Eksperimentel undersøgelse af anti-sports træthedseffektmekanismer af Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Department of Cytobiology, Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Kina; 2. Department of Oncology, Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Huhhot 010017, Kina)

Abstrakt:Formål At undersøge effekten afcistanche deserticolapå laktatdehydrogenase (LDH) isoenzym, glykogen og nitrogenoxidsyntase 3 (NOS3) i leveren i musene belaster svømning og udforsker relevante molekylære mekanismer for anti-sportstræthed. Metoder Musene blev opdelt i den normale kontrolgruppe, sportskontrolgruppen ogcistanche deserticolaforsøgsgruppe. Hver mus i den orale kontrolgruppe og sportskontrolgruppen fik saltvand 0,2 ml pr. dag. Hver mus i forsøgsgruppen cistanche deserticola fik vandafkog afcistanche deserticola0,2 mL (3 g/kg) pr. dag. Administrationen var i 15 dage. Svømningen i 90 minutter blev udført på musene fra sportskontrolgruppen og forsøgsgruppen cistanche deserticola 1 time efter den sidste administration. Lever fra musene blev fjernet efter 10 timers svømning. En del af leveren blev fikseret i den neutrale formalinvæske for at fremstille paraffinsnittene, og de andre blev brugt til måling af LDH-aktivitet. Leverens struktur blev observeret ved farvning af HE, og leverens glykogen blev målt ved farvning af glykogen. NOS3 blev undersøgt ved SP immunhistokemisk metode. Resultater Leverstrukturen i sportskontrolgruppen blev alvorligt skadet, isoenzymet af LDH4 og LDH5 var højere, leverglykogenet var dårligt, NOS3 var nedsat sammenlignet med den normale kontrolgruppe (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolakunne reducere LDH5, beskytte leveren af ​​musens svømning og fremskynde glykogenakkumulering ved at øge ekspressionen af ​​NOS3 for at beskytte leveren og forbedre fysisk kapacitetsgendannelse.

Nøgleord:cistanche deserticola;leverglykogen;nitrogenoxidsyntase 3;mus.

Cistanche billede

Cistanche,også kendt som Dayun, er en toårig parasitisk urt fra Ledanaceae. Den har tørre kødfulde stængler med skæl. Det produceres hovedsageligt i sandjord og halvsandede græsarealer i Indre Mongoliet, Gansu, Xinjiang, Qinghai og andre steder. Indre MongolietCistanchehar den bedste kvalitet blandt alle producerende områder.Cistancheer sød, salt og varm i naturen. Det går ind inyrerog tyktarmens meridian. Dens hovedfunktioner er at nære nyrerne og styrke yang, nære essensen og blodet og fugte tarmene. Det bruges ofte til at behandle impotens, infertilitet, svag talje og knæ, svaghed i muskler og knogler, tørre tarme og forstoppelse. Denne undersøgelse har til formål at observere virkningerne afCistanchepå belastningsbærende svømmemus leverlaktatdehydrogenase (LDH), leverglykogen og nitrogenoxidsyntase 3 (NOS3) gennem en belastningsbærende svømmetest i mus, og for at udforske dens beskyttende mekanisme på leveren. Derfor kan det give et teoretisk grundlag for dybdegående forskning, udvikling og udnyttelse afCistanche i sport helsekost.

1 Eksperimentelle materialer

1.1 Dyr

30 kunming-hanrotter, ren kvalitet, kropsvægt (20±0,5) g, leveret af Animal Center of Inner Mongolia University.

1.2 Medicin

Cistanche deserticolaYCMa, produceret i Ejina Banner, Indre Mongoliet og er blevet identificeret. I henhold til det originale medicinske materiale: vand=100 g: 400 mL, læg først i blød i 30 minutter, opvarm og kog, og kog derefter på varm ild i 30 min. Hæld den flydende medicin ud og afkogt igen i forholdet 100 g: 200 ml. De to afkog blev blandet sammen og filtreret med to lag gaze og derefter koncentreret til det, der svarer til 1 g af det originale medicinske materiale pr. milliliter vandafkogsstamopløsning, opbevaret i et køleskab ved 4 grader.

