Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Redder AD-underskud ved at modulere mikroglia-aktivering, men ikke oxidativ stress

Abstrakt: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) blev isoleret fra den Taiwan-specifikke medicinske svamp Antrodia camphorate, som er kendt for sin sundhedsfremme og anti- ældningseffekter i folkemedicin. Alzheimers sygdom (AD) er en stor ældningsassocieret sygdom. Vi undersøgte effektiviteten og den potentielle mekanisme af ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol for AD-symptomer. Drosophila med pan-neuronal overekspression af humant amyloid-(A) blev anvendt som AD-modellen. Vi sammenlignede levetid, motorisk funktion, indlæring, hukommelse, oxidativ stress og biomarkører for mikroglia-aktivering og betændelse i ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- behandlede gruppe til dem fra den ubehandlede kontrol. Ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -behandlingen forbedrede effektivt AD-modellens levetid, motoriske funktion, indlæring og hukommelse sammenlignet med den ubehandlede kontrol. Biomarkører for mikroglia-aktivering og -inflammation blev reduceret, mens den allestedsnærværende lipidperoxidation, katalaseaktivitet og superoxiddismutaseaktivitet forblev uændret. Som konklusion, ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol redder AD-underskud ved at modulere mikroglia-aktivering, men ikke oxidativt stress.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på sædmembranens funktion. Cistanche polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescent mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH frie radikaler og har evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikaler-induceret kollagen nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin frie radikaler.

Klik på Fordele ved Cistanche Tablets

【For mere info:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nøgleord: Alzheimers sygdom; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-forsøgt-3 -ol

1. Introduktion

Antrodia camphorata er en medicinsk svamp unik for Taiwan og var en vigtig økonomisk afgrøde for Taiwans udenrigshandel i det 19. århundrede [1]. Taiwans første historiebog, Tâi-uân Thong-sú (bogstaveligt talt Taiwans generelle historie), registrerede de indfødte medicinske anvendelser af Antrodia camphorate, herunder eliminering af patogener, "forbedring af sundhed", "forfriskende blod", "alkoholafgiftning", " beskytter leveren" og "anti-aging" [2-4]. Da vi står over for en global befolkningssundhedsudfordring på grund af aldring [5], er den videnskabelige undersøgelse af indfødt medicin til at udnytte viden mod aldring afgørende.

Blandt de store aldringsassocierede sygdomme, såsom makuladegeneration, åreforkalkning, kræft og slagtilfælde, er Alzheimers sygdom (AD) en svær nød at knække på grund af dens uhåndgribelige patologiske mekanisme. Effektiv sygdomsmodificerende behandling for AD er stadig ikke tilgængelig [6]. Aktuelle patologiske hypoteser om AD inkluderer, men er ikke begrænset til, reduktioner i cholinacetyltransferase, glutamatexcitotoksicitet, amyloid beta (A) aggregering, tau-phosphorylering, hjerneinsulinresistens [7] og ændringer i tarmmikrobiom [8]. Ikke desto mindre, uanset hvilken type AD-initierende årsager involveret, er oxidativ stress og inflammatorisk mikroglia-aktivering de almindelige tegn, der ledsager neurodegenerationen af ​​AD [9,10]. Interessant nok er neuroinflammation og oxidativt stress indbyrdes relaterede hændelser, der både observeres i AD og antages i AD-patologi. På den ene side udløser senile plaques af A-aflejring inflammatoriske reaktioner, mikroglia-aktivering, cytokinfrigivelse og astrocytose, hvilket fører til uønskede konsekvenser såsom progressiv neuronal skade og endelig kognitive dysfunktioner. Aktiveringen af ​​immunresponser kan indledningsvis bekæmpe invaderende patogener med A eller eliminere for store A-aflejringer; imidlertid producerer processen uundgåeligt reaktive oxygenarter (ROS), som kan forårsage neuronal skade i mikromiljøet. På den anden side kunne A forårsage ROS på en betændelsesuafhængig måde. For eksempel blev A fundet i mitokondrielle membraner af AD postmortem og kunne trænge ind i mitokondrierne, hvilket forårsagede afbrydelse af elektrontransportkæden (ETC) og resulterede i ROS-generering. Forhøjet ROS kan igen udløse cytokinfrigivelse og initiere inflammation [7,9,10]. Derfor kan antioxidative og anti-inflammatoriske molekyler være potentielle terapeutika for AD.

