Etablering af et ELISpot-assay til påvisning af cellulær immunitet mod S. Pneumoniae hos vaccinerede nyretransplantationsmodtagere

Abstrakt:

Hos organtransplanterede modtagere er antallet af invasive pneumokoksygdomme 25 gange større end i den generelle befolkning. Vaccination mod S. pneumoniae anbefales i denne kohorte, fordi det reducerer forekomsten af ​​denne alvorlige form for pneumokokinfektion. Tidligere undersøgelser tyder på, at transplanterede kan producere specifikke antistoffer efter pneumokokvaccination.

Det er dog stadig uklart, om vaccination også inducerer specifik cellulær immunitet. I den nuværende undersøgelse af 38 nyretransplanterede modtagere etablerede vi et interferon-ELISpot assay, der kan påvise serotypespecifikke cellulære responser mod S. pneumoniae. Resultaterne indikerer, at sekventiel vaccination med den konjugerede vaccine Prevenar 13 og polysaccharidvaccinen Pneumovax 23 førte til en stigning i serotypespecifik cellulær immunitet. Vi observerede de stærkeste responser mod serotyperne 9N og 14, som begge er komponenter i Pneumovax 23. Cellulære responser mod S. pneumoniae korrelerede positivt med specifikke IgG-antistoffer (r=0.32, p=0.12 ).

Som konklusion er dette den første rapport, der indikerer, at nyretransplanterede modtagere kan få specifikke cellulære responser efter pneumokokvaccination. Det ELISpot, vi etablerede, giver mulighed for yderligere undersøgelser. Disse kunne hjælpe med at definere for eksempel faktorer, der påvirker specifik cellulær immunitet i immunkompromitterede kohorter eller varigheden af ​​cellulær immunitet efter vaccination.

Cellulær immunitet refererer til modstanden af ​​celler i kroppen over for fremmede patogener, som er en del af immunsystemet. Cellulær immunitet involverer en række forskellige celletyper, herunder T-celler, NKT-celler, makrofager, naturlige dræberceller osv. Disse celler genkender og eliminerer patogener såsom vira, bakterier og svampe og beskytter dermed kroppen mod infektion og sygdom. Cellulær immunitet kan også overvåge og eliminere tumorceller. Den menneskelige krop skal også forbedre sin immunitet. Efter forskning viser det sig, at Cistanche kan forbedre immuniteten. Ekstrakten af ​​Cistanche kan stimulere spredningen og aktiviteten af ​​immunceller såsom T-lymfocytter og NK-celler og derved øge menneskets immunitet.

Klik for at kende fordelene ved cistanche tubulosa

Nøgleord:

pneumokokkonjugat- og polysaccharidvacciner; sekventiel vaccination; nyretransplanterede modtagere; serotype-specifik cellulær immunitet; interferon- ELISpot.

1. Introduktion

Den gram-positive bakterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) koloniserer hyppigt den menneskelige nasopharynx [1]. Uden for nasopharynx kan det føre til lobar lungebetændelse, meningitis, mellemørebetændelse eller bihulebetændelse. Udover lokal infektion kan det forårsage invasive pneumokoksygdomme (IPD), som har en dødelighed på cirka 10 procent [1-3]. Ifølge data fra Centers for Disease Control and Prevention er antallet af IPD hos organtransplanterede modtagere 25 gange større end i den generelle befolkning [2,3]. Vaccination mod S. pneumoniae anbefales til personer med immunkompromitterende tilstande, fordi det har vist sig at reducere forekomsten af ​​IPD [4-6].

Bortset fra polysaccharidvacciner mod S. pneumoniae (f.eks. Pneumovax 23, MSD Sharp og Dohme, Haar, Tyskland), er der vacciner konjugeret til en ikke-toksisk mutant form af difteritoksin (f.eks. Prevenar 13, PCV13, Pfizer, New York, NY , USA) [7], der virker T-celleafhængigt.

I Tyskland anbefales en sekventiel administration af den 13-valente pneumokokkonjugatvaccine efterfulgt af den 23-valente pneumokokpolysaccharidvaccine efter 6-12 måneder til immunkompromitterede personer såsom transplantationsmodtagere [8]. Vaccinerede modtager først glycokonjugatvaccinen Prevenar 13. Ifølge tidligere data fra mus kunne CD4 plus T-celler genkende glycan-modificerede peptider præsenteret af major histocompatibility complex (MHC) klasse II (kulhydratspecifik hjælper CD4 T plus-celler, Tcarbs) [9 ,10]. Disse specifikke Tcarbs kunne øge produktionen af ​​klasse-switched (IgG) antistofresponser rettet mod pneumokokpolysaccharider.

Disse tidligere data er imidlertid ikke i stand til at bestemme kilden til interferon (IFN)-sekretion i vores ELISpot-assays, hvor celler blev stimuleret af (ikke-konjugerede) polysaccharid-antigener.

Serologisk kontrol af vaccinationsresponser anbefales til immunkompromitterede patienter, selvom det fortsat er uklart, i hvilket omfang antistoftitere afspejler beskyttelse [11]. Den beskyttelse, der kan opnås med dette vaccineregime, er stadig uklar i transplantationskohorter [12-14]. Der er i øjeblikket kun data om specifik humoral immunitet efter vaccination mod S. pneumoniae [12-16]. Specifikke T-celledata efter vaccination mod pneumokokker er endnu ikke offentliggjort i en transplantationskohorte. Hos raske voksne kunne det imidlertid påvises, at cellulær immunitet over for pneumokokpolysaccharider blev øget ved vaccination [17].