1.3 Reagenser og instrumenter

NOS3 polyklonalt antistof blev købt fra Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. SP-kittet blev købt fra Fujian Maixin Reagent Company. Lactat dehydrogenase isoenzym kit blev købt fra Inner Mongolia Tongri Reagent Company (eksklusivt ejet af Nissan). Nanjing JD-80 farvebilledanalysator. Amerikansk UVP gel billedanalysesystem.

2 Eksperimentel metode

2.1 Gruppering og dosering

Kunming-mus blev tilfældigt opdelt i normal kontrolgruppe, træningskontrolgruppe ogCistancheeksperimentel gruppe med 10 mus i hver gruppe. Den normale kontrolgruppe og træningskontrolgruppen fik normalt saltvand én gang om dagen, 0,2 ml/gang; detCistancheforsøgsgruppe blev givetcistancheafkog (tag 3 mL af det originale vandafkog og tilsæt vand til 10 mL). En gang om dagen, 0,2 ml/gang, er daglig dosis 3 g/kg og 15 dage i træk. En time efter sidste dosering, musene i træningskontrolgruppen og denCistancheeksperimentgruppen blev fyldt med en 1 g blyvægt på deres hale, og de blev placeret i en pool på 50 cm høj, 50 cm lang og 35 cm bred for at svømme under temperaturen (30±0,5) grader , Observer musene konstant, hvis de viser sig at holde op med at svømme, brug en træpind til at stimulere deres bevægelse i 90 minutter. Efter træning skal du spise en normal kost, hvile i 10 timer og derefter aflive musene med normale kontrolgruppemus. Tag leveren ud, fikser en del med 10 procent neutral formaldehyd, og gør den 4 µm tyk efter dehydrering, gennemsigtighed, voksnedsænkning og indlejring. Brug HE-farvningsmetoden til at observere levervævsstrukturen i hver gruppe. Den anden del blev vasket med normalt saltvand og opbevaret frosset ved -20 grader og optøet ved stuetemperatur under måling. Læg i blød med filterpapir og vej, tilbered derefter leverhomogenat med normalt saltvand, centrifuger ved 3 500 r/min i 15 min. Tag supernatanten og mål lactatdehydrogenase-isoenzymaktiviteten ved elektroforese.

2.2 Bestemmelse af laktatdehydrogenaseaktivitet

Ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese adskilles LDHs isoenzymer i henhold til deres elektroforetiske mobilitetsforskelle. Separationsgelkoncentrationen af ​​prøven er 7 procent, pH 8,9, og koncentrationen af ​​koncentreret gel er 4 procent, pH 6,8. 10 µL prøven blandes med 1 dråbe glycerol og bromphenolblå indikator. Elektrodebufferen er Tris-glycin (pH 8,7), start med at stabilisere spændingen ved 100-150 V, tilsæt til 200-250 V efter 30 minutter, og elektroforese i 4 timer. Efter elektroforese blev det farvet med Lactat Dehydrogenase Isoenzyme Kit og farvet ved 37 grader i 30 minutter, hvilket viste et blåt lactat dehydrogenase isoenzymbånd, derefter skyllet med vand, fikseret med iseddikesyre. Brug endelig UVP-gelbilledanalysesystem til dataanalyse.

2.3 Glykogenfarvning

4 µm tykke seriesnit afparaffineres rutinemæssigt til vand. læg i 1 procent periodisk syreopløsning ved 37 grader i 15 minutter. skylles med rindende vand. puttes i Schiff-opløsning i 60 min. skyllet med rindende vand, dehydreret med gradientethanol, gennemsigtig xylen og monteret med neutral gummi. Observer derefter farvningsresultaterne under mikroskopet.