Antrodia camphorate, især en af ​​dens nedsænkede helbouillon-isolerede forbindelser ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (også kendt som EK100), udviste dyb antioxidativ og anti -inflammatoriske aktiviteter [11-13]. Endvidere har Chang et al. [14] har vist, at antroquinonol, en anden forbindelse isoleret fra det fermenterede mycelium af Antrodia camphorate, forbedrer indlæring og hukommelse i en AD musemodel med nedsat astrogliose og oxidativt stress. Imidlertid kunne årsagssammenhængene mellem den reducerede astrogliose og oxidativt stress ved antroquinonolbehandling ikke bekræftes, og sænkningen af ​​oxidativt stress er blevet postuleret som den medierende faktor [14]. Sikkerheden af ​​EK100 er tidligere blevet testet efter Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) Guideline 407 i en musemodel på 10 og 20 mg/kg-dag [15]. Derfor vedtog vi omtrent tilsvarende koncentrationer af gratis fodring til frugtfluer i denne undersøgelse.

Frugtfluemodellen (Drosophila melanogaster) af A 42-overekspression er en veletableret AD-dyremodel [16], med karakteristiske AD-symptomer, herunder reduceret levetid, indlæring og motoriske underskud [17], oxidativ stress [18] og mikroglial aktivering [19]. Modellering af AD's udfordringer i Drosophila melanogaster inkluderer ingen BACE-aktivitet i Drosophila og kønsforskelle, som viser mere alvorlige symptomer i mandlige filer. Disse er ikke observeret i human AD [20]. Derfor adopterede vi humant A42-peptid, der udtrykker fluer til model AD, hvor A42-produktion ikke kræver nogen BACE-aktivitet. I denne undersøgelse testede vi, om EK100 forbedrer AD-symptomer, og endnu vigtigere, om både modulering af oxidativt stress og astrogliose er afgørende for at lindre AD.

2. Resultater

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Rescued Survival and Climbing of AD Drosophila

AD-diagnose er forbundet med en reduktion i median levetid [21], og næsten halvdelen af ​​AD-patienter lider af aktivitetsforstyrrelser [22]. Derfor testede vi, om Antrodia camphorata-ekstraktet ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) forbedrer overlevelses- og klatreevnen for en AD Drosophila model. Vi fandt ud af, at behandling med 125 eller 250 µg/mL ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol forbedrede overlevelsen af ​​AD Drosophila signifikant (p < 0,01) (figur 1A og supplerende tabel S1), men at kun en høj dosis (250 µg/mL) forbedrede klatringen af ​​AD Drosophila (figur 1B). Da overlevelse og mobilitetsunderskud er kliniske symptomer på AD, blev koncentrationen på 250 µg/ml, som forbedrede begge symptomer, brugt i de følgende undersøgelser.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Rescued Learning and One-hour Memory of AD Drosophila

Dernæst testede vi, om ergosta{{0}},9(11),22-trien-3 -olbehandling forbedrer indlærings- og hukommelsesfejl, et kendetegnende symptom på AD. AD-fluer blev behandlet med ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol ved 250 ug/mL i 14 dage og udsat for indlærings- og hukommelsestest med T-labyrint. Som vist i figur 2A, sammenlignet med vildtypekontrollen (AD(-)/EK(-)), faldt indlæringsevnen for AD-kontrollen (AD( plus )/EK(−)) signifikant (p < 0,01), mens ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behandling forbedrede signifikant indlæringsevnen af ​​AD (p < 0,05). Desuden forbedrede ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ol-behandlingen også den faldende én-times hukommelse af AD (figur 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-prøvede-3 -ol Modulated Microglial Activation in AD Drosophila

