane T-celler podet med 0,5 × 106 celler pr. brønd i en XF24-cellekulturmikroplade og inkuberet i en ikke-CO2-inkubator i 1 time ved 37 grader. For at forbedre cellevedhæftningen blev pladerne centrifugeret ved stuetemperatur i 5 minutter ved 100 g uden bremse. Iltforbrug og ekstracellulær forsuring blev analyseret under basale forhold og som svar på 1,25 μM oligomycin, 50 mM 2-deoxy-d-glucose, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM rotenon og 0,5 μM antimycin A. SRC blev beregnet ved at subtrahere den basale OCR fra den maksimale OCR.

ChIP–qPCR

Chromatin-immunpræcipitation (ChIP) blev udført efter producentens instruktioner, der fulgte med ChIP-IT Express enzymatiske skæresæt (Active Motif). Kort fortalt blev 15 millioner humane T-celler dyrket under kontrol- eller 10 mM mælkesyrebetingelser fikseret med formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, og fikseringsreaktionen blev stoppet ved tilsætning af 1 x glycin. Faste celler blev pelleteret med PMSF og proteininhiberingscocktail og opbevaret ved -80 grader før cellelyse. Derefter blev den optøede pellet resuspenderet i 1 ml iskold lyseringsbuffer med PMSF og proteininhiberingscocktail på is i 30 minutter for at opnå nukleart materiale. Den nukleare pellet blev derefter resuspenderet og fordøjet med en enzymatisk cocktail for at forskyde kromatin i 15 minutter ved 37 grader. Sheared chromatin blev inkuberet med protein G magnetiske perler med anti-c-MYC (CST, kat. nr. 18583, 1:100 for ChIP) og anti-IgG (CST, kat. nr. 2729, 1:100 for ChIP) kl. 4 grader natten over. Derefter blev magnetiske perler vasket med ChIP-buffere fire gange og elueret med 50 ul elueringsbuffer. Det eluerede DNA blev omvendt tværbundet i 2,5 timer ved 65 grader og derefter oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion. Det oprensede DNA blev brugt til at udføre ChIP-qPCR for at detektere berigelsen af ​​MYC ved målgenernes promotorer. De primere, der bruges til ChIP-qPCR, kan findes i supplerende tabel 2.

Mitokondriel masse- og membranpotentialeanalyse

Mitokondriel masse og membranpotentiale blev analyseret ved hjælp af MitoTracker Green og tetramethyrhodamine methylester (TMRM). Celler blev farvet med 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) eller 50 nM TMRM (Thermo Fisher) i en inkubator ved 37 grader (5% CO2) i 1 time før celleoverfladefarvning. Celler blev vasket med FACS-buffer tre gange efterfulgt af overflademarkører-farvning til yderligere FACS-analyse.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism version 8.0. Resultaterne vises som middel ± sem To-halede Students t-test blev brugt til at sammenligne behandlinger med kontrolgrupper. To-vejs ANOVA med Tukey's Sidaks eller Dunnetts multiple-sammenligningstest blev anvendt til multiple sammenligninger. P < 0.05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Referencer

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T-hukommelsesstamceller i sundhed og sygdom. Nat. Med. 23, 18-27 (2017).

2. Gao, S. et al. Stamcelle-lignende hukommelse T-celler: et perspektiv fra den mørke side. Cell Immunol. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Adoptiv celleoverførsel som personlig immunterapi til human cancer. Science 348, 62-68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Kræftimmunterapi ved hjælp af checkpoint blokade. Science 359, 1350-1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Stam-, effektor- og hybridtilstande af hukommelses-CD8+ T-celler. Trends Immunol. 41, 17-28 (2020).

6. Galletti, G. et al. To undergrupper af stamlignende CD8+-hukommelses-T-celle-stamceller med distinkte skæbneforpligtelser hos mennesker. Nat. Immunol. 21, 1552-1562 (2020).

