Forstærkning af de anti-angiogene virkninger af delphinidin, når det er indkapslet i små ekstracellulære vesikler, del 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

3.2. Delphinidin Metabolitter i sEV'er

Ud over delphinidin (figur 2A), peonidin-3-galactosid(Retentionstid=11.11 min, [M]' m/z=463.12404)(Figur 2B) ogdelphinidin3-O- -rutinosid (retentionstid=12.34 min, [M] m/z=611.16121)(Figur 2C) blev påvist under disse eksperimentelle forhold i sEV'er . Spor af disse metabolitter blev også påvist i standardopløsningen af ​​delphinidin. Analysen var baseret på den nøjagtige masse, selvom en autentisk standardløsning er nødvendig for at bekræfte denne observation.

Klik venligst her for at vide mere

3.3. Virkninger af Delphinidin og sEV-ladet Delphinidin på HAoEC-proliferation

Delphinidin alene eller ladet i sEV'er ændrede ikke levedygtigheden af ​​HAoEC'er i 24 timer ved koncentrationer på 1 til 10 ug/mL (Figur 3A).

VEGF (20 ng/ml), anvendt som en positiv kontrol, øgede ikke-signifikant endotelcelleproliferation (figur 3B). Native sEV'er (10 ug/ml) havde ingen effekt. Delphinidin hæmmede endotelcelleproliferation på en koncentrationsafhængig måde med en maksimal effekt nået ved 10 ug/ml (figur 3B). På samme måde inducerede sEV-ladet delphinidin en koncentrationsafhængig hæmning afendotelcelleproliferation. Interessant nok blev den maksimale inhibering opnået ved en koncentration på 5 ug/ml sEV-ladet delphinidin, en koncentration to gange lavere end den for delphinidin alene. Disse resultater tyder på, at sEV-ladet delphinidin var to gange mere potent enddelphinidinalene.

3.4. Effekter af Delphinidin og sEV-ladet Delphinidin på NO-produktion

Som vist på figur 4 inducerede ATP（10μM） en stigning i DAF-2fluorescensillustrerer NO-produktion i endotelceller. Native sEV'er påvirkede ikke NO-niveauet. Delphinidin alene øgede NO-produktion på en koncentrationsafhængig måde, hvor den maksimale effekt blev nået ved 10 ug/ml. Delphinidin-ladede sEV'er fremkaldte også en koncentrationsafhængig forøgelse af endothelial NO-produktion. Interessant nok blev den maksimale effekt af sEV-ladet delphinidin opnået ved 1 ug/ml, mens den frie delphinidin nåede denne effekt ved 10 ug/ml. Således var sEV-ladet delphinidin 10 gange mere potent end delphinidin alene til at øge NO-produktionen.

3.5. Virkninger af Delphinidin og sEV-ladet Delphinidin på angiogenese

HAoEC'er omstrukturerede og dannede kapillærlignende strukturer (figur 5A,B). Native sEV'er havde ingen effekt på dannelsen af ​​kapillærlignende strukturer. Som tidligere beskrevet [6] reducerede delphinidin alene antallet af forgreninger af kapillærlignende strukturer på en koncentrationsafhængig måde, hvor den maksimale effekt nås ved 1 0 ug/ml med en reduktion på 40 procent. Interessant nok udøvede delphinidin-ladede sEV'er en kraftig reduktion af antallet af kapillære forgreninger. Delphinidin ved 0,1 ug/ml ladet i sEVs reducerede allerede antallet af forgreninger med 60 procent, og denne effekt var større end den, der blev opnået med 10 ug/mL delphinidin alene. Således var sEV-ladet delphinidin mere end 100 gange mere potent til at hæmme angiogenese end delphinidin alene.

Figur 5. In vitro angiogenese-assay. (A) Repræsentative fasekontrastmikrofotografier af rørformede strukturer i dyrket HAoEC eksponeret i 24 timer for delphinidin eller sEVs fyldt med delphinidin i forskellige koncentrationer. Forstørrelse: 40×. Fire områder fra hver brønd blev analyseret. (B) Søjlediagrammet illustrerede det signifikante fald i procentdelen af ​​forgreningspunkter efter behandling sammenlignet med PBS-behandlet (kontrol). Data er vist som gennemsnit ±SEM for seks uafhængige eksperimenter i sammenligning med kontrol: a: p<0.0001><0.0001 vs.del=""><0.0001 vs.="" del=""><0.001 vs.=""><><0.05vs.del5;g:><0.05 vs.sev=""><0.001 vs.sevdel0.5="" and=""><0.0001 vs.sevdel="">

4. Diskussion

Den aktuelle undersøgelse viser, at delphinidinen, der er indlæst i sEV'er, åbenbart var mere potent end fri delphinidin med hensyn til dets evne til at frigive endotelial NO, til at hæmme endotelproliferation og reducere kapillærlignende strukturer. Ud over delphinidin fundet i sEV'er viste analysen af ​​delphinidinmetabolitter i sEV'erne tilstedeværelsen af ​​to metabolitter (dvs.delphinidin3-O--rutinosid og peonidin-3-galactosid) til stede i delphinidinprøver. Således nedbrydes delphinidin til de samme metabolitter i sin frie form eller ved belastning i sEV'er; disse var imidlertid mere potente til at virke på endotelceller. Når det var indkapslet i sEV'er, var delphinidin (brugt som et generisk udtryk og omfattede naturlige metabolitter delphinidin 3-O-ß-rutinosid og peonidin-3-galactosid) 2-fold, {{8} }}fold og 100-fold mere potent end fri delphinidin med hensyn til endotelproliferation, endotel NO-produktion og kapillærlignende dannelse. Således udøver sEV-ladet delphinidin virkninger på forskellige trin, der fører til angiogenese. Disse resultater indikerer, at sEV'er kan betragtes som en lovende levering af delphinidin som