Dernæst testede vi, om ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol-behandling nedsætter mikroglial aktivering i AD. I AD er aktiverede mikroglia ledsaget af fagocytose og neurodegeneration [23]. I Drosophila er mikroglia-celleopslugningsmarkøren og dermed mikroglialaktiveringsmarkøren udtryk for draper (Drpr) og nedstrøms CED [24]. Efter ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol-behandling blev AD-fluer aflivet, og RNA blev ekstraheret fra fluehovedet til RT-qPCR. Som vist i figur 3A var begge Drpr signifikant nedreguleret i ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol-behandlet AD Drosophila sammenlignet med den ubehandlede AD. Dette indebærer, at ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol reducerede mikroglial aktivering i AD Drosophila. Desuden sænkede ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ol-behandlingen også CNS-inflammationen, som afsløret i nedreguleringen af ​​gener relateret til inflammation (figur 3B) .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-forsøgt-3 -ol modulerede ikke allestedsnærværende oxidativ stress i AD Drosophila

Dernæst testede vi, om moduleringen af ​​allestedsnærværende – dvs. hele kroppen – oxidativ stress er nødvendig for at ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol kan redde AD. Ergosta-7,9(11),22-forsøgt- 3 -ol behandling ændrede ikke lipidperoxidationen (figur 4A), katalaseaktivitet (figur 4B), superoxiddismutaseaktivitet (figur 4C) eller ekspressionen af ​​oxidativ stress-relaterede gener (figur

3. Diskussion

Denne undersøgelse rapporterer effektiviteten og den mulige underliggende mekanisme af ergosta-7,9(11),22- forsøg-3 -ol, et ekstrakt fra Antrodia camphorate, til symptommodificering af AD ved hjælp af Drosophila model med human-A overekspression. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol forbedrede effektivt indlæring og hukommelse og forlængede levetiden for patienter med AD. Derudover blev biomarkører for mikroglia-aktivering og -inflammation reduceret, mens allestedsnærværende oxidativt stress var uændret.

Der er mange kilder til oxidativt stress i AD, herunder men ikke begrænset til aktivering af medfødt immunitet - for eksempel A-akkumulering, forstyrrelse af mitokondrier af A, hyperphosphoryleret tau og metalmalmetabolisme er også kilder [25]. Selvom inflammation og oxidativt stress gensidigt kan inducere hinanden, kan vi antage, at deres synkrone ændringer kun forekommer under omstændigheder, hvor andre kilder til oxidativt stress forbliver konstante. Dette er dog ikke tilfældet i denne undersøgelse. Et fald i medfødt immunitet, især mikroglia-aktivering, dæmper samtidig dets bidrag til clearance af A, hvilket kan resultere i A-akkumulering. Spændende nok udløser A-akkumulering i sig selv produktionen af ​​oxidativt stress på flere måder. Således kan EK1000s faldende mikroglial aktivering og inflammatoriske reaktioner delvist beskytte neuroner mod off-target immunangreb, men vil betale prisen for dæmpningen af ​​A-clearance. Således kan denne undersøgelses resultat afspejle begrænsningen af ​​mikroglia-målretningsstrategien, i det mindste i AD Drosophila-modellen.

Det mikroglia-medierede medfødte immunsystem beskrives som et tveægget sværd ved neurodegenerative sygdomme, især AD [26,27]. Aktiverede mikroglia forsøger at fjerne toksiske patogener såsom A , men forårsager uundgåeligt neuronal skade i mikromiljøet. Overlegenheden på 250 µg/mL EK100 inden for 35 dage kan betyde, at strategien med at sænke mikroglia-aktivering er patologisk-stadie-begrænset, i det mindste i tilfælde af frugtflue AD-modellen. Desuden har den betydelige sænkning af biomarkører for mikroglial aktivering og inflammatorisk respons ikke kunnet udmønte sig i en tilsvarende signifikant forbedring af overlevelse, og CNS-funktionen kunne delvist forklares af mikroglias tveæggede sværdfunktion. Dette indebærer, at mikroglia-aktivering hverken er den eneste eller dominerende faktor for AD-fremskridt. Sænket mikroglial aktivering indebærer også, at nedbrydningen af ​​det overudtrykte A blev delvist slået fra i frugtfluemodellen, hvilket også kan forklare den højere dødelighed for den højere EK100-koncentration mellem 35 og 52 dage.