7. Gattinoni, L. et al. En human hukommelse T-celle undergruppe med stamcelle-lignende egenskaber. Nat. Med. 17, 1290-1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC Metabolisk og epigenetisk regulering af T-celleudmattelse. Nat. Metab. 2, 1001-1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Transkriptionel kontrol af effektor- og hukommelses-CD8+ T-celledifferentiering. Nat. Rev. Immunol. 12, 749-761 (2012).

10. Huang, Q. et al. Den primordiale differentiering af tumor-specifikke hukommelse CD8+ T-celler som bona fide respondere på PD-1/PD-L1 blokade i drænende lymfeknuder. Cell 185, 4049-4066 (2022).

11. Siddiqui, I. et al. Intratumoral Tcf1+ PD-1+ CD8+ T-celler med stamlignende egenskaber fremmer tumorkontrol som reaktion på vaccination og checkpoint-blokade-immunterapi. Immunity 50, 195-211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. Væsentlig rolle for Wnt-pathway-effektoren Tcf-1 til etablering af funktionel CD8 T-cellehukommelse. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 9777-9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP Epigenetisk kontrol af CD8+ T-celledifferentiering. Nat. Rev. Immunol. 18, 340-356 (2018).

14. Crompton, JG et al. Slægtsforholdet mellem CD8+ T-celleundersæt afsløres af progressive ændringer i det epigenetiske landskab. Cell Mol. Immunol. 13, 502-513 (2016).

15. Yu, B. et al. Epigenetiske landskaber afslører transkriptionsfaktorer, der regulerer CD8+ T-celledifferentiering. Nat. Immunol. 18, 573-582 (2017).

16. Araki, Y. et al. Genom-dækkende analyse af histonmethylering afslører kromatintilstandsbaseret regulering af gentranskription og funktion af hukommelses-CD8+ T-celler. Immunity 30, 912-925 (2009).

17. Møller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Metaboliske programmer skræddersy T-celleimmunitet ved virusinfektion, cancer og aldring. Celle Metab. 34, 378-395 (2022).

18. Phan, AT et al. Konstitutiv glykolytisk metabolisme understøtter CD8+ T-celle-efektorhukommelsesdifferentiering under virusinfektion. Immunity 45, 1024-1037 (2016).

19. Sinclair, LV et al. Antigenreceptorkontrol af methioninmetabolisme i T-celler. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. et al. Hukommelses-CD8+ T-celler bruger celle-iboende lipolyse til at understøtte den metaboliske programmering, der er nødvendig for udvikling. Immunity 41, 75-88 (2014).

21. Pearce, EL et al. Forbedring af CD8 T-cellehukommelse ved at modulere fedtsyremetabolismen. Nature 460, 103-107 (2009).

22. Van der Windt, GJ et al. Mitokondriel respirationskapacitet er en kritisk regulator for udvikling af CD8+ T-cellers hukommelse. Immunity 36, 68-78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Det sure tumormikromiljø som en drivkraft for cancer. Annu. Rev. Physiol. 82, 103-126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T-celledysfunktion i cancer. Cancer Cell 33, 547-562 (2018).

25. Scharping, NE et al. Tumormikromiljøet undertrykker t-celle mitokondriel biogenese for at drive intratumoral t-celle metabolisk insufficiens og dysfunktion. Immunity 45, 374-388 (2016).

26. Yu, YR et al. Forstyrret mitokondriel dynamik i CD8+ TIL'er forstærker udmattelse af T-celler. Nat. Immunol. 21, 1540-1551 (2020).

27. Chang, CH et al. Metabolisk konkurrence i tumormikromiljøet er en drivkraft for kræftprogression. Celle 162, 1229-1241 (2015).

28. Scharping, NE et al. Mitokondriel stress induceret af kontinuerlig stimulering under hypoxi driver hurtigt udmattelse af T-celler. Nat. Immunol. 22, 205-215 (2021).

29. Jansen, CS et al. En intratumoral niche vedligeholder og differentierer stamlignende CD8 T-celler. Nature 576, 465-470 (2019).