Den aktuelle undersøgelse havde til formål at etablere et ELISpot, der er følsomt nok til at påvise specifik cellulær immunitet mod S. pneumonia hos vaccinerede nyretransplanterede modtagere.

2. Materialer og metoder

2.1. Patienter

I alt blev 38 klinisk stabile nyretransplanterede modtagere (70 prøver) inkluderet i denne tværsnitsundersøgelse med enkeltcenter (tabel 1). Medianalderen var 53 år (spændvidde 23-77 år); 12 patienter var kvinder og 26 var mænd. Patienterne fik to vaccinationer mod S. pneumoniae. De blev vaccineret sekventielt med en enkelt dosis Prevenar 13, efterfulgt af en enkelt dosis Pneumovax 23 seks måneder senere. Medianintervallet mellem den (sidste) nyretransplantation og den første vaccination var 38 måneder (3 måneder-33 år).

Stabil allotransplantatfunktion (defineret som<15% change in serum creatinine concentration within one month before vaccination), an interval of ≥3 months to kidney transplantation, and absence of clinical infection, of allograft rejection and pregnancy, were defined as inclusion criteria. Blood samples were drawn immediately before vaccination with Pneumovax 23 (month 6), and one month and six months thereafter (months 7 and 12, respectively). This study was approved by the institutional review board of the University Hospital Essen (14-5858-BO), and written informed consent was obtained from all participants. It was carried out by the Declarations of Helsinki and Istanbul and their subsequent amendments.

2.2. Vacciner

Den {{{{20}}}}valente pneumokokvaccine Prevenar 13 indeholder polysaccharider af 13 pneumokokserotyper (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F og 23F), individuelt konjugeret til en ikke-toksisk mutant form af difteritoksin krydsreaktivt materiale 197 (CRM197). Vaccinen er formuleret i 5 mM succinatbuffer indeholdende 0,85 procent NaCl og 0,02 procent polysorbat 80, ved pH 5,8, og indeholder aluminiumphosphat ved 0,125 mg/dosis aluminium som adjuvans. Den indeholder 2,2 µg/dosis af hver af serotyperne, undtagen serotype 6B ved 4,4 µg/dosis (0,5 ml).

Den 23-valente vaccine Pneumovax 23 er en ukonjugeret vaccine, der indeholder 25 µg hver af de 23 pneumokokserotyper 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 11A, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F og 33F. Vaccinen er formuleret i phenol og<1 mmol sodium chloride per dose (0.5 mL). Both vaccines were injected into the deltoid muscle.

2.3. Bestemmelse af cellulær immunitet mod pneumokokker med ELISpot

Ni milliliter hepariniseret blod blev opsamlet, og perifere blodmononukleære celler (PBMC) blev adskilt ved Ficoll-gradientcentrifugering. Antallet af PBMC blev bestemt af en automatiseret hæmatologianalysator (XP-300, Sysmex, Norderstett, Tyskland). Duplikerede eller tredobbelte kulturer af 200,000 frisk isolerede PBMC blev dyrket uden pneumokok-polysaccharider og enkeltkulturer med 100, 150 og 200 µg/ml pneumokok-polysaccharider (pneumokok-serotyper (Pneumokok-serotyper, PS1, 6, 9, 6, 6, 9, 6, 9, 6, 1, 2, 2, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2. og 25F, alle fra Pfizer, ATCC, Manassas, VA, USA). Produktionen af ​​IFN- blev bestemt ved brug af præ-coatede ELISpot-plader og et standardiseret detektionssystem (T-Track® ELISpot kit, Mikrogen GmbH, Neuried, Tyskland; tidligere Lophius Biosciences GmbH, Regensburg, Tyskland). PBMC blev inkuberet uden og med pneumokokpolysaccharider i 150 µL AIMV-medium (Gibco, Grand Island, NE, USA) ved 37 ◦C. Stimulering med T-celle mitogen phytohæmagglutinin (PHA, 4 µg/ml) tjente som en positiv kontrol. Celler blev præ-inkuberet natten over i U-bundplader (BD Falcon, Nijmegen, Holland).

Derefter blev de inkuberet i yderligere 19 timer i ELISpot-pladerne. Disse forhold kan defineres som optimale. For at optimere ELISpot-betingelserne titrerede vi pneumokokpolysacchariderne (0.5-800 µg/mL) og udførte cellekulturerne uden og med præinkubation natten over. Kolorimetrisk påvisning af cytokin-secernerende celler blev udført i henhold til producentens instruktioner. Pletnumre blev analyseret af en ELISpot-læser (AID Fluorospot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Tyskland).

Udover at overveje individers koncentrationer af polysacchariderne, bestemte vi medianværdier for de optimale koncentrationer (100, 150 og 200 µg/mL) og trak medianen af ​​negative kontroller fra. Derved genererede vi spot-inkrementer, der indikerer specifikke spots. Det skal bemærkes, at de negative kontroller nåede en middelværdi på 0,71 pletter og en gennemsnitlig standardafvigelse på 0,47 pletter.

2.4. Bestemmelse af cellulær immunitet mod pneumokokker ved spredningsassay

I en undergruppe af patienter analyserede vi også lymfocytproliferation, måling af 3Hthymidin-optagelse. Vi brugte 200,000 PBMC pr. cellekultur og stimulerede cellerne med 50-800 µg/mL af polysacchariderne 2, 6A, 9N og 14. PBMC blev inkuberet uden og med pneumokokpolysaccharider i 150 µL AIMV-medium fem dage ved 37 ◦C med U-bundplader. Stimulering med PHA blev anvendt som en positiv kontrol.