Antroquinonol, et andet ekstrakt fra Antrodia camphorate, er blevet rapporteret for dets effektivitet i AD-mus-behandling, for hvilken sænkning af oxidativt stress er blevet postuleret som den medierende faktor [14]. Derfor kan dette betyde, at antroquinonol og ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol forbedrer AD-symptomer gennem uafhængige veje, henholdsvis medierer oxidativt stress eller ej. Derfor ville det være interessant at teste, om samtidig behandling med antroquinonol og ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol ville have en synergisk effekt på AD-forbedring.

For det tidlige stadie af AD er hovedfokus for lægemiddeldesign at eliminere A-aflejring (såsom i det nyligt godkendte monoklonale antistof aducanumab [28], på trods af dets kontrovers om minimale kliniske fordele og ineffektivitet i et af de to fase III kliniske forsøg [29]), eller forsøg på at øge mikroglial optagelse af A [30-32]. Men for moderate eller fremskredne stadier af AD forværrer overaktiveringen af ​​mikroglia omvendt neurodegeneration [33], og derfor er alternative terapeutiske strategier påkrævet.

4. Materialer og metoder

4.1. Vedligeholdelse af fluebestand og måling af levetid

Den A-transgene Drosophila-stamme H29.3/CyO blev opnået fra [16] og blev udkrydset med w(CS10) i seks generationer. Den pan-neurale driver elav-GAL4c155 linje blev udkrydset med w(CS10) i seks generationer. Den hvide øje w1118-linje (Bloomington Drosophila Stock Center #3605) krydset med Canton S-linjen (Bloomington Drosophila Stock Center # 64349) 10 gange (w (CS10)) blev brugt som standardbeholdning. Den pan-neurale driver elav-GAL4c155 linje blev opnået fra Bloomington Drosophila Stock Center (#458). Genotypen af ​​de eksperimentelle fluer – dvs. AD-modellen – var [elav; H29.3/ plus ], som blev udvalgt fra F1-afkommet uden CyO-markøren. Fluerne blev holdt i majsmel standardmedier ved 25 ◦C under en 12 timers lys-mørke cyklus. For T-labyrint, den emergente [elav; H29.3/ plus ] fluer blev indsamlet (begge køn blandet og ikke jomfruelige) og dyrket med eller uden EK100 behandling indtil d14 efter fremkomst. Til overlevelse, klatring og RT-qPCR blev kun hanfluerne brugt. RNA-prøver blev indsamlet ved d30 efter fremkomst, når både levetid og klatrekurver viste signifikant adskillelse sammenlignet med den ubehandlede AD-model.

I en levetidsanalyse blev tyve til tredive fluer opdrættet i et fødevarehætteglas med eller uden CS; mindst fire hætteglas blev forberedt til hver behandling. Hætteglas med mad blev udskiftet hver 2. til 3. dag, og døde fluer blev talt på det tidspunkt. Der blev udført mindst tre replikater pr. forsøg. Overlevelsesprocenten er defineret som antallet af levende fluer divideret med det samlede antal fluer ved starten af ​​testen.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol blev udvundet fra den venlige gave fra Antrodia camphorata, som beskrevet tidligere [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol danner et pulver af lysegul farve ved stuetemperatur. Stamopløsningen blev fremstillet ved en koncentration på 6,25 mg/ml i EtOH lige før brug. For levetids- og antigeotaxisassays var slutkoncentrationerne 125 og 250 µg/ml. Til indlæringshukommelse og genekspressionsassays var den endelige koncentration 250 µg/ml. Molekylvægten af ​​EK100 er 396,65. Så de tilsvarende molære koncentrationer er henholdsvis 315 eller 630 µM. Fluer blev behandlet med to doser EK100 med de endelige koncentrationer på 125 og 250 µg/ml blandet i foderet ved ad libitum fodring. Kontrolfødevaren indeholdt den samme mængde opløsningsmiddel EtOH som forsøgsgrupperne med den endelige EtOH-koncentration på 3 % v/v. Behandlingen startede fra fremkomsten indtil dataindsamlingstidspunktet for hvert assay. For overlevelses- og klatreassay blev behandlingen givet gennem hele levetiden. Antallet af fluer for hver replikation blev beskrevet i metodeafsnittet for hvert assay. Vi testede også levetidsassays med behandlede/ubehandlede vildtypefluer for at sikre sikkerheden af ​​ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol i fluemodeller (Supplerende figur S1 ).