2.4 Immunhistokemisk farvning

Skiverne afparaffineres rutinemæssigt til vand, og antigenet repareres med citratbuffermikrobølgeovn. Handl med opløsning A i 10 minutter for at fjerne endogen peroxidase, og bloker med opløsning B (fortyndet gedeserum) i 10 minutter. Tilsæt det primære antistof i en befugtet boks ved 4 grader natten over, og vask med pH 7,4 PBS-opløsning i 5 min×3 gange på den anden dag. Tilsæt derefter biotin-mærket C-opløsning (sekundær antistof-arbejdsopløsning) og inkuber i 10 minutter, vask med PBS-opløsning i 5 minutter × 3 gange. Tilsæt peberrodsperoxidase-mærket D-opløsning og inkuber i 10 minutter, vask med PBS-opløsning i 5 minutter × 3 gange. Til sidst blev den udviklet i DAB opløsning i 5 min, vasket med postevand, HE modfarvet, dehydreret med gradient ethanol, gennemsigtig med xylen og monteret med neutral gummi. Observer under et lysmikroskop efter montering af filmen. I hver batch af eksperimenter blev phosphatbufret saltvand (PBS) anvendt som en negativ kontrol i stedet for det primære antistof.

2.5 Analyse af nitrogenoxidsyntase 3-ekspression

Foreløbig observation ved visuel semi-kvantitativ metode under lysmikroskop, NOS3-positivt produkt er mørkebrunt eller brunt. Det positive produkt er placeret i cytoplasmaet af hepatocytter eller endotelceller mellem hepatocytter, og den blå baggrund er negativ. Brug derefter farvebilledanalysesystemet til at måle gråværdien af ​​den positive reaktant. Under et 40x objektiv måles parametrene for 4 synsfelter tilfældigt for hver film, og gennemsnitsværdien tages. Denne parameter bruges til at afspejle ændringen af ​​NOS3-farvningsintensiteten.

2.6 Statistiske metoder

Alle data er udtrykt som x-±s, og SPSS11.0 statistisk softwarepakke bruges til t-test, og P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3 resultater

3.1 Observation af vævsstruktur under optisk mikroskop

Strukturen af ​​leverlobuli i normalgruppen er klar, cellesnorene er ordnet pænt, leverens sinusoider er normale, levercellerne har ingen tydelige læsioner, og kernestrukturen er klar. Den normale vævsstruktur i træningskontrolgruppen forsvandt, lobulegrænserne var uklare, og cellestrengen var forstyrret, de fleste leversinusoider forsvandt, og omfattende vakuolær degeneration af hepatocytter viser sig ved øget cellevolumen. Cytoplasmaet er løst, let farvet, endda klart og gennemsigtigt, og nogle leverceller viser en typisk ballonændring med en lille mængde fokal eller punktformig nekrose. Levercellerne iCistancheforsøgsgruppen var let uklare, men de blev arrangeret regelmæssigt. Der var ingen tydelige vakuoler og løshed i cellerne, cellesnorene var ordnet pænt, og kernestrukturen var klar.

3.2 Virkninger på aktiviteten af ​​leverlactat-dehydrogenase-isoenzymer hos mus under belastningsmotion (se tabel 1)

3.3 Observation af leverglykogenfarvning under optisk mikroskop

Selvom indholdet af glykogen i den normale kontrolgruppe ikke er højt, er der glykogen i hver levercelle, fordelingen er ensartet, og der er intet vakuolfænomen. Træningskontrolgruppen havde mindre glykogen, spredt i levercellerne, og der opstod vakuoler i nogle områder; Cistanche-eksperimentgruppen var rig på glykogen, men samlede meget på den ene side af cellen.

3.4 Observation af ekspressionen af ​​nitrogenoxidsyntase 3 ved optisk mikroskop og kvantitativ billedanalyse

Der er et stærkt positivt udtryk i cytoplasmaet af hepatocytter i den normale kontrolgruppe, som er diffust fordelt, især i binukleære celler, og positivt udtryk i endotelceller. Ekspressionen i cytoplasmaet af hepatocytter og endotelceller i træningskontrolgruppen var svækket.Cistancheeksperimentel gruppe havde positiv ekspression i cytoplasmaet af hepatocytter og stærk positiv ekspression i endotelceller. Analyseresultaterne af farvebilledanalysatoren er vist i tabel 2.