I de sidste 16 timer blev kulturerne mærket med 37 kBq 3H thymidin pr. kultur. Celler blev derefter høstet (Harvester 96, Tomtec, Hamden, CT, USA) på filterpuder (Wallac, Turku, Finland), og den inkorporerede radioaktivitet blev kvantificeret ved væskescintillationstælling (1450 Microbeta Trilux, Wallac). Resultaterne blev udtrykt som tællinger pr. minut. Derudover blev stimuleringsindekser (SI) overvejet (proliferationskvotient med specifik stimulering og negativ kontrol (proliferation uden stimulation)). En SI på mindst 3 blev defineret som en positiv respons.

2.5. Bestemmelse af antistoffer mod pneumokokker

Antistoffer mod S. pneumoniae blev bestemt ved en ELISA, der påviser IgG-antistoffer mod 23 pneumokokserotyper (VaccZyme™, The Binding Site, Schwetzingen, Tyskland). Assayet blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner.

2.6. Statistisk analyse

Data blev analyseret under anvendelse af GraphPad Prism 8.4.2.679 (San Diego, CA, USA). Data genereret uden og med præ-inkubation og før eller efter vaccination med Pneumovax 23 blev sammenlignet med Mann-Whitney U-testen. Spearman-testen blev brugt til at korrelere ELISpot-resultater med numeriske variable og Mann-the Whitney-testen til at analysere indvirkningen af ​​patientens køn på ELISpot-resultater. Hvis ikke andet er angivet, er medianværdier angivet. Tosidede p-værdier < 0.05 blev betragtet som signifikante.

3. Resultater

3.1. Optimering af ELISpot-betingelser

Indledende titreringsforsøg med PBMC fra nyretransplanterede modtagere blev udført med 0.5-50 µg/mL pneumokokpolysaccharider og viste næsten ikke-detekterbare cellulære responser (figur 1a), på trods af vaccination mod S. pneumonia. En stigning i polysaccharidkoncentrationerne (50-800 µg/mL), kombineret med en forinkubation natten over i U-bundplader (Figur 1b, c), førte til påviselige, dosisafhængige cellulære responser, der nåede et maksimum ved 100-200 µg/ml.

3.2. Tidsforløb for Pneumococcus-specifikke ELISpot-responser

Ved at bruge de optimerede betingelser (100, 150 og 200 µg/mL af polysacchariderne og præ-inkubation) testede vi klinisk stabile nyretransplantationsmodtagere ved 6, 7 og 12 måneder efter påbegyndelse af vaccination mod pneumokokker, dvs. virkningen af ​​den konjugerede pneumokokvaccine Prevenar 13 ved måned 6 og den kombinerede effekt af begge vacciner (Prevenar 13 og Pneumovax 23) ved måned 7 og 12. Det skal bemærkes, at vi valgte polysaccharidserotyper kun indeholdt i vaccinen Prevenar 13 (6A), kun i Pneumovax 23 (2, 9N, 11A), i begge vacciner (14), eller ingen af ​​dem (25F). IFN-pletterne detekteret i vores pneumococcus-specifikke ELISpot-assay kan karakteriseres som store og intense (figur 2).

Figur 1. Optimering af ELISpot-betingelser for at bestemme specifik cellulær immunitet mod S. pneumoniae. (a) Titreringen af ​​lave koncentrationer af pneumokokpolysacchariderne af serotyperne (PS) 2, 6A, 9N og 14 (0.5–50 µg/mL), uden brug af præ- inkubationstrin, dvs. cellerne blev direkte inkuberet i ELISpot-plader (uden præ-inkubation). (b,c) Resultater efter stimulering med højere koncentrationer af pneumokokpolysacchariderne (50-800 µg/mL), enten uden (b) eller med (c) natten over præinkubation i U-bundplader. I alle tilfælde (a–c) testede vi nyretransplanterede modtagere efter pneumokokvaccination. Medianværdier er angivet med grå vandrette linjer. Positive kontroleksperimenter blev udført med T-celle mitogen phytohæmagglutinin (PHA). Resultater som vist i (b,c) blev sammenlignet med Mann-Whitney test. * p < 0,05, ** p < 0,01.

Figur 2. Interferon-ELISpot-resultater (200,000 PBMC/brønd) hos en kvindelig, 49-årig nyretransplantatmodtager ved måned 12. Patienten havde modtaget vaccination med Prevenar 13 og Pneumovax 23 kl. henholdsvis 12 måneder og 6 måneder før blødning. Hver serotype af pneumokokpolysacchariderne (PS) blev anvendt i tre koncentrationer (100, 150 og 200 µg/ml). Det venstre panel viser ELISpot-resultaterne, og det højre panel viser pladelayoutet. Sammenflydende pletter, der fylder hele brønden, som vist i den positive kontrol med phytohæmagglutinin (PHA), blev sat til 600.

Til beregning brugte vi medianværdier for de tre koncentrationer, hvilket gav et enkelt resultat pr. prøve og tidspunkt. For polysaccharidserotyperne 2, 6A, 9N og 14 observerede vi en stigning i responser ved måned 7 vs. 6 (figur 3). Denne stigning så ud til at være lidt stærkere for tre ud af fire serotyper indeholdt i vaccinen Pneumovax 23 (2, 9N og 14) end for serotype 6A, som kun er indeholdt i Prevenar 13. Reaktioner på PS 25F, serotypen, der er indeholdt i ingen af ​​vaccinerne, var uopdagelige ved 12. måned.

