Design, syntese og antimelanogene virkninger af (2-substituerede phenyl-1,3-dithiolan-4-yl)methanolderivater

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Gør Hyun Kim1 Su Jeong Kim1 Sultan Ullah1 Lars Løkke Rasmussen Pusoon Chun2 Hyung Ryong Moon1

Abstrakt:Forfatterne designede og syntetiserede 17 (2-substitueret phenyl-1,3-dithiolan-4-yl) methanol (PDTM) derivater til at finde et nyt kemisk stillads, der viser fremragendetyrosinasehæmmendeaktivitet. Deres tyrosinasehæmmende aktiviteter blev evalueret mod svampetyrosinase ved 50 μM og fem af PDTM-derivaterne (PDTM3, PDTM7-PDTM9 og PDTM13) viste sig at hæmme svampetyrosinasemere end kojicsyre eller arbutin, de positive kontroller. Af sytten PDTM'er, PDTM3 (halvmaksimal hæmmende koncentration 13,94±1,76 μM), med en 2,4-dihydroxyphenyl-moiety, udviste de største hæmmende virkninger (kojicsyre halvmaksimal hæmmende koncentration 18,86±2,14 μM). Interessant nok pdtm-forbindelser uden hydroxyl gruppen, PDTM7-PDTM9, havde også stærkere hæmmende aktiviteter end kojinsyre. In silico undersøgelser af interaktioner mellem tyrosinase og de fem PDTM'er foreslog, at deres bindende tilhørsforhold var nært beslægtet med deres tyrosinasehæmmende aktiviteter. Cellebaserede eksperimenter udført ved hjælp af B16F10 muse-hud melanomceller viste, at PDTM3 effektivt hæmmedemelanogeneseog cellulærtyrosinaseaktivitet. En cellelevedygtighedsundersøgelse udført ved hjælp af B16F10-celler indikerede, at den antimelanogene virkning af PDTM3 ikke skyldtes dets cytotoksicitet. Kinetiske undersøgelser viste, at PDTM3 konkurrencehæmmet tyrosinase, hvilket indikerer binding til tyrosinase-aktivt websted. Vi fandt ud af, at PDTM3 med et nyt kemisk stillads kunne være lovende kandidat til hudblegningsmidler, og at 1,3-dithiolanringen kan anvendes som kemikalie stillads til potent tyrosinase hæmning.Søgeord:tyrosinasehæmmer, melanogenese, 1,3-dithiolan, PDTM

Cistanche er en tyrosinasehæmmer.

Indførelsen

I de sidste par årtier,tyrosinasehæmmerehar været af stor interesse på grund af den centrale rolle, som tyrosinase spiller imelanogenese. Melanin fremstilles ved anvendelse af en kombination af enzymatisk katalyserede og kemiske reaktioner. Det biosyntetiske Pathway ansvarlig for melaninproduktion blev oprindeligt belyst af Raper1 og Murer2 og for nylig ændret af Cooksey et al3 og Schallreuter et al.4 Melanogenese initieres af enzymet tyrosinase, som katalyserer de to første oxidative trin i den biosyntetiske vej melanin: oxidationerne af l-tyrosin til l-dopa efterfulgt af l-dopa til l-dopaquinon (figur 1). Disse to trin er også den hastighedsbestemmende trin i melaninbiosyntese, fordi fysiologisk pH kan fortsætte spontant efterfølgende trin.5 Dopaquinon produceret i andet trin omdannes til cysteinyldopa af glutathion eller cystein og endelig til pheomelanin, som er ansvarlig for gule til røde farver på pattedyrs hud eller til dopachrome ved autooxidation og til sidst eumelanin, som er ansvarlig for brune/sorte farver på pattedyrs hud (figur 1). Melanin beskytter menneskets hud mod skadelig ultraviolet stråling og bestemmer også det fænotypiske udseende. På den anden side overdreven melanin ophobning i huden kan forårsage hyperpigmenteringsrelateret sygdomme og kosmetiske problemer, såsom fregner, melasma, og senile lentiginer.

