Udforskning af potentialet ved Nannochloropsis Sp. Ekstrakt til kosmetiske applikationer

Nøgleord:Nannochloropsis; antioxidant; anti-melanogene; hudfugtende; UV-beskyttelse;anti aldring

Klik her for at få flere oplysninger om Cistanche For Anti-aging

1. Introduktion

Huden er det største organ, der dækker hele menneskekroppen og giver en fysiskbarriere for at beskytte det indre væv mod eksterne stimuli såsom ultraviolet (UV)stråling, kemikalier, patogener og fysiske belastninger [1,2]. Derudover har det fysiologiskvigtige roller i at hjælpe med at opretholde organismer, herunder bevarelse afvand, immunologiske funktioner, sanseopfattelse og regulering af kropstemperatur [3,4]. Huden består af tre lag: epidermis, dermis og hypodermis. I denepidermis, keratinocytter, Langerhans, melanocytter og talgkirtler spiller afgørenderoller i reparation af hudskader, bestemmelse af hudfarve, beskyttelse af huden mod UVstråling, giver immunitet og smører huden. I dermis, placeret nedenunderepidermis, dominerende fibroblastceller producerer kollagen og elastiske fibre. Kollagengiver trækstyrke og sejhed til at modstå deformation, hvorimod elastin giverelasticitet og fleksibilitet, hvilket gør det muligt for væv at vende tilbage til deres oprindelige form ved fjernelse afden deformerende kraft. Kollagen og elastin er tværbundet for at give strukturel støtte tilhuden [4–7]. Hyaluronsyre (HA), en glycosaminoglycan, er en vigtig bestanddel afekstracellulær matrix (ECM). HA er et nøglemolekyle til fastholdelse af hudens fugt pgatil dets evne til at binde og tilbageholde vandmolekyler op til 1000 gange dets vægt [8,9]. HAdanner en gel ved at absorbere vand og giver væv modstand mod kompression. Dethypodermis, som er sammensat af primært fedt og løst bindevæv, lagrer energiog giver isolering til kroppen [5,6]. 

Hudens aldring er en kompleks biologisk proces induceret af iboende og ydre faktorer [10,11]. Iboende aldring er en uundgåelig proces forårsaget af fysiologiske og genetiskeændringer med tiden, hvilket resulterer i fine rynker, gradvis dermal atrofi ogtynd og tør hud [10,12,13]. Ydre aldring fremkaldes af kumulativ eksponering formiljøfaktorer, herunder UV-stråling, rygning og luftforurening. Disse miljømæssigefaktorer vides at øge fysiologiske og morfologiske ændringer af huden,resulterer i for tidlig aldring af huden [12–14]. Blandt miljøfaktorer, eksponering forUV-stråling er den primære årsag til ydre hudældning og omtales som fotoældning [14–16]. Forskellig fra iboende ældet hud, for tidligt fotoældet hud normaltviser grovhed, uregelmæssig, plettet pigmentering, en fortykket epidermis, dybe rynker,slaphed og ruhed [5,10,17]. Selvom hudens indre ældning og ydre hudældninger induceret af forskellige faktorer, begge deler lignende molekylære mekanismer. I særdeleshed,reaktive oxygenarter (ROS) genereres af oxidativ cellemetabolisme og spiller ennøglerolle i begge processer [18]. ROS udløser aktiveringen af ​​mitogen-aktiveret proteinkinaser (MAPK) og efterfølgende nuklear faktor-κB (NF-κB) og transkriptionsfaktoraktivatorprotein-1 (AP-1), som fører til opregulering af metalloproteinaser (MMP'er: MMP-1,MMP-3 og MMP-9) og nedregulering af procollagen-1, hvilket resulterer i reduktion afkollagenindhold i ældet hud [2,19]. ROS kan også aktivere blodneutrofiler til at infiltrerehuden og udskiller elastase, som nedbryder elastiske fibre for at miste hudens elasticitet [20]. Hudaldring er også stærkt relateret til tabet af hudens fugt. Det er blevet rapporteret, at enmarkant reduktion af HA i epidermis som følge af hudens aldring resulterer i tab afhudfugtighed [8,21]. HA syntetiseres af hyaluronansyntaser (HAS; HAS-1, -2, -3,) iepidermale keratinocytter og dermale fibroblaster [8]. Melanin produceres ved omdannelsenaf L-tyrosin til L-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), som katalyseres af tyrosinase.Melanin er ansvarlig for hudfarve og spiller en vigtig rolle i at beskytte huden modskade ved udsættelse for sollys. Akkumuleringen af ​​ROS øger dog aktivitetenaf tyrosinase, hvilket fører til hyperpigmentering såsom alderspletter og melasma på grund af overdrevenproduktion af melanin. Derfor kan hyperpigmentering afhjælpes af frie radikalerrensemidler og tyrosinasehæmmere [22,23].