4.3. Antigeotaxis-assays

Den nuværende protokol er baseret på en tidligere offentliggjort metode [35], med nogle modifikationer. Kort fortalt blev et gennemsigtigt cylindrisk plastikhætteglas med en diameter på 2,5 cm og en højde på 9,5 cm (længere vil være fint, men vil være sværere at håndtere) brugt som geotakseapparat. Bunden af ​​hætteglasset blev belagt med et enkelt lag fluefoder som en pude. Et 5 cm mærke over puden blev fastgjort til den ydre overflade af hætteglasset. Den anden ende af hætteglasset var åben, og fluer blev læsset derfra. Da assayet blev udført samtidig med overlevelsesassayet, var antallet af ladede fluer identisk med de overlevende på det tidspunkt. Fluerne blev fyldt i hætteglasset; toppen blev forseglet med en hætte, og bunden af ​​hætteglasset blev gentagne gange (i to sekunder) banket mod den hårde overflade, hvorpå den stod (laboratoriebænk i dette tilfælde). Banken var kraftig nok til at forskrække fluerne og få dem til at klatre langs hætteglasvæggene, men ikke så kraftige, at de fysisk skadede dem. Hele processen blev videooptaget i 18 sekunder, hvor antallet af fluer, der klatrede over 5 cm-mærket, blev noteret og udtrykt i procent for hver gruppe. Antallet af fluer, der klatrede over 5 cm mærket, blev talt. Fire replikationer blev udført for hver gruppe. Procentdelen af ​​klatreevne er defineret som antallet af klatrende fluer divideret med det samlede antal fluer ved starten af ​​testen. Klatreevnen blev også testet i behandlede/ubehandlede vildtypefluer for at sikre sikkerheden for ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol i fluemodeller (Supplerende figur S2) .

4.4. Drosophila lærings- og hukommelsesplatform (T-Maze)

For at observere Drosophila-indlæringen og hukommelsen blev omkring 100 fluer først placeret i det øvre kobberkammer, som kan forsynes med elektrisk spænding og give et elektrisk stød til fluer. Fluer blev først leveret i lugt 1 (MCH) sammen med elektriske stødbølger. Derefter blev fluer leveret lugt 2 (OCT) uden elektriske stødbølger. Efter træning blev fluerne flyttet til rummet nedenunder, hvor to åbne sider blev forsynet med henholdsvis lugt 1 eller lugt 2. Ved at observere fluernes bevægelsesretning kan skævheden af ​​lugt 2 over lugt 1 estimeres med Performance Index (PI), defineret som forskellen i antallet af fluer mellem to lugte divideret med det samlede antal fluer. Performance Index repræsenterer Drosophilas evne til indlæring og hukommelse [36]. En anden gruppe fluer blev konditioneret med de omvendte lugtparringer, således at hver lugt fungerede en gang som et elektrisk stød plus og en gang som et elektrisk stød -. PI'erne for disse to tests blev beregnet som den endelige PI af et replikat. "1 h-hukommelse" blev testet efter 1 times afstand til træningen, mens "læring" derimod blev testet efter 1,5 min afstand til træningen. Vi testede også undgåelsen af ​​MCH og OCT af AD-fluerne med eller uden EK100-behandling for at sikre, at behandlingen forårsager skævhed mod de aversive lugte (Supplerende figur S3).