Tyrosinaseer bredt fordelt i bakterier, svampe, insekter, planter og dyr, herunder mennesker, og er ansvarlig for farverne på menneskets hud og hår og den uønskede bruning af frugt og grøntsager.6 Uønsket enzymatisk bruning og sygdomme forbundet med hyperpigmentering i huden har opfordrede forskere til at søge nye potente tyrosinasehæmmere til brug som hudblegnings- og antibrowning-midler. Mangetyrosinasehæmmereer blevet opdaget til dato,7-9 men relativt få er blevet godkendt som hudblegningsmaterialer, på grund af sikkerhedsproblemer eller svage blegningseffekter.

I vores tidligere undersøgelser på grundlag af strukturer af l-tyrosin og l-dopa, naturlige substrater af tyrosinase, vi designet to potentielle tyrosinasehæmmere med en thiazolidinring (MHY384 og MHY794; Figur 1) og syntetiseret dem ved kondensering af et passende benzaldehyd og l-cystein eller cysteaminhydrochlorid. Disse to forbindelser blev identificeret som potente konkurrencedygtigetyrosinase Hæmmereog effektivt at reducere melanogenese i HRM2 hårløse mus.10,11 Ud over direkte at hæmme tyrosinase aktivitet, MHY384 hæmmede tyrosinasekspression ved at undertrykke det cykliske adenosinmonophosphat-PKA10 og NO-induceret cyklisk guanosinmonophosphat–PKG12,13 veje, og MHY794 undertrykte ogsåtyrosinaseudtryk induceret af NO-medieretmelanogenesesignalering.11 Disse positive resultater og det faktum, at divalent -S- er en klassisk isostere af divalent -NH- tilskyndede os til at syntetisere derivater med en dithiolanring som surrogat for thiazolidinringen, der almindeligvis findes i MHY384 og MHY794, for at finde nye tyrosinasehæmmere.

I denne undersøgelse, som en del af vores løbende bestræbelser på at finde en nyt og stærkt kemisk stillads til hæmning af tyrosinase og udvikle nyttyrosinasehæmmere, syntetiserede vi en klasse af strukturelt roman (2-substitueret phenyl-1,3-dithiolan-4-yl) methanol (PDTM) derivater (figur 1) og undersøgt deres antimelanogene virkninger ved anvendelse af svampetyrosinase og cellebaserede assays. I denne undersøgelse var kojinsyre og arbutin anvendes som en positiv kontrol for tyrosinasehæmmende aktivitet, fordi kojinsyre er en af de mest almindeligt anvendte positive kontroller til evaluering af tyrosinasehæmning og arbutin anvendes klinisk som blegemiddel.

Materialer og metoder

Materialer

Medmindre andet er angivet, skal alle kommercielt tilgængelige reagenser – l-tyrosin (kode T3754), l-dopa (kode PHR1271), kojic syre (kode K3125), MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) (kode M2128) PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) (kode P7626), Triton X-100 (4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenylpolyethylen glycol) (kode T8787), kaliumhydrogenphosphat (kode P9666), kaliumdihydrogenphosphat (kode PHR1330), 2,3-dimercapto-1-propanol (kode 64046), 1,4-dioxan (kode 296309), svovlsyre (kode 339741) og benzaldehyder – blev købt hos Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Føtalt kvægserum, Dulbeccos modificerede ørnemedium, fosfatbufret saltvand (PBS), penicillin, streptomycin og trypsin blev købt hos Thermo Fisher Scientific (Waltham, cand.mag., USA). Svamptyrosinase(kode T3824) og α-melanocytstimulerende hormon (α-MSH; kode M4135) blev også købt hos Sigma-Aldrich. 1 H og 13C nukleare magnetiske resonansspektre (NMR) blev registreret om Instrumenterne Varian Unity Inova 400 og Varian Unity AS 500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Massespektrometri med lav opløsning (MS) og høj opløsning MS-data blev indhentet på et Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA) og en 6530 nøjagtig masse quadrupole flyvetids-væskekromatografi massespektrometer (Agilent), henholdsvis. Syntese af PDTM1-PDTM17 var udført i vores laboratorium.