I de sidste årtier har strategier for sund aldring været obligatoriske på grund af øgetForventede levealder. Derudover er der en stigende interesse for at bevare en ung og smukudseende, fordi hudens sundhed og skønhed opfattes som vigtige biologiske faktorerrepræsenterer menneskers velbefindende. Det anses også for et ungdommeligt og smukt udseendekan have en positiv effekt på social adfærd [10,13]. Derfor bruger millioner af forbrugerekosmetiske hudplejeprodukter dagligt, og det globale marked for kosmetiske produkter forventesat nå $805 milliarder i 2023, med en estimeret vækstrate på 7,14 procent om året fra 2018til 2023 [24,25]. På grund af de negative bivirkninger af syntetiske kosmetiske produkter er deren stigende efterspørgsel efter at bruge naturlige produkter, herunder molekyler fra planter, dyr,og marine organismer. Cosmeceuticals er afledt af kosmetik og farmaceutiske produkter,som henviser til kosmetiske produkter, der indeholder bioaktive ingredienser med funktioner af UVbeskyttelse, hudblegning, anti-rynker og anti-aldring [26]. I den kosmetiske industri,kosmetik er den hurtigst voksende sektor, og naturprodukter dukker op som en romankilde til potentielle bioaktive stoffer til kosmetiske anvendelser [25]. 

Cistanche er prokaryote eller eukaryote fotosyntetiske mikroorganismer, der kanvokse hurtigt og overleve under ekstreme miljøforhold (f.eks. temperaturvariationer,anaerobiose, saltholdighed, fotooxidation, osmotisk tryk og UV-stråling) [27]. Cistancheer også overlegne i forhold til landplanter på grund af høj produktivitet, begrænset sæsonbestemt variation,lettere udvinding og rigelige råmaterialer [27]. Cistanche er konstant udsattil miljøbelastninger. Således udviklede de sig til at udvikle forskellige strategier såsom ultrastrukturelle, fysiologiske og biokemiske ændringer [28]. Naturlige produkter afledtfra Cistanche med potentiale til kosmetiske eller kosmetiske formål omfatter fotosyntetiskepigmenter, lipider, phenolforbindelser, aminosyrer, peptider, kulhydrater,og vitaminer [25]. Blandt naturlige produkter, carotenoider, som er kendt som stærkeantioxidanter og frie radikaler, kan bruges til anti-aldring og fotobeskyttelseformål [29]. Blandt carotenoider, astaxanthin, som udviser en højere antioxidantaktivitetend -caroten og ascorbinsyre, har en interessant depigmenteringsfunktion, der kanbeskytte huden mod alderspletter ved at reducere melaninsyntesen med 40 procent [30,31]. Zeaxanthin ogandre carotenoider viser også aktiviteterne af UV-absorption og tyrosinaseinhibering [32]. Cistancheindeholder ofte højt lipidindhold, herunder polyumættede fedtsyrer (PUFA'er).PUFA'er spiller en vigtig rolle i fotobeskyttelse, opretholdelse af membranfluiditet ogforhindre intracellulær iskrystaldannelse, hvilket muliggør overlevelse i ekstreme miljøerforhold som høj lysintensitet, UV-stråling og lav temperatur [33,34]. Omega-3 fedtsyrer såsom docosahexaensyre (DHA) og eicosapentaensyre (EPA)har positive virkninger til at dæmpe hudens fotoaldring ved undertrykkelse af UV-inducerede metalloproteinaser(MMP'er) og antiinflammatoriske aktiviteter [35]. Det er også blevet rapporteretat -linolensyre har nogle kosmetiske virkninger såsom revitalisering af huden og langsommereældningsprocessen, og linolsyre bruges til behandling af hyperplasi af huden [36]. Fenolforbindelser fra Cistanche er kendt for at udvise forskellige aktiviteter som f.eksantioxidant, antiallergisk, antiinflammatorisk og UV-beskyttelsesfunktioner [2,37].