Samlet indikerer dataene, at vaccination med Pneumovax 23 førte til en stigning i cellulære responser på størstedelen af ​​serotyperne i den pågældende vaccine. Det højeste antal specifikke celler kunne påvises en måned efter denne vaccination. Serotype 11A, der også er indeholdt i Pneumovax 23, inducerede imidlertid ikke påviselig cellulær immunitet. Ved måned 12 faldt immuniteten, hvilket kan forventes i forløbet efter vaccination. Uventet kan der også have været en lille stigning i responser mod serotype 6A ved 7. måned, hvilket kunne forklares ved krydsreaktivitet. Et fravær af cellulære responser mod serotype 25F i måned 12 levede op til vores forventninger, fordi det var indeholdt i ingen af ​​vaccinerne.

Figur 3. Specifik cellulær immunitet mod S. pneumonia hos nyretransplanterede modtagere efter at have modtaget vaccination med Prevenar 13 (måned (M) 6) eller Prevenar 13 og Pneumovax 23 (M7 og M12). Det skal bemærkes, at vi valgte pneumokokserotyper (PS), der kun var indeholdt i vaccinen Prevenar 13 (6A, blå), kun i Pneumovax 23 (2, 9N, 11A, sort), i begge vacciner (14, rød) eller i ingen af dem (25F, grøn). Responser mod PS 14 blev kun målt i 41 ud af 55 prøver, og responser mod PS 25F blev kun målt i syv (ved M12). Vi brugte medianværdier for de tre koncentrationer af hvert polysaccharid (100, 150 og 200 µg/mL), hvilket gav et enkelt resultat pr. prøve og tidspunkt. Medianværdier er angivet med grå vandrette linjer. Positive kontroleksperimenter blev udført med T-celle mitogen phytohæmagglutinin (PHA). Forøgelse betyder, at negative kontroller blev trukket fra resultater efter stimulering med S. pneumoniae polysaccharider.

3.3. Koncentrationsafhængighed af Pneumococcus-specifikke proliferative reaktioner

Ved at bruge 50-800 µg/mL af pneumokokpolysacchariderne udførte vi også proliferationsassays. Specifikke svar var svage. I alle undtagen ét tilfælde var tællinger pr. minut efter stimulering med pneumokok-polysaccharider under 2200, hvilket vi klassificerer som et borderline-respons (figur 4). Tre ud af fem vaccinerede nyretransplantationsmodtagere viste påviselig proliferation, som defineret ved et maksimalt stimulationsindeks på mindst 3. Den første patient reagerede på serotype 2, 9N og 14 (SI på henholdsvis op til 5,8, 3,6 og 3,8) , den anden til serotype 6A og 9N (SI på op til henholdsvis 3,1 og 5,1), og den tredje til serotype 2 (SI på op til 3,9).

Figur 4. Proliferative responser hos vaccinerede nyretransplantationsmodtagere efter stimulering med polysaccharider fra S. pneumoniae. (a) Resultater angivet som trin pr. minut; (b) stimulationsindeks, dvs. som en kvotient af stimulerede og ustimulerede kulturer. Vi brugte pneumokokpolysaccharider af serotype (PS) 2, 6A, 9N og 14 i koncentrationer på 50-800 µg/mL og dyrkede celler i seks dage. Stimuleringsindekser på mindst 3 blev defineret som positive responser (stiplet linje). Medianværdier er angivet med grå vandrette linjer. Negative kontroller var celler dyrket uden specifik stimulering, og positive kontrolceller blev stimuleret med T-cellemitogenet phytohæmagglutinin (PHA).

3.4. Korrelation mellem Pneumococcus-specifikke ELISpot-responser og specifikke antistoffer

Parallelt med ELISpot-assayene blev IgG-antistoffer mod 23 pneumokokserotyper bestemt ved ELISA. Spearman-korrelationsanalyse blev udført ved måned 12 efter vaccination og betragtede summen af ​​ELISpot-responser mod serotyperne 2, 6A, 9N og 14 under anvendelse af de optimerede ELISpot-betingelser (n=25). Vi observerede en positiv korrelation (r=0.32, p=0.12), som vist i figur 5. Vi overvejede også de individuelle ELISpot-assays og observerede en positiv korrelation i alle fire serotyper (PS 2) : r=0.04; PS 6A: r=0.15; PS 9N: r=0.28; PS 14: r=0.36). Desuden var data om PS 11A tilgængelige hos 22 ud af 25 patienter (r=0.26).

Figur 5. Spearman-korrelationsanalyse af ELISpot-resultater og IgG-antistoffer mod S. pneumoniae. Denne analyse vurderer resultaterne af nyretransplanterede modtagere ved måned 12, dvs. efter at have modtaget vaccination med Prevenar 13 og Pneumovax 23. Vi opsummerede ELISpot-responser mod pneumokokserotyperne (PS) 2, 6A, 9N og 14, testet ved koncentrationer på 100, 150 og 200 µg/ml. Vi brugte medianværdier for de tre koncentrationer af hver serotype, hvilket gav et enkelt resultat pr. prøve. IgG-antistoffer mod 23 pneumokokserotyper blev bestemt parallelt ved kommerciel ELISA (n=25). Den kontinuerlige linje repræsenterer regressionslinjen og de stiplede linjer 95 procent konfidensintervallet.