ekstrakt af cistanche

Generel procedure for syntese af PDTM1–PDTM17

Til en omrørt opløsning af 2,3-dimercapto-1-propanol (100 mg, 0,80 mmol) i 1,4-dioxan (1 ml) blev tilsat en opløsning af svovlsyre (0,1 ækvivalens) i 1,4-dioxan (1 ml) og en passende benzaldehyd (1.1 ækvivalens) efterfølgende. Efter omrøring ved stuetemperatur i 10 minutter, reaktionsblandingen blev omrørt ved 70 °C i 40 minutter til 1 time. Blandingen blev derefter opdelt mellem ethylacetat og vand, og det organiske lag blev tørret over vandfrit MgSO4, filtreret og fordampet. Den opnåede rest var renset ved hjælp af silicagelsøjlekromatografi for at give ren PDTM-produkter: PDTM1–PDTM17.14 Strukturel karakterisering (1 H og 13C NMR og massedata for alle PDTM'er og 1-D og 2-D NMR-spektre af nogle PDTM'er) af syntetiseret forbindelser er tilvejebragt i supplerende materialer.

Inhibering af svampetyrosinaseved PDTM1–PDTM17

De hæmmende virkninger af PDTM-analoger på svampe tyrosinase blev udforsket med mindre ændringer, som beskrevet tidligere i vores arbejde.15 Hver forbindelse (10 μL, endelig koncentration 50 μM) blev blandet med substratopløsning (170 μL), fremstillet af 14,7 mM kaliumphosphatbuffer (pH 6,5) og 293 μM l-tyrosinopløsning (1:1, v/v) i hver godt af en 96-brønds plade. Til hver brønd, champignon tyrosinase opløsning (20 μL, 1.000 U/ml) blev tilsat og inkuberet til 30 minutter ved 37 °C. Indhold af dopachrome dannet i brønde blev bestemt ved at måle optiske densiteter ved 475 nm ved hjælp af en VersaMax-mikropladelæser (molekylære enheder, Sunnyvale, Californien, USA). Kojicsyre og arbutin blev anvendt som positive kontroller. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Hæmningshastigheder påtyrosinaseblev beregnet således:

Hæmning (%) = × 100 [ ( 1 - A B / )] (1)

hvis A angiver testforbindelsens optiske masse massevis og B repræsenterer styringens optiske densitet.

Halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) er koncentrationen af en forbindelse, der hæmmer et standard 50% respons. IC50 er afledt af x-aksen på en inhibitor-koncentration versus produktdannelseskurve og bestemmes ud fra justering af dosis-responskurven på den afhængige y-akse. I den foreliggende undersøgelse er dosisafhængig hæmning eksperimenter blev udført i tre eksemplarer for at bestemme IC50 af forbindelser. Ifølge hæmningsprocenten af fem doser (slutkoncentration 10, 20, 30, 40 og 50 μM) i hvert forsøg, de log-lineære kurver og deres ligninger blev bestemt. Individuelle IC50-værdier blev derefter beregnet som koncentrationen, når y-aksen svarede til 50% hæmning. Resultaterne fra de tre forsøg vises.