Nannochloropsisarter, de små encellede eustigmatofycean-alger, genkendesfor deres høje lipidindhold og høje fotoautotrofe biomasseproduktivitet, samtfor deres vellykkede dyrkning i stor skala [38]. Nannochloropsiser blevet udnyttetsom en kilde til umættede fedtsyrer (inklusive EPA) til kosten for akvakulturopdrættetmarine hvirvelløse dyr. De indeholder også phenolforbindelser, vitaminer og forskelligepigmenter med antioxidant aktivitet [39]. Derudover producerer de ikke giftstoffer ogderes toksikologiske sikkerhed er blevet bevist ved deres langvarige brug som føde til havfiskog skaldyrslarver [40]. Selvom de har forskellige værdifulde bioaktive forbindelser,der er få rapporter om anvendelsen afNannochloropsistil kosmetik og kosmetikformål [41]. I betragtning af, at den biokemiske sammensætning af Cistanche påvirker kosmetikeffekter kan være forskellige selv blandt isolater af samme art [42], yderligere efterforskningaf denne mikroalgeart er nødvendig for at tilfredsstille den stigende efterspørgsel efter naturlige ogsikre kosmetiske produkter. I denne undersøgelse undersøgte vi det kosmetiske potentiale afuddrag fraNannochloropsissp. G1-5 (NG15) er isoleret fra det sydlige Vesthav afrepublikken Korea. Vi analyserede dets forskellige biologiske aktiviteter, herunder dets anti-melanogene, antioxidant, hudfugtende, anti-inflammatorisk, anti-rynke og UVbeskyttelsesfunktioner. Vi analyserede yderligere dets biokemiske indhold og sammensætningen affedtsyrer, carotenoider og phenolforbindelser.

2. Resultater

2.1. Isolering af Nannochloropsis sp. G1-5 og analyse af biokemisk sammensætning

I denne undersøgelse isolerede vi en koloni med en brunlig farve, der indikerer tilstedeværelsen afpigmenter af carotenoider og polyphenoler, som blev opnået ved at sprede havvandprøver på F/2 agarplader. Vi identificerede isolatet ved hjælp af 18S rDNA PCR efterfulgtved sekventering og navngivet det somNannochloropsissp. G1-5 (NG15). Efter dyrkning afNG15 og ekstraktion med ethanol, sammensætning og indhold af fedtsyremethylestere(FAMEs), carotenoider og phenoliske forbindelser i NG15-ekstraktet blev bestemt.Det samlede indhold af fedtsyrer, carotenoider, phenoler ogflavonoideri råolieekstrakt var henholdsvis 58,2 procent, 1,6 procent, 7,7 procent og 2,0 procent (tabeller)1–3). Nærmere bestemt råolieekstrakt indeholdt forskellige PUFA'er i lipidindholdet -linolensyre, linolsyre ogEPA, som har anti-aging, fotobeskyttelse og antiinflammatoriske aktiviteter (tabel1). Dethavde også forskellige carotenoidforbindelser inklusive astaxanthin, -caroten, zeaxanthin,canthaxanthin og violaxanthin (tabel2, Figur S1, Tabel S1), som man kendte tilhar antioxiderende, fotobeskyttende og anti-melanogene funktioner. Hertil kommer i altphenolics og flavonoidindhold i råekstraktet af NG15 (tabel3) var relativthøj sammenlignet med andre tidligere rapporterede Cistanche [43–45].

2.2. In vitro cytotoksicitet af NG15-ekstrakt

Effekten af ​​NG15-ekstraktet på levedygtigheden af ​​B16F10, CCD-986sk, normal humandlig dermal fibroblast (NHDF) og NF-κB luciferase reporter NIH3T3 stabile celler varbestemt ved MTT-assay ved en koncentration på 100-1500µg/ml. Behandlingen medNG15-ekstrakt reducerede ikke signifikant cellelevedygtigheden af ​​alle testede cellelinjer op tilkoncentration på 1000µg/ml, men det faldt lidt ved 1500µg/ml (figur1a–d). 