4.5. Kvantitativ PCR

Hoveder og kroppe blev adskilt før RNA-ekstraktion. For én replikat blev fluerne bedøvet med CO2; indsamlet, 100 ad gangen, i Eppendorf-rør; og derefter nedsænket i flydende nitrogen i 1 min for at gøre kroppene sprøde. De resulterende frosne kadavere blev derefter fyldt på stakke af sirystere (Bunsekifurui, nr. 40 og nr. 25) og omrørt. Kroppene brød fra hinanden og blev sorteret efter størrelsen af ​​sigtens masker i to separate fraktioner: "hoveder" og "kroppe". Det totale RNA blev ekstraheret med RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Tyskland) og derefter brugt til syntese af cDNA med VersoTM cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). RNA-ekspressionsniveauerne for de undersøgte gener blev kvantificeret ved real-time PCR (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) med Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Resultaterne blev normaliseret til den relative mængde af Gapdh eller Rpl32. De anvendte primere er anført nedenfor. Gapdh: 50 -GAAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 og 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 og 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 og 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Kat: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 og 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 og 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 og 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 og 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 og 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 og 50 -TAATGCCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 og 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 og 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 og 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 og 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; smag: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 og 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 og 50 -CGAGGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Oxidative stressanalyser

Tre replikater af lipidperoxidation, katalaseaktivitet og superoxiddismutaseaktivitet blev målt ved BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, USA), Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI , USA) og Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman), henholdsvis efter producentens instruktioner. Kort fortalt blev SOD-aktivitet vurderet ved at måle dismutationen af ​​superoxidradikaler genereret af kit-leveret xanthinoxidase og blev påvist ved at transformere tetrazoliumsalt til formazanfarvestof, derefter kvantificeret ved absorbans ved 440-460 nm. CAT-aktivitet blev vurderet ved at måle formaldehyddannelsen fra methanol i nærvær af H2O2 katalyseret af CAT, påvist af det kit-leverede kromogene 4-amino-3- hydrazino-5-mercapto-1 ,2,4-triazol, derefter kvantificeret ved absorbansen ved 540 nm. Lipidperoxidationsaktivitet blev vurderet ved at måle nedbrydningen af ​​polyumættede fedtsyreperoxider til malonaldehyd (MDA) og 4-hydroxyalkenaler, påvist af det kit-leverede kromogene N-methyl-2-phenylindol, derefter kvantificeret ved absorbans ved 586 nm. For SOD-, Cat- og LPO-assayene var antallet af hele homogeniserede fluer af hvert replikat henholdsvis 50, 50 og 100.

4.7. Statistisk Analyse

Betydningen af ​​forskellen mellem overlevelseskurverne og klatrekurverne for ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behandlede og kontrolgrupper blev bedømt ved log-rang (Mantel– Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon-tests. Betydningen af ​​forskellen mellem præstationsindekset for indlæringshukommelse for ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behandlet og kontrolgrupper blev bedømt ved Elevens t-test.

5. Konklusioner

Vi bekræftede, at ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) fra Antrodia camphorate forbedrer overlevelse, indlæring og hukommelse i en Drosophila-model af AD med reducerede biomarkører af mikroglia aktivering og inflammation. Desuden skete symptommodifikationen ikke gennem allestedsnærværende oxidativ stressreduktion, hvilket betyder, at ergosta-7,9(11) og 22-trien-3 -ol forbedrer AD-symptomer gennem forskellige veje til en anden Antrodia camphorate ekstrakt, antroquinonol. EK100 reducerede effektivt mikroglial aktivering og inflammation, hvilket kan hjælpe med at vende typiske AD-associerede kognitive underskud, såsom indlærings- og hukommelsessvigt.

Supplerende materialer:Følgende er tilgængelige online. Figur S1: Overlevelse af vildtypefluer behandlet med EK100; Figur S2: Klatring af vildtypefluer behandlet med EK100; Figur S3: Aversiv lugtundgåelse af AD-fluer behandlet med EK100; Tabel S1: Statistik over overlevelseskurverne.