3.5. Korrelation mellem Pneumococcus-specifikke ELISpot-responser og patientkarakteristika

Spearman-analyse indikerede, at ELISpot-responser ved 12. måned korrelerede i fem ud af seks serotyper positivt med intervallet mellem transplantation og vaccination, og nåede statistisk signifikans for serotypen PS 6A (r=0.37, p=0. 04). Patienter vaccineret senere efter transplantation havde således højere cellulære responser. Mænd viste i gennemsnit 1.1-gang højere svar end kvinder, hvilket var ikke-signifikant. Alder havde ingen sikker effekt på cellulære reaktioner (r=−0.35—r=0.25). Da 25 ud af 33 patienter testet i måned 12 fik et tacrolimus-baseret immunsuppressivt regime, kunne virkningen af ​​immunsuppressive lægemidler ikke analyseres tilstrækkeligt i vores ret lille kohorte.

4. Diskussion

I vores nuværende undersøgelse beskriver vi etableringen af ​​et IFN-ELISpot-assay til at påvise specifik immunitet mod S. pneumoniae hos vaccinerede nyretransplantationsmodtagere. Sammenlignet med en tidligere undersøgelse af vaccinerede raske individer, syntes ELISpot-responser på pneumokokpolysaccharider generelt at være lavere hos transplanterede patienter [17]. Der var dog store forskelle i forsøgsmiljøet. Hvorimod den tidligere undersøgelse af Wuorimaa et al. brugte den komplette polysaccharidvaccine (uden adjuvanser) som antigen, brugte vi her enkelte polysaccharid serotyper.

Derved kunne vi måle serotype-specifikke responser. Andre tidligere undersøgelser af cellulær immunitet efter pneumokokvaccination brugte konjugatet, difteritoksin [18] eller den komplette vaccine indeholdende toksinet [17,19,20] som en antigen stimulus. Derved var de cellulære assays ikke specifikke for pneumokokker, men kunne også vise responser på konjugatet.

Desuden er der nogle undersøgelser af cellulær immunitet, der anvender enten bakterielle lysater, supernatanter eller pneumokok overfladeprotein A, et cellevægsassocieret overfladeprotein af S. pneumoniae, uanset vaccination og uanset transplantation [21-24]. Disse tidligere rapporter indikerer, at CD4 plus T-celleresponser mod S. pneumoniae kan måles ved IFN-ELISpot eller flowcytometri, der detekterer henholdsvis IFN- eller IL-17-produktion og CD154- eller CD25-ekspression. Ved at bruge PBMC fra raske voksne, Wuorimaa et al. viste, at pneumokok-specifik IFN-sekretion var fremtrædende og øget efter vaccinationen med proteinkonjugerede og ikke-konjugerede pneumokokvacciner [17]. Det skal bemærkes, at hos frivillige, der fik ikke-konjugerede pneumokokvacciner, steg IFN-reaktioner mod polysaccharid-antigener (uden proteinbærer) efter vaccination (prævaccination: 0, dag 14: 32, dag 28: 22; data repræsenterer gennemsnitlige antal af IFN-udskillende celler). Derfor er vores nuværende resultater i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse.

Det skal afklares, hvilken celletype der er kilden til IFN-sekretion. Ifølge pletkarakteristikaene (store og intense) kunne de IFN- -producerende celler være T-celler. Når en eksperimentel cellulær musemodel blev brugt, afslørede klonotypekortlægning af in vivo og in vitro pneumokok polysaccharid-aktiverede CD4 plus T-celler klonotypiske T-cellereceptor (TCR) transkripter [25]. Det blev foreslået, at zwitterioniske polysaccharider inducerede oligoklonal CD4 plus T-celleaktivering, som var afhængig af antigen-præsenterende celler [25]. Forfatterne foreslog, at polysaccharider kan binde til den ydre del af MHC klasse II-bindingsrillen, og at de blev genkendt af CDR3-bindingsdomænet af TCR. Præsentation af MHC klasse II-molekyler krævede også tilstedeværelsen af ​​HLA-DM-molekyler.

Det er dog blevet vist af Avci et al. at CD4 plus T-kloner kun genkender og reagerer med kulhydrater i MHC klasse II sammenhæng, når de præsenteres af et peptid [9]. Men vi brugte polysaccharider uden proteinbærer som stimuli. Man kunne også spekulere i, at de reagerende celler måske ikke er δ T-celler eller NKT-celler. δ T-celler synes ikke at kræve antigenbehandling og MHC-præsentation af peptidepitoper [26]. De er en mindre population i det perifere blod, en bro mellem det medfødte og det adaptive immunsystem og bruger deres TCR som en mønstergenkendelsesreceptor [26]. Desuden har der været evidens for involvering af lungespecifikke δ T-celle undergrupper i lokale responser på S. pneumoniae-infektion [27]. Endelig kunne kilden til IFN- være NK-celler, som tidligere beskrevet efter stimulering med lipopolysaccharid, en hovedkomponent i den ydre membran af gramnegative bakterier [28]. Det skal bemærkes, at Kanevskiy et al. stimulerede NK-cellerne med lipopolysaccharider, men ikke med pneumokok-polysaccharider (fra den Gram-positive bakterie S. pneumoniae).