Analyse af svampens art tyrosinase hæmning

At belyse arten af den hæmmende virkning af PDTM3 på svampetyrosinase blev kinetiske undersøgelser udført. PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 eller 25 μM endelig koncentration]) var tilsat til 170 μL l-tyrosinopløsning (0,5, 1, 2 eller 4 mM endelig koncentration) og derefter blandet med svampetyrosinaseopløsning (20 μL, 1.000 U/ml) i hver brønd på en plade med 96 brønde. Efter at blandingen var inkuberet i 30 minutter ved 37 °C, indholdet af dopachrome produceret i brønde blev bestemt ved at måle optiske densiteter ved 475 nm ved hjælp af en mikroplade læser. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Til bestemmelse af hæmningens art, en Lineweaver-Burk plot blev brugt.

ekstrakt af cistanche fordel

Dockingsimulering af PDTM3 eller kojic syre med tyrosinase

In silico docking simulering af protein-ligand var udført med AutoDock Vina ved hjælp af en systematisk søgning teknik og 3D-strukturen af Agaricus bisporustyrosinase(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 I krystallen struktur af tyrosinase, bindingsstedet for l-tyrosin var bruges som dockinglomme. Simuleringsresultater blev opnået fra docking mellem tyrosinase og syntetiske forbindelser (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 og PDTM13) eller kojicsyre. Før du udfører dockingsimulering med forbindelser, 2D-strukturer af forbindelser blev omdannet i 3D-strukturer blev ladninger af forbindelser bestemt, og hydrogenatomer blev indsat ved hjælp af ChemOffice. LigandScout 3.1.2 blev brugt til forudsigelse af mulige interaktioner mellem ligander og tyrosinase og identifikation af farmakoforer. Docking-simuleringsbilleder af 17 PDTM'er findes i Supplerende materialer.

Bestemmelse af melanogeneseniveau i B16F10-celler

Melaninindholdsassays med mindre ændringer blev anvendt i B16F10-celler for PDTM3's hæmmende virkninger påmelanogenese.19 Celler podet med en densitet på 5×104 celler/brønd i en 24-brønds plade fik lov til at klæbe ved 37 ° C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 natten over. Følgende om dagen blev cellerne udsat for α-MSH (1 μM) og PDTM3 (0, 5, 10 eller 25 μM) eller kojinsyre (25 μM) og pladen blev inkuberet i 24 timer under de samme betingelser. Efter blev vasket to gange med PBS, cellerne blev løsnet af inkubation ved 60 °C i 200 μL af 1 N NaOH i 1 time. Den lysater blev flyttet til en plade med 96 brønde, og optiske densiteter blev målt ved 405 nm af et enzymbundet immunosorbent assaylæser til beregning af gennemsnitlige procentvise hæmninger af kojinsyre og PDTM3. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

Tyrosinase-aktivitetsassay i B16F10-celler

Ved at estimere oxidationshastigheden af l-dopa,tyrosinaseaktiviteterne blev evalueret med mindre ændringer, som beskrevet i det foregående arbejde.20 Celler podet med en tæthed på 5×104 celle/brønd i en 24-brønds plade fik lov til at klæbe ved 37 ° C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 i 24 timer. Cellerne blev eksponeret for α-MSH (1 μM) og PDTM3 (0, 5, 10, eller 25 μM) eller kojinsyre (25 μM), og pladen blev inkuberet under de samme betingelser i 24 timer. Efter skylning to gange med PBS blev cellerne lyseret med 100 μL lysisbuffer indeholdende 0,1 mM PMSF (5 μL), 50 mM PBS (90 μL, pH 6,8) og 1 % Triton X-100 (5 μL) og frosset ved -80 °C for 30 minutter. Lysater blev optøet og centrifugeret ved 12.000 g i 30 minutter ved 4 °C og supernatanter (80 μL) blev kombineret med 10 mM l-dopa (20 μL) i en plade med 96 brønde, som blev derefter inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Optiske tætheder blev beregnet ved 500 nm, og de hæmmende aktiviteter af tyrosinase blev bestemt således:

Hæmning (%) = × 100 ([A−B]−[C−D] /[A−B] ) (2)

hvor B og A er de optiske tætheder af blindprøven før og efter inkubation henholdsvis, og D og C er den optiske tætheder af testforbindelsen før og efter inkubation henholdsvis.