Forfatterbidrag:H.-PL, Y.-HK og W.-YL designede eksperimenterne. Y.-HK bidrog til udarbejdelsen af ​​EK100. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS og T.-NC udførte eksperimenterne. Alle forfattere deltog i udarbejdelsen af ​​manuskriptet. Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Taiwan (MEST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), China Medical University & Hospital (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 og DMR-109-150), og fra Featured Areas Research Center Program inden for rammerne af Higher Education Sprout Project af Undervisningsministeriet (MOE) i Taiwan (CMRC-CHM-2-1).

Udtalelse fra det institutionelle revisionsudvalg:Ikke anvendelig.

Erklæring om informeret samtykke:Ikke anvendelig.

Erklæring om datatilgængelighed:De data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.

Interessekonflikt:Y.-HK er en af ​​opfinderne, men ikke indehaver af patentet US-9757393-B2 med titlen "Derivater af ergostatrien-3- -ol fra aniridia camphorate og antiglykæmisk, antihyperlipidæmisk og faldende hepatisk fedtanvendelse deraf". Andre forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser. Finansierne havde ingen rolle i udformningen af ​​undersøgelsen; i indsamling, analyser eller fortolkning af data; i skrivningen af ​​manuskriptet, eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.

Eksempel tilgængelighed:Prøver af forbindelserne er tilgængelige fra forfatterne.

Referencer

1. Davidson, JW Formosa-øen, fortid og nutid: historie, mennesker, ressourcer og kommercielle udsigter. Te, kamfer, sukker, guld, kul, svovl, økonomiske planter og andre produktioner; Macmillan & Company: New York, NY, USA, 1903.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. Brugen og virkningen af ​​Ganoderma; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taiwan, 1985; s. 116–117.

3. Chen, C.-J. Undersøgelse af fast dyrkning og bioaktivitet af Antrodia camphorata. Fung. Sci. 2001, 16, 65-72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Gennemgang af farmakologiske virkninger af Antrodia camphorate og dets bioaktive forbindelser. Evid.-baseret komplement. Altern. Med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovljevic, MM Global befolknings aldring-sundhedspleje, sociale og økonomiske konsekvenser. Foran. Public Health 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. Udviklingspipeline for Alzheimers sygdom: 2018. Alzheimers demens. Overs. Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195-214. [CrossRef] [PubMed]

7. Sharma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Omfattende gennemgang af mekanismer for patogenese involveret i Alzheimers sygdom og potentielle terapeutiske strategier. Prog. Neurobiol. 2019, 174, 53-89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sochocka, M.; Donskow-Łysonewska, K.; Diniz, BS; Kurpas, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. Tarmmikrobiometændringer og inflammationsdrevet patogenese af Alzheimers sygdom - En kritisk gennemgang. Mol. Neurobiol. 2019, 56, 1841-1851. [CrossRef]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Neuroinflammation, oxidativt stress og patogenesen af ​​Alzheimers sygdom. Curr. Pharm. Des. 2010, 16, 2766-2778. [CrossRef]