30. Im, SJ et al. Definition af CD8+ T-celler, der giver den proliferative burst efter PD-1-behandling. Nature 537, 417-421 (2016).

31. Haas, R. et al. Lactat regulerer metaboliske og pro-inflammatoriske kredsløb til kontrol af T-celle migration og effektorfunktioner. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. et al. T-celler producerer sure nicher i lymfeknuder for at undertrykke deres egne effektorfunktioner. Nat. Commun. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. et al. Modulation af surhedsgrad i mikromiljøet reverserer anergi i humane og murine tumorinfiltrerende T-lymfocytter. Cancer Res. 72, 2746-2756 (2012). 34. Gottfried, E. et al. Tumor-afledt mælkesyre modulerer dendritiske celleaktivering og antigenekspression. Blood 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR et al. Funktionel polarisering af tumor-associerede makrofager af tumor-afledt mælkesyre. Nature 513, 559-563 (2014).

36. Erra Diaz, F. et al. Ekstracellulær acidose og mTOR-hæmning driver differentieringen af ​​humane monocyt-afledte dendritiske celler. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. et al. Hæmning af glykolytisk metabolisme forbedrer CD8+ T-cellehukommelse og antitumorfunktion. J. Clin. Investere. 123, 4479-4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. Modulation af mTOR-signalering udløser dannelsen af ​​stamcelle-lignende hukommelses-T-celler. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN et al. mTORC1 og mTORC2 regulerer selektivt CD8+ T-celledifferentiering. J. Clin. Investere. 125, 2090-2108 (2015).

40. Zhang, L. et al. Pattedyrmål for rapamycinkompleks 2 kontrollerer CD8 T-cellehukommelsesdifferentiering på en Foxo1-afhængig måde. Cell Rep. 14, 1206-1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. Rolle af mTOR-signalering i tumorcellemotilitet, invasion og metastase. Curr. Protein Pept. Sci. 12, 30-42 (2011).

42. Arguello, RJ et al. SCENITH: en flowcytometri-baseret metode til funktionelt at profilere energimetabolisme med enkeltcellet opløsning. Celle Metab. 32, 1063-1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. et al. Mitokondriel biogenese og proteomomdannelse fremmer et-kulstofmetabolisme til T-celleaktivering. Celle Metab. 24, 104-117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Fueling T-celle antitumor immunitet: aminosyremetabolisme revisited. Cancer Immunol. Res. 9, 1373-1382 (2021).

45. Kakaradov, B. et al. Tidlig transkriptionel og epigenetisk regulering af CD8+ T-celledifferentiering afsløret ved enkeltcellet RNA-sekventering. Nat. Immunol. 18, 422-432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Aminosyrer og deres transportører i T-celleimmunitet og cancerterapi. Mol. Celle 80, 384-395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Kvantitativ analyse af, hvordan Myc kontrollerer T-celleproteomer og metaboliske veje under T-celleaktivering. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. et al. Mitokondrielt membranpotentiale identificerer celler med forbedret stamness til cellulær terapi. Celle Metab. 23, 63-76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 øger CAR-T-celle antitumoraktivitet ved at reducere mTORC1-aktivitet og bevare deres stamcellehukommelsesfænotype. Cancer Immunol. Res. 7, 759-772 (2019).

50. Buck, MD et al. Mitokondriel dynamik styrer T-cellernes skæbne gennem metabolisk programmering. Celle 166, 63-76 (2016).

51. Krishna, S. et al. Stamlignende CD8 T-celler medierer responsen af ​​adoptivcelleimmunterapi mod human cancer. Science 370, 1328-1334 (2020).

52. Burger, ML et al. Antigendominanshierarkier former TCF1+ progenitor CD8 T-cellefænotyper i tumorer. Cell 184, 4996-5014 (2021).

53. Guo, Y. et al. Metabolisk omprogrammering af terminalt udmattede CD8+ T-celler med IL-10 øger antitumorimmuniteten. Nat. Immunol. 22, 746-756 (2021).