Statistisk analyse

En måde at analysere varians på efterfulgt af Dunnetts test var bruges til at afgøre, om gruppemidlerne afveg væsentligt fra kontrollernes. Welchs uparrede t-test blev brugt til afgøre, om virkningerne af PDTM3 og kojicsyre var væsentligt anderledes. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Alle resultater er angivet som midler ± standardfejl på tre uafhængige eksperimenter. Tosidede P-værdier på 0,05 var betragtes som statistisk signifikant.

Resultater og diskussion

Fremstilling af PDTM1–PDTM17 PDTM1-PDTM17 blev syntetiseret som vist i skema 1. Opvarmning 2,3-dimercapto-1-propanol og mange passende substituerede benzaldehyder (1-17) i 1,4-dioxan i nærvær af svovlsyre gav de ønskede PDTM-produkter som faste stoffer eller klæbrig olie. Strukturerne af de endelige produkter var bekræftet af 1 H og 13C NMR, korrelationsspektroskopi, heteronukleær enkeltkvantekorrelationsspektroskopi, heteronuklear multibindingskorrelationsspektroskopi, og MS med lav og høj opløsning. Tilstedeværelsen af singlet svarende til -SCH(Ph)S-protonen ved δ =6,09-5,56 ppm i 1 H NMR-spektre bekræftede dannelsen af en dithiolan ring mellem benzaldehyder og 2,3-mercapto-1-propanol. I 1 H NMR-spektroskopiske data for PDTM'er, 2-H-toppen syntes mere downfield end toppen af protoner fastgjort til sp3 carbonatomer og 4-H exomethylen og 5-H2 toppe blev observeret mere upfield i navngivet rækkefølge. I 13C NMR spektroskopiske data, bortset fra toppe fra phenylring, kulstoftoppen af exomethylen (~ 64 ppm) var mest downfield, efterfulgt i rækkefølge af 4-C (~ 58 ppm), 2-C (~ 55,3 ppm) og 5-C (~ 41 ppm). Fire produkter – PDTM6, PDTM12, PDTM13 og PDTM15 - blev hver opnået som en enkelt racemate, mens de andre blev opnået som en blanding af to racemates ([2R,4R]/[2S,4S] og [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1.5), hvis forhold blev beregnet ved hjælp af 1 H NMR spektroskopiske data. Fænomenet i produktet dannelse kunne ikke forklares blot ved sterisk, elektronisk, og/eller stereoelektroniske effekter. Dentyrosinase-hæmningassay blev udført uden adskillelse af racekammeraterne.

Hæmmende virkninger af PDTM1-PDTM17 på svampe tyrosinase

Potentialerne i de 17 syntetiserede produkter, PDTM1- PDTM17, for at hæmme svampetyrosinaseaktivitet var undersøgt ved anvendelse af kojinsyre22 og arbutin23 som positive kontroller. Inhiberinger blev bestemt under anvendelse af 293 μM l-tyrosin som substrat og syntetiske forbindelser i en koncentration på 50 μM.Tyrosinasehæmninger med kojinsyre og arbutin blev bestemt ved henholdsvis 50 og 500 μM.

Tre forbindelser – PDTM11 (3,4,5-trimethoxyphenyl), PDTM15 (4-hydroxy-3-methylphenyl) og PDTM17 (3,5-di-t-butyl-4-hydroxymethyl) – hæmmet tyrosinase i samme omfang som kojinsyre og hæmmede det mere end arbutin (tabel 1). Fem PDTM-derivater - PDTM3 (2,4- dihydroxyphenyl), PDTM7 (4-methoxyphenyl), PDTM8 (3,4- dimethoxyphenyl), PDTM9 (2,4-dimethoxyphenyl), og PDTM13 (3-brom-4-hydroxyphenyl) – hæmmet tyrosinase mere potent end kojicsyre. IC50-værdier af disse forbindelser blev undersøgt: 13,94±1,76 μM (PDTM3), 16,47±2,36 μM (PDTM7), 16,97±2,99 μM (PDTM8), 27,85±1,47 μM (PDTM9) og 15,57±3,31 μM (PDTM13). De lave IC50-værdier for PDTM3, PDTM7, PDTM8 og PDTM13 viste, at styrken var stærkere end for kojinsyre (18,86±2,14 μM) og arbutin (381,26±3,22 μM), som blev brugt som positive kontroller. Interessant nok er dette resultat er enig i vores tidligere konstatering af, at mange analoger med en 2,4-dihydroxyphenyl moiety besidder højeretyrosinasehæmmendeaktivitet end kojinsyre.10,13,24-32