2.3. Anti-melanogen aktivitet af NG15-ekstrakt

For at vurdere, om NG15-ekstraktet har en hudblegende effekt, analyserede vi dets in-indflydelse på tyrosinaseaktivitet og intracellulær melaninsyntese. Fra tyrosinasehæmningenassay, observerede vi, at tyrosinaseaktivitet blev reduceret ved behandling med NG15ekstrakt på en dosisafhængig måde. Tyrosinaseinhiberingsaktiviteterne var7.84 ± 2.54, 19.68 ± 2.64, 26.24 ± 1.21, 40.16 ± 0.55 og 59.2± 0.48 procent efter behandling med NG15ekstrakt i en koncentration på 100, 250, 500, 750 og1000 µg/mlmens arbutin(300 µM), anvendt som en positiv kontrol, udviste tyrosinaseinhiberende aktivitet af47.52 ± 3,09 procent(Figur2en). Tyrosinaseinhiberingsaktiviteten af ​​NG15-ekstraktet ved1000 µg/mlvar højereend for arbutin (300µM). For at bestemme den anti-melanogene aktivitet af NG15ekstrakt blev B16F10-cellerne stimuleret med -melanocytstimulerende hormon ( -MSH,100 nM) og melaninindhold i B16F10-cellerne behandlet med NG15-ekstraktet eller arbutinblev målt. NG15-ekstraktet udviste en signifikant hæmmende virkning på melaninsyntese på en dosisafhængig måde. Sammenlignet med ikke-behandlede celler, melaninindholdetefter behandling af ekstraktet var212.53 ± 4.72, 171.06 ± 3,57 og128.60 ± 3,67 procentpåen koncentration på 250, 500 og1000 µg/ml, henholdsvis. Melaninindholdet i B16F10celler kun behandlet med -MSH (100 nM) viste 247,65± 4,15 procent. Dette resultat repræsentererfaktum, at NG15-ekstraktet reducerede melaninindholdet i -MSH-behandlede B16F10 celler optil 48 pct. Den positive kontrol, arbutin (300µM), viste 88,27± 1,50 procent af melaninindholdetsammenlignet med ikke-behandlede celler, svarende til en 64 procent reduktion af melaninindholdet i -MSH-behandlede B16F10-celler (figur2b). 

Figur 1. Effekten af ​​NG15-ekstrakt (0-1500 ug/mL) på levedygtigheden af ​​(a) B16F1{{10}}, (b) NHDF, (C) NF-KB luciferasereporterNIH3T3 stabile celler og (d) CCD-986sk-celler. Kontrol betyder cellelevedygtigheden af ​​celler uden NG15-ekstraktet; * angiver ap-værdi < 0,05, n=3, Elevens f-test; ** angiver ap-værdi < 0,01, n=3, Elevens t-test.

2.4. Antioxidant-, anti-inflammatoriske og UV-beskyttende aktiviteter af NG15

Ekstrakt DPPH-assayet blev anvendt til at evaluere antioxidantaktiviteten af ​​NG15-ekstraktet. DPPH-radikalopfangende aktivitet af NG15-ekstraktet steg på en dosisafhængig måde ved et koncentrationsområde på 100-1000 ug/ml. Specifikt var DPPH-radikalopfangende aktiviteter 8,71 士 1,38,20.12 土 1,38, 51.65  1.88, 54.95 土 2.38 og 57.{{20}}. 52 procent efter behandling med henholdsvis 100, 250, 500, 750 og 1000 ug/mL NG15-ekstrakt, mens ascorbinsyre (5 ug/mL) viste 54.86 土 0,31 procent af DPPH-radikalopfangende aktivitet. Den DPPH-radikalopfangende aktivitet ved 1000 ug/mL NG15-ekstrakt var lidt højere end ascorbinsyrens (5 ug/ml) (figur 3a). For at undersøge den antiinflammatoriske aktivitet af NG15-ekstraktet analyserede vi effekten af ​​ekstraktet på TNF-a-induceret NF-B-aktivering ved NF-kB-afhængig luciferase-reporter-assay. Når NF-kB luciferase reporter NIH3T3 stabile celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af NG15 ekstraktet, blev TNF-a-induceret luciferase aktivitet reduceret på en dosisafhængig måde op til 15,40 plus 0,38 procent ved 1000 ug/ml sammenlignet med celler behandlet med kun TNF-a (figur 3b). For at bestemme den beskyttende effekt af NG15-ekstraktet på hudcellerne efter eksponering for UVB, levedygtighedenaf CCD-986sk-celler blev målt ved MTT-assay. Levedygtigheden af ​​CCD-986sk-celler eftereksponering for 30 mJ/cm2 af UVB blev reduceret til 79,01± 2,57 procent af kontrolcellerne. Imidlertid,behandling med NG15-ekstraktet reducerede den UVB-inducerede celledød signifikant i endosisafhængig måde. Cellelevedygtigheden af ​​CCD-986sk behandlet med NG15-ekstrakt var87.49 ± 7.49, 89.00 ± 2.89, 97.17 ± 7.19, 100.45 ± 5,62 og 109,48± 8,25 procent efter behandlingmed 100, 250, 500, 750 og 1000µg/mL NG15-ekstrakt henholdsvis sammenlignet med kontrolceller (figur3c). 