4 Diskussion

Menneskelig kropsbevægelse har brug for energi, og kroppen har også brug for energi i metabolismeprocessen Cellemetabolisme bruger direkte energi fra nedbrydning af adenosintrifospat (ATP), og den energi, der kræves til syntesen af ​​ATP, kommer i sidste ende hovedsageligt af sukkerets katabolisme . Undersøgelser har vist, at kroppen efter hård træning vil producere en stor mængde H plus , frie radikaler, mælkesyre og andre stoffer, der påvirker cellernes normale stofskifte. Samtidig fører mangel på glukose i cellerne til træningstræthed og celleskader. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at levervævsstrukturskade er meget alvorlig efter meget træning, og det påvirker også celleanabolisme, såsom reduktion af leverens glykogensyntese. Mus, der tager Cistanche, kan ses at reducere leverskader efter meget træning, hovedsageligt på grund af reduktionen af ​​LDH5, og leverens glykogenindhold er betydeligt højere end i træningskontrolgruppen.Cistanchekan opnå leverbeskyttelse og opretholde normal fysiologi ved at reducere LDH5-funktionen. Fra resultaterne af glykogenfarvning er glykogenindholdet iCistancheforsøgsgruppen er højere end den normale kontrolgruppe. gørCistancheøge leverens glykogenreserver før træning eller accelerere glykogensyntesen under stress efter træning? Der kan ikke drages nogen konklusion, fordi der ikke er nogen kontrolgruppe, der ikke trænerCistanchei forsøget. Det er endnu ikke bekræftet i næste trin, men den beskyttende effekt af Cistanche på leveren og fremme af glykogensyntese efter meget træning er indlysende.

NO er ​​et lille molekylestof, som har været højt værdsat af idrætsmiljøet i de senere år. NOS er den vigtigste hastighedsbegrænsende faktor for NO-produktion. Det er blevet bekræftet, at NOS har 3 typer isoenzymer. NOS1 kaldes neuronal nitrogenoxidsyntase. Det findes i neuronale celler, skeletmuskelceller osv., og er hovedsageligt involveret i neuroudvikling, neurosekretion, indlærings- og hukommelsesprocesser. NOS2 er en inducerbar nitrogenoxidsyntase, hovedsageligt fundet i glatte muskelceller, makrofager og lymfocytter. Når først dette enzym er induceret, kan det fortsætte med at syntetisere NO, indtil substratet er opbrugt, eller cellen dør. Det menes i øjeblikket at være involveret i celleskade; NOS3 er en endotel nitrogenoxidsyntase, som hovedsageligt er fordelt i endotelceller og hepatocytter. Det producerede NO er ​​hovedsageligt involveret i fysiologiske funktioner. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at ekspressionen af ​​NOS3 i endotelceller og hepatocytter er svækket efter meget træning, og det resulterende NO reduceres, så blodkar ikke kan udvides effektivt, blodgennemstrømningen reduceres, og råmaterialerne til syntetisk glykogen kan ikke transporteres til leverceller, så glykogensyntesen reduceres.

Cistanche anti-træthedsfunktion

Cistanchekan opregulere ekspressionen af ​​NOS3 i endotelceller og leverceller. Udvid blodkarrene reaktivt. Øg blodgennemstrømningen, fremskynd evnen til at transportere glykogensyntese råvarer. Accelerer glykogensyntesen og opretholder kroppen på et normalt fysiologisk metabolisk niveau. Derfor kan reduktion af LDH5 for at beskytte leveren og opregulering af ekspressionen af ​​NOS3 for at fremme mælkesyreglukoneogenese være en vigtig mekanisme forCistancheat beskytte leveren og fremme fysisk restitution. Denne forskning giver et videnskabeligt forsøgsgrundlag for videreudvikling og udnyttelse afCistancheinden for idrætsmedicin, og lægger også grunden til udvikling og oprensning afCistanches effektstoffer.

Artikal fra: "Experimental Study of Anti-Sports Fatigue Effect Mechanisms of Cistanche Deserticola" af YANG Hong-xin1, etc.

-----Chinese Journal of Information on TCM Apr.2008 Vol.15 No.4