De resterende PDTM-derivater havde ingen (PDTM1 og PDTM2) eller lav hæmmende virkning (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 og PDTM16) sammenlignet med kojicsyre. Ifølge vores akkumulerede struktur-aktivitet forholdsdata, analoger med mindst én hydroxylgruppe var mere i stand til at hæmme tyrosinase. Noget overraskende er fire PDTM-derivater uden hydroxylgruppe hæmmet tyrosinaseaktivitet så meget eller mere effektivt end kojicsyre. Disse var PDTM7 (4-methoxyphenyl), PDTM8 (3,4-dimethoxyphenyl), PDTM9 (2,4-dimethoxyphenyl) og PDTM11 (3,4,5-trimethoxyphenyl). Forbindelser (PDTM1-2, PDTM4-5 og PDTM12) med kun en 4-hydroxylgruppe på phenylringen eller en alkoxy- eller hydroxylgruppe i position 3 med en 4-hydroxylgruppe havde lav eller ingen aktivitet, mens forbindelser (PDTM13-PDTM17) med en alkyl- eller bromgruppe på position 3 med en 4-hydroxylgruppe viste moderat-høj tyrosinasehæmmende aktivitet. Disse resultater af struktur-aktivitetsforholdet understøtter hypotesen om, attyrosinasehæmmendeaktivitet af forbindelser med en 4-hydroxylgruppe er stærkt påvirket af typen af 3-substituent.

cistanchefordel: anti-aging

Tilstand af svampetyrosinasehæmning af PDTM3

Da PDTM3 hæmmede svampetyrosinasede fleste, en Lineweaver-Burk plot blev brugt til at bestemme naturen af dets hæmmende virkning. Som afbildet i figur 2 blev der opnået et dobbelt gensidigt plot, og alle linjer med forskellige skråninger krydsede y-aksen på samme punkt. Derfor Km (Michaelis konstant) værdier steg gradvist med koncentrationen af PDTM3. Detaljerede kinetiske parameterværdier er vist i tabel 2. På den anden side blev maksimal reaktionshastighed (Vmax) ikke påvirket af PDTM3-koncentrationen. Disse resultater viser PDTM3 dosisafhængigt og konkurrencedygtigt hæmmet tyrosinase.

In silico docking simuleringer af forening af tyrosinase med PDTM3, PDTM7-PDTM9, PDTM13 og kojicsyre

AutoDock Vina blev brugt til at afgøre, om syntetiserede PDTM-analoger hæmmede direkte tyrosinase gennem binding til sit aktive websted. Kojicsyre og fem PDTM analoger (PDTM3, PDTM7–PDTM9 og PDTM13), som viste sig at have potent svamptyrosinasehæmmendeaktivitet, blev brugt som ligander til docking simulering. Hver af disse PDTM-analoger kunne have fire stereoisomerer og stereoisomerernes bindingsenergier er angivet i figur 3A. Alle fem PDTM-analoger var viste sig at have en lignende eller højere affinitet for det aktive sted for tyrosinase sammenlignet med kojinsyre (-5,4 kcal/mol), og PDTM3 demonstrerede den største affinitet. Dette resultat indikerede, at de stærke hæmmende virkninger af disse fem PDTM derivater skyldtes deres bindende affinitet med tyrosinase, og viste et tæt forhold mellem binding affinitet, som bestemt ved dockingsimulering, og tyrosinase hæmning.