Hvor adskillige undersøgelser af humoral immunitet hos transplantationsmodtagere indikerer, at disse patienter kan montere et antistofrespons efter vaccination - skønt på et reduceret niveau - [12-16], er data om specifik cellulær immunitet efter vaccination endnu ikke offentliggjort i denne kohorte. Det var en udfordring at etablere et assay, der detekterede cellulære immunresponser mod S. pneumonia hos nyretransplanterede modtagere, da det endda er på et lavt niveau hos raske kontroller [17]. Det var endnu ikke defineret, om disse patienter kunne udvikle en cellulær reaktion mod pneumokokker på trods af livslang immunsuppressiv behandling. Vi rapporterer her, at nyretransplanterede modtagere udviste en stigning i cellulær pneumokokimmunitet efter vaccination. PS 9N og 14 - begge komponenter i Pneumovax 23 - inducerede samlet set det stærkeste cellulære immunrespons. Fundet passer godt med humorale data hos vaccinerede nyretransplanterede modtagere [29]. Denne tidligere undersøgelse viste en kraftig stigning i antistoffer rettet mod de to serotyper 9N og 14 efter vaccination med Pneumovax 23.

Desuden nåede antistoffer rettet mod serotype 14 vs. 12 andre serotyper den højeste koncentration i poolet serum af 278 raske frivillige immuniseret med Pneumovax 23 [30], hvilket indikerer, at denne serotype er meget immunogen. I lighed med antistofresponser er der stor variation mellem individer, højst sandsynligt på grund af tidligere infektion med S. pneumoniae og varierende grader af immunsuppression. I øjeblikket er der ingen guldstandard til at detektere cellulære responser mod S. pneumonia, og det er derfor svært at bestemme sensitiviteten og specificiteten af ​​vores ELISpot-assay. Endvidere kompliceres analysen af, at hyppig naturlig infektion med pneumokokker også kan føre til humorale og cellulære immunresponser.

Da vi observerede en dosisafhængighed af ELISpot-responser (med en klokkeformet dosis-responskurve) og en stigning i responser efter vaccination, opfylder resultaterne hovedkarakteristika for antigenspecifikke cellulære responser. Mens vi kunne detektere serotype-specifik IFN-produktion ved ELISpot-metoden, var proliferative responser generelt på et lavt niveau. Dette fund passer godt med det tidligere studie af vaccinerede raske kontroller, som heller ikke kunne påvise specifik T-celleproliferation efter stimulering med polysaccharidvaccinen [17].

Som vist ved Spearman-analyse korrelerede cellulær og humoral immunitet mod S. pneumoniae positivt, men ret svagt (r {{0}}.32). Dette fund er på linje med immunresponser mod andre mikrobielle antigener, f.eks. mod hepatitis B-virus (r=0.38) [31] eller SARS-CoV-2-virus (r=0). 20-0,52, afhængig af den antigene stimulus og kohorten) [32].

Vi har tidligere analyseret virkningen af ​​immunsuppressiv behandling på serotype-specifik humoral immunitet efter vaccination med Prevenar 13 [15]. Vores undersøgelse viste, at 35 nyretransplantationsmodtagere med mod 14 uden mycophenolatmofetil-behandling reagerede på vaccination med mindre stigning i opsonophagocytic killing assay (OPA) titere såvel som et globalt og serotype-specifikt anti-pneumokok kapselpolysaccharid (PCP) IgG, IgG2 og IgA ved 1 og 12 måneder efter vaccination. Treogtredive patienter, der fik tacrolimus, havde højere OPA-titre og serotypespecifik anti-PCP IgG sammenlignet med 16, der ikke gjorde det. Desuden udviste de højere IgA-koncentrationer 12 måneder efter vaccination. Tager man den positive korrelation mellem cellulær og humoral immunitet i betragtning, kunne man spekulere i, at også cellulær immunitet mod pneumokokker er afhængig af det immunsuppressive regime.

Selvom måling anbefales, er den prædiktive værdi af antistoftitre mod S. pneumoniae om infektionsbeskyttelse stadig uklar hos transplanterede patienter. Forhåbentlig korrelerer T-cellerespons som påvist af ELISpot-metoden bedre med forekomsten af ​​kliniske hændelser. Ikke desto mindre skal dette analyseres.

Som konklusion vil ELISpot-metoden, vi beskriver i det aktuelle papir, give mulighed for yderligere undersøgelser. Disse kunne hjælpe med at definere faktorer, der påvirker specifik cellulær immunitet mod pneumokokker i en transplantationskohorte eller varigheden af ​​cellulær immunitet efter vaccination.

Forfatterbidrag:

Konceptualisering, OW, BW og ML; metodik, ML; validering, ML og AG; formel analyse, ML; undersøgelse, ML, AG og OW; ressourcer, NM, KV, BW, UE, HR og OW; datakurering, ML, KV og AG; skrivning - originalt udkast til forberedelse, ML og AG; skrivning – gennemgang og redigering, BW, NM og PAH; visualisering, ML; supervision, ML, NM og OW; projektadministration, OW; funding acquisition, AG, PAH og OW Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering:

Denne forskning modtog ingen ekstern finansiering. AG er støttet af en forskningsbevilling fra Stiftung Universitätsmedizin. OW er støttet af en ubegrænset bevilling fra RudolfAckermann-Stiftung (Stiftung für Klinische Infektiologie).

Udtalelse fra det institutionelle revisionsudvalg:

Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Helsinki-erklæringen og godkendt af den etiske komité på University Hospital Essen, Tyskland (14-5858-BO).

Erklæring om informeret samtykke:

Informeret samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner involveret i undersøgelsen.

Erklæring om datatilgængelighed:

Dataene præsenteret i denne undersøgelse er tilgængelige på anmodning fra den tilsvarende forfatter. Dataene er ikke offentligt tilgængelige på grund af privatlivsbegrænsninger.