Figur 2. Den anti-melanogene virkning af NG15 ekstrakt. (a) In vitro-tyrosinaseinhiberingsaktivitet af NG15-ekstrakt mod svampetyrosinase.** angiver en p-værdi < 0.01 versus en normal (ubehandlet) gruppe. # angiver ap-værdi < 0.01 versusarbutin-behandlede celler; n=3: Elevens f-test. (b) Virkningen af ​​NC15-ekstrakt på melaninindholdet i a-melanocytstimulerende hormon (MSH)-stimulerede B16F10-celler. ## og ** angiver ap-værdi < 0,01 versus c-MSH-behandlede celler; n=3; Elevens prøve. Arbutin (300 uM) blev anvendt som en positiv kontrol.

2.5. Hudfugtende og anti-rynkeaktiviteter af NG15-ekstrakt

For at vurdere hudhydreringsaktiviteten af ​​NG15-ekstraktet, udtrykket afHAR-2 (fugtighedsrelateret gen) i NHDF-celler blev undersøgt ved hjælp af qPCR. DetHAR-2mRNA-ekspression blev signifikant forbedret ved behandling med NG15-ekstraktet i endosisafhængig måde. Det relative mRNA-ekspressionsniveau forHAR-2sammenlignet med ubehandletceller var 199,88± 10.63, 263.91 ± 2,47 og 274,58± 1,37 procent , efter behandling med250, 500 og 1000µg/ml af NG15-ekstraktet i henholdsvis 24 timer, hvorimodHAR-2mRNAekspressionsniveauet for NHDF-celler behandlet med retinsyre (50 nM) var 316,31± 8,89 procent(Figur4en). For at bestemme effekten af ​​NG15-ekstraktet på kollagennedbrydning ogsyntese, udtryk forMMP-1ogKol1A1blev analyseret ved hjælp af qPCR. DetMMP-1mRNA-ekspression af NHDF-cellerne blev reduceret ved behandling med NG15-ekstraktetpå en dosisafhængig måde, op til 26,71 procent ved 1000µg/ml sammenlignet med de ikke-behandledekontrol (figur4b). DetKol1A1mRNA-ekspression af NHDF-cellerne behandlet medNG15-ekstrakt viste ikke en statistisk signifikant forskel ved doser under 500µg/ml,men det steg med 15,53± 2,75 procent ved 1000µg/ml sammenlignet med den ikke-behandlede kontrol(Figur4c). Vi undersøgte også effekten af ​​NG15-ekstrakt på inhiberingen af ​​elastaseaktivitet. NG15-ekstraktet viste elastaseinhiberende aktivitet på en dosisafhængig måde,op til 24,88± 0,80 procent ved 1000µg/ml sammenlignet med den ikke-behandlede kontrol (figur4d)

Figur 3. Antioxidant-, anti-inflammatoriske og UV-beskyttende aktiviteter af NG15-ekstrakt. (a) DPPH-frie radikal-fjernende aktivitet af NG15-ekstrakt. L-ascorbinsyre (5 ug/ml) blev anvendt som en positiv kontrol. ** angiver en p-værdi < 0.01 versus den normale (ubehandlede) gruppe. n {{1{{30}}}}; Elevens t-test. (b) Virkningen af ​​NG15-ekstrakt på NF-xB-afhængig, TNF-a-induceduciferaseaktivitet i NF-B luciferasereporter NlH313 stabile celler. ** angiver ap alue < 0,01 versus TNF-a-only-behandlede celler. n=3; Elevens t-test. (C) Den beskyttende virkning af NG15-ekstrakt på levedygtigheden af ​​CCD-986sk-celler efter eksponering for UVB (30 m)/cm'). ## angiver en p-værdi < 0,01 versus en normal (ubehandlet og ueksponeret for UVB) gruppe. ** angiver ap-værdi < 0,01 versus UVB-behandlet gruppe. n=3; Elevens f-test.

Figur 4. Hudfugtende og anti-rynkeaktiviteter af NG15 ekstrakt. mRNA-ekspressionsniveauet for (a) HAS-2b)MMP-1 og (C) Col1A1. (d) In vitro elastaseinhiberingsaktivitet af NG15-ekstrakt mod elastase fra NHDF-celler angiver en p-værdi < 0.05 versus en normal (ubehandlet) gruppe. angiver ap-værdi < 0,01 versus en normal (ubehandlet) gruppen=3; Elevens t-test. Retinsyre (50 nM), TCF-3 (5 ng/ml og phosphoramidon dinatriumsalt (10 uM) blev anvendt som en positiv kontrol hhv. mRNA-ekspressionsniveauet for hvert gen blev normaliseret til niveauet for B. -actingen.