LigandScout 3.1.2 blev brugt til at identificeretyrosinaseAmino syrerester, der interagerer med PDTM-analoger. Som vist i figur 3B og C, 4-hydroxylgruppen på phenyl ring af PDTM3 interagerede med His85 af tyrosinase gennem hydrogenbinding, og phenylringen interagerede med Val283 og Ala286 gennem hydrofobe interaktioner og med His263 gennem π-π stabling interaktion. Brint binding mellem den alkoholiske hydroxylgruppe og aminoen syrerester af tyrosinase blev kun påvist for PDTM7 og PDTM8. Imidlertid er den alkoholiske hydroxylgruppe af begge PDTM-analoger interagerede med forskellige aminosyrer rester, fx PDTM7 interagerede med His244 og Asn260, der henviser til, at PDTM8 interagerede med Gly281. Desuden Val283 af tyrosinase var involveret i hydrofobe interaktioner med alle fem analoger.

Melanin-indhold assays

B16F10-celler blev brugt til at evaluere depigmenteringsaktiviteterne af PDTM-analogerne. PDTM3 blev valgt til den cellebaserede eksperimenter på grund af sin potente svamptyrosinasehæmmendevirkning og dens manglende toksicitet for B16F10-celler. PDTM3 var evalueret for dets hæmmende virkning mod α-MSH-stimuleretmelanogenesei B16F10-celler ved at bestemme melaninniveauer i cellerne. Melaninniveauerne blev signifikant reduceret efter celler blev behandlet sammen med PDTM3 og α-MSH sammenlignet med med celler behandlet med α-MSH alene. Over koncentrationsområdet 0-25 μM udviste PDTM3 en signifikant og dosisafhængig antimelanogen virkning. Endvidere på en koncentration på kun 10 μM, PDTM3 viste højere hæmmende styrke end kojinsyre ved 25 μM, som afbildet i figur 5. Disse resultater indikerede den antimelanogene virkning af PDTM3 i B16F10-celler var ikke relateret til cytotoksicitet.

Tyrosinase-aktivitetsassay i B16F10-celler

Den hæmmende virkning af PDTM3 på cellulær tyrosinase aktivitet blev undersøgt i B16F10-celler præstimuleret med α-MSH. PDTM3 dosisafhængig hæmmettyrosinaseaktivitet over koncentrationsområdet 0-25 μM (Figur 6). Desuden matchede disse resultater resultaterne af melaninindholdet godt, hvilket antydede, at den antimelanogene virkning af PDTM3 skyldtes hæmningen af tyrosinase.

Konklusion

I dette arbejde blev en række PDTM-analoger syntetiseret og evalueret for deres virkninger påmelanogeneseog tyrosinaseaktivitet i B16F10-celler. Otte analoger udstillet lige så meget eller mere potent hæmning mod svampetyrosinase end kojinsyre, og PDTM3 havde den største hæmmende aktivitet. I B16F10-celler hæmmede PDTM3 signifikant melaninbiosyntesen på en dosisafhængig måde ogtyrosinaseaktivitet over koncentrationsområdet 0-25 μM uden cytotoksisk virkning. Ved en koncentration på 10 μM reduceres PDTM3 melaninbiosyntese og tyrosinaseaktivitet signifikant mere end kojinsyre ved 25 μM. I lyset af vores bemærkning om, at mange PDTM-analoger viste potent tyrosinasehæmmende aktiviteter, foreslår vi, at 1,3-dithiolane betragtes som en passende stillads tiltyrosinasehæmmendeaktivitet. Nu vi leder efter adskillelsesbetingelser for hver PDTM blanding af to racekammerater og adskillelsesbetingelserne og antimelanogen effekt af hver enkelt racemate vil være rapporteret til sin tid.

Køb cistanche kosttilskud