Anerkendelser:

Vi er Babette Große-Rhode taknemmelige for hendes fremragende tekniske assistance.

Interessekonflikt:

AG har modtaget højttalerhonorarer, honorarer og rejseudgifter fra Alexion, BioMérieux, Novartis og Sanofi. OW har modtaget forskningsstipendier til kliniske studier, højttalerhonorarer, honorarer og rejseudgifter fra Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers Squibb, Correvio, Chiesie, Gilead, Hexal, Janssen, F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi og TEVA. De resterende forfattere erklærer ingen interessekonflikt. Finansierne havde ingen rolle i udformningen af ​​undersøgelsen; i indsamling, analyser eller fortolkning af data; i skrivningen af ​​manuskriptet; eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.

Referencer

1. Smell, B.; Auranen, K.; Kayhty, H.; Goldblatt, D.; Dagan, R.; O'Brien, KL; Pneumokok-transport, G. Den grundlæggende forbindelse mellem pneumokok-bæring og sygdom. Expert Rev. Vaccines 2012, 11, 841-855. [CrossRef] [PubMed]

2. Nationalt Vaccineprogramkontor. Voksenvaccinationsplaner.

3. Arora, S.; Kipp, G.; Bhanot, N.; Sureshkumar, KK Vaccinationer hos nyretransplanterede modtagere: Rydning af det mudrede vand. Verden J. Transpl. 2019, 9, 1-13. [CrossRef] [PubMed]

4. Centre for Disease Control and Prevention. Brug af 13-Valent Pneumokok-konjugatvaccine og 23-Valent Pneumokok-polysaccharidvaccine til voksne med immunkompromitterende tilstande: Anbefalinger fra den rådgivende komité for immuniseringspraksis (ACIP). MMWR 2012, 61, 816-819.

5. Robert-Koch-Institut. Wissenschaftliche Begründung für die Aktualisierung der Empfehlungen zur Indikationsimpfung gegen Pneumokokken für Risikogruppen. Epid. Tyr. 2016, 37, 385-406.

6. Bonten, MJ; Huijts, SM; Bolkenbaas, M.; Webber, C.; Patterson, S.; Gault, S.; van Werkhoven, CH; van Deursen, AM; Sanders, EA; Verheij, TJ; et al. Polysaccharid konjugeret vaccine mod pneumokok lungebetændelse hos voksne. N. Engl. J. Med. 2015, 372, 1114-1125. [CrossRef]

7. Det Europæiske Lægemiddelagentur: Vurderingsrapport for Prevenar 13.

8. Soininen, A.; Seppala, I.; Nieminen, T.; Eskola, J.; Kayhty, H. IgG underklassefordeling af antistoffer efter vaccination af voksne med pneumokokkonjugatvacciner. Vaccine 1999, 17, 1889-1897. [CrossRef]

9. Avci, FY; Li, X.; Tsuji, M.; Kasper, DL En mekanisme til glycokonjugatvaccineaktivering af det adaptive immunsystem og dets implikationer for vaccinedesign. Nat. Med. 2011, 17, 1602-1609. [CrossRef]

10. Sun, X.; Stefanetti, G.; Berti, F.; Kasper, DL Polysaccharidstruktur dikterer mekanismen for adaptiv immunrespons på glycokonjugatvacciner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2019, 116, 193-198. [CrossRef]

11. Niehues, T.; Bogdan, C.; Hecht, J.; Mertens, T.; Wiese-Posselt, M.; Zepp, F. Impfen bei Immundefizienz. Bundesgesundheitsblatt Gesundh. Gesundh. 2017, 60, 674-684. [CrossRef]

12. Tobudic, S.; Plunger, V.; Sunder-Plassmann, G.; Riegersperger, M.; Burgmann, H. Randomiseret, enkeltblindet, kontrolleret forsøg til evaluering af prime-boost-strategien for pneumokokvaccination hos nyretransplanterede modtagere. PLoS ONE 2012, 7, e46133. [CrossRef]

13. Dendle, C.; Stuart, RL; Mulley, WR; Holdsworth, SR Pneumokokvaccination hos voksne solide organtransplantationsmodtagere: En gennemgang af aktuelle beviser. Vaccine 2018, 36, 6253-6261. [CrossRef]

14. Hoffman, TW; Meek, B.; Rijkers, GT; Grutters, JC; van Kessel, DA Pneumokokkonjugatvaccination efterfulgt af pneumokokpolysaccharidvaccination hos lungetransplantationskandidater og -modtagere. Transpl. Direkte 2020, 6, e555. [CrossRef]

15. Oesterreich, S.; Lindemann, M.; Goldblatt, D.; Horn, PA; Wilde, B.; Witzke, O. Humoral respons på en 13-valent pneumokokkonjugatvaccine hos nyretransplanterede modtagere. Vaccine 2020, 38, 3339-3350. [CrossRef]

16. Blanchard-Rohner, G.; Enriquez, N.; Lemaitre, B.; Cadau, G.; Giostra, E.; Hadaya, K.; Meyer, P.; Gasche-Soccal, PM; Berney, T.; van Delden, C.; et al. Pneumokokimmunitet og PCV13-vaccinerespons hos SOT-kandidater og -modtagere. Vaccine 2021, 39, 3459-3466. [CrossRef]

17. Wuorimaa, T.; Kayhty, H.; Eskola, J.; Bloigu, A.; Leroy, O.; Surcel, HM Aktivering af cellemedieret immunitet efter immunisering med pneumokokkonjugat eller polysaccharidvaccine. Scand. J. Immunol. 2001, 53, 422-428. [CrossRef]

18. Rabian, C.; Tschope, I.; Lesprit, P.; Katlama, C.; Molina, JM; Meynard, JL; Delfraissy, JF; Chene, G.; Levy, Y.; Group, APS Cellulære CD4 T-celleresponser på det difteri-afledte bærerprotein fra konjugeret pneumokokvaccine og antistofrespons på pneumokokvaccination hos HIV-inficerede voksne. Clin. Inficere. Dis. 2010, 50, 1174-1183. [CrossRef]

19. Gazi, U.; Karasartova, D.; Sahiner, IT; Gureser, AS; Tosun, O.; Derici, MK; Dolapci, M.; Taylan Ozkan, A. Effekten af ​​splenektomi på niveauerne af PCV--13-inducerede hukommelses-B- og T-celler. Int. J. Clin. øv. 2018, 72, e13077. [CrossRef]

20. Karasartova, D.; Gazi, U.; Tosun, O.; Gureser, AS; Sahiner, IT; Dolapci, M.; Ozkan, AT Anti-pneumokokvaccine-inducerede cellulære immunresponser hos posttraumatiske splenektomerede individer. J. Clin. Immunol. 2017, 37, 388-396. [CrossRef]

21. Glennie, SJ; Sepako, E.; Mzinza, D.; Harawa, V.; Miles, DJ; Jambo, KC; Gordon, SB; Williams, NA; Heyderman, RS Nedsat CD4 T-cellehukommelsesrespons på Streptococcus pneumoniae går forud for udtømning af CD4 T-celler hos HIV-inficerede malawiske voksne. PLoS ONE 2011, 6, e25610. [CrossRef]

22. Sepako, E.; Glennie, SJ; Jambo, KC; Mzinza, D.; Iwajomo, OH; Banda, D.; van Oosterhout, JJAWN; Gordon, SB; Heyderman, RS Ufuldstændig genopretning af pneumokok CD4 T-celleimmunitet efter initiering af antiretroviral behandling hos HIV-inficerede malawiske voksne. PLoS ONE 2014, 9, e100640. [CrossRef]

23. Baril, L.; Dietemann, J.; Essevaz-Roulet, M.; Beniguel, L.; Coan, P.; Briles, DE; Guy, B.; Cozon, G. Pneumokokoverfladeprotein A (PspA) er effektivt til at fremkalde T-celle-medierede responser under invasiv pneumokoksygdom hos voksne. Clin. Exp. Immunol. 2006, 145, 277-286. [CrossRef]

24. Jaat, FG; Hasan, SF; Perry, A.; Cookson, S.; Murali, S.; Perry, JD; Lanyon, CV; De Soyza, A.; Todryk, SM Antibakterielle antistof- og T-celleresponser i bronkiektasi er differentielt forbundet med lungekolonisering og sygdom. Respir. Res. 2018, 19, 106. [CrossRef]

25. Groneck, L.; Schrama, D.; Fabri, M.; Stephen, TL; Harms, F.; Meemboor, S.; Hafke, H.; Bessler, M.; Becker, JC; Kalka-Moll, WM Oligoklonale CD4 plus T-celler fremmer værtshukommelsesimmunresponser på Zwitterionisk polysaccharid af Streptococcus pneumoni. Inficere. Immun. 2009, 77, 3705-3712. [CrossRef]

26. Holtmeier, W.; Kabelitz, D. Gamma delta T-celler forbinder medfødte og adaptive immunresponser. Chem. Immunol. Allergy 2005, 86, 151-183. [CrossRef]

27. Kirby, AC; Newton, DJ; Carding, SR; Kaye, PM Beviser for involvering af lungespecifikke gamma delta T-celle-undergrupper i lokale responser på Streptococcus pneumoniae-infektion. Eur. J. Immunol. 2007, 37, 3404-3413. [CrossRef]

28. Kanevskiy, LM; Telford, WG; Sapozhnikov, AM; Kovalenko, EI Lipopolysaccharid inducerer IFN-gamma-produktion i humane NK-celler. Foran. Immunol. 2013, 4, 11. [CrossRef]

29. Lindemann, M.; Heinemann, FM; Horn, PA; Witzke, O. Immunitet mod pneumokok-antigener hos nyretransplanterede modtagere. Transplantation 2010, 90, 1463-1467. [CrossRef]

30. Goldblatt, D.; Plikaytis, BD; Akkoyunlu, M.; Antonello, J.; Ashton, L.; Blake, M.; Burton, R.; Care, R.; Durant, N.; Feavers, I.; et al. Etablering af et nyt humant pneumokok standard referenceserum, 007sp. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18, 1728-1736. [CrossRef]

31. Lindemann, M.; Barsegian, V.; Siffert, W.; Ferencik, S.; Roggendorf, M.; Grosse-Wilde, H. Rolle af G-protein beta3-underenhed C825T og HLA klasse II polymorfismer i immunresponset efter HBV-vaccination. Virology 2002, 297, 245-252. [CrossRef]

32. Lindemann, M.; Klisanin, V.; Thümmler, L.; Fisenkci, N.; Tsachakis-Mück, N.; Ditschkowski, M.; Schwarzkopf, S.; Klump, H.; Reinhardt, HC; Horn, PA; et al. Humorale og cellulære vaccinationsresponser mod SARS-CoV-2 hos modtagere af hæmatopoietiske stamcelletransplantationer. Vacciner 2021, 9, 1075. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com