10. Galasko, D.; Montine, TJ Biomarkører for oxidativ skade og inflammation ved Alzheimers sygdom. Biomark. Med. 2010, 4, 27-36. [CrossRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Du, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. Antiinflammatoriske og antifotoskadelige virkninger af ergostatrien-3 -ol, isoleret fra Antrodia camphorata, på hårløs musehud. Molecules 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Wan, C.-H.; Lian, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) fra Antrodia camphorata dæmper oxidativ stress, inflammation og leverskade in vitro og in vivo. Forrige. Nutr. Food Sci. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tung, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Anti-inflammatoriske virkninger af Antrodia camphorata og dens aktive forbindelse, Ergostatrien-3 -ol, i en musehudiskæmimodel. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Chen, MC; Cheng, IH Antroquinonol sænker hjernens amyloid-niveauer og forbedrer rumlig indlæring og hukommelse i en transgen musemodel for Alzheimers sygdom. Sci. Rep. 2015, 5, 1-12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huang, C.-C.; Liang, H.-L. Effekten af ​​Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol fra Antrodia camphorate på musens biokemiske profil og træningsevne. Molecules 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Song, H.-J.; Yang, H.; Konsolaki, M. En model til undersøgelse af Alzheimers A 42-induceret toksicitet i Drosophila melanogaster. Mol. Celle. Neurosci. 2004, 26, 365-375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Sang, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoe, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. Forbindelse af en 42-induceret hyperexcitabilitet til neurodegeneration, indlæring og motoriske underskud og en kortere levetid i en Alzheimers model. PLoS Genet. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Rival, T.; Page, RM; Chandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Liu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fenton kemi og oxidativ stress medierer toksiciteten af ​​amyloid peptidet i en Drosophila model af Alzheimers sygdom. Eur. J. Neurosci. 2009, 29, 1335-1347. [CrossRef]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial draper redder en toksicitet i en Drosophila-model af Alzheimers sygdom. J. Neurosci. 2017, 37, 11881-11893. [CrossRef]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster som en modelorganisme for hjernesygdomme. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 407-440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Corrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Overlevelse efter en diagnose af Alzheimers sygdom. Arch. Neurol. 2002, 59, 1764-1767. [CrossRef]

22. Lam, LC; Tang, W.; Leung, V.; Chiu, HF Adfærdsprofil af Alzheimers sygdom hos kinesiske ældre - en valideringsundersøgelse af den kinesiske version af Alzheimers sygdoms adfærdspatologivurderingsskala. Int. J. Geriatr. Psyk. 2001, 16, 368-373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Inflammatoriske aspekter af Alzheimers sygdom og andre neurodegenerative lidelser. J. Alzheimers Dis. 2008, 13, 359-369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Beach, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watts, RJ; Freeman, MR Drosophila-celle-ligopslugningsreceptoren Draper medierer glial-clearance af afskårne axoner. Neuron 2006, 50, 869–881. [CrossRef]

25. Chen, Z.; Zhong, C. Oxidativ stress ved Alzheimers sygdom. Neurosci. Tyr. 2014, 30, 271-281. [CrossRef]

26. Stankovic, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Microglia-blodkar-interaktioner: Et tveægget sværd i hjernepatologier. Acta Neuropathol. 2016, 131, 347-363. [CrossRef]

27. Konishi, H.; Kiyama, H. Microglial TREM2/DAP12-signalering: Et tveægget sværd ved neurale sygdomme. Foran. Celle. Neurosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chiao, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. Antistoffet aducanumab reducerer A-plak ved Alzheimers sygdom. Natur 2016, 537, 50–56. [CrossRef]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: En ny fase i terapeutisk udvikling for Alzheimers sygdom? EMBO Mol. Med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamin-induceret amyloid-clearance medieret via stimulering af mikrogliale nikotiniske acetylcholin-receptorer. J. Biol. Chem. 2010, 285, 40180-40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Karlo, JC; Landreth, GE Mechanisms, der ligger til grund for den hurtige peroxisom-proliferator-aktiverede receptor- -medierede amyloid-clearance og reversering af kognitive defekter i en murin model af Alzheimers sygdom. J. Neurosci. 2012, 32, 10117-10128. [CrossRef]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Målretning af mikroglia til behandling af Alzheimers sygdom. Ekspert udtalelse. Ther. Mål 2015, 19, 497-506. [CrossRef] [PubMed]

33. Sang, WM; Colonna, M. Identiteten og funktionen af ​​mikroglia i neurodegeneration. Nat. Immunol. 2018, 19, 1048-1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Ergostatrien-3 -ol fra Antrodia camphorata hæmmer diabetes og hyperlipidæmi hos højfedtdiætbehandlede mus via regulering af leverrelaterede gener, glucosetransporter 4 og AMP-aktiveret proteinkinasephosphorylering. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 2479-2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Fnug, FA Hypergravity og aldring i Drosophila melanogaster. 4. Klatreaktivitet. Gerontology 1992, 38, 59-64. [CrossRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Fluer, gener og læring. Ann. Rev. Neurosci. 2001, 24, 1283-1309. [CrossRef] [PubMed]

【For mere info:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】