54. Klein Geltink, RI et al. Metabolisk konditionering af CD8+ efektor T-celler til adoptiv celleterapi. Nat. Metab. 2, 703-716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamin regulerer antitumoraktiviteten af ​​CD8 T-celler. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11-15 (2020).

56. Vodnala, SK et al. T-celle-stamhed og dysfunktion i tumorer udløses af en fælles mekanisme. Science 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. et al. Forspændt aktivering af humane T-lymfocytter på grund af lav ekstracellulær pH-værdi antagoniseres af B7/CD28-costimulering. Eur. J. Immunol. 31, 2829-2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Laktatopbygning på stedet for kronisk inflammation fremmer sygdom ved at inducere CD4+ T-celle metabolisk omledning. Celle Metab. 30, 1055-1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Lactat øger stammen af ​​CD8+ T-celler for at øge antitumorimmuniteten. Nat. Commun. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG et al. Methioninmetabolisme former T-hjælpercelleresponser gennem regulering af epigenetisk omprogrammering. Celle Metab. 31, 250-266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. Metabolisk kontrol af CD8+ T-celles skæbnebeslutninger og antitumorimmunitet. Trends Mol. Med. 24, 30-48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Glukosedeprivation hæmmer flere nøglegenekspressionsbegivenheder og effektorfunktioner i CD8+ T-celler. Eur. J. Immunol. 38, 2438-2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. et al. Hukommelses-CD8+ T-celler bruger celle-iboende lipolyse til at understøtte den metaboliske programmering, der er nødvendig for udvikling. Immunity 49, 375-376 (2018).

64. Lin, R. et al. Fedtsyreoxidation kontrollerer CD8+-vævsresident hukommelses-t-celleoverlevelse i gastrisk adenocarcinom. Cancer Immunol. Res 8, 479-492 (2020).

65. Raud, B. et al. Etomoxir-virkninger på regulatoriske og hukommelses-T-celler er uafhængige af Cpt1a-medieret fedtsyreoxidation. Celle Metab. 28, 504-515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Metaboliske input til epigenomet. Celle Metab. 25, 544-558 (2017).

67. Tyrakis, PA et al. S-2-hydroxyglutarat regulerer CD8+ T-lymfocytskæbne. Nature 540, 236-241 (2016).

68. Zhang, H. et al. Ketogenese-genereret beta-hydroxybutyrat er en epigenetisk regulator af CD8+ T-cellehukommelsesudvikling. Nat. Cell Biol. 22, 18-25 (2020).

69. Bian, Y. et al. Kræft SLC43A2 ændrer T-celle methionin metabolisme og histon methylering. Nature 585, 277-282 (2020).

70. Wall, M. et al. Translationel kontrol af c-MYC med rapamycin fremmer terminal myeloid differentiering. Blood 112, 2305-2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Metabolisk kontrol af epigenetik og dens rolle i CD8+ T-celledifferentiering og funktion. Foran. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. Ionisk immunsuppression i tumormikromiljøet begrænser T-celleeffektorfunktionen. Nature 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. et al. cBAF komplekse komponenter og MYC samarbejder tidligt i CD8+ T-cellernes skæbne. Nature 607, 135-141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Metabolisk kontrol af hukommelse T-celle generation og stamness. Cold Spring Harb. Perspektiv. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS et al. CUT&Tag til effektiv epigenomisk profilering af små prøver og enkeltceller. Nat. Commun. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: en ChIP-seq-normaliseringstilgang til at afsløre globale ændringer i histonmodifikationer uden spike-in. Bioinformatics 36, 1270-1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Metabolitekstraktion fra suspensionsdyrkede pattedyrsceller til global metabolitprofilering. Nat. Protoc. 6, 1241-1249 (2011).

78. Li, C. et al. Aminosyrekatabolisme regulerer hæmatopoietisk stamcelleproteostase via en GCN2-eIF2-akse. Celle Stamcelle 29, 1119-1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. Den mitokondrielle pyruvatbærer regulerer hukommelse T-celledifferentiering og antitumorfunktion. Celle Metab. 34, 731-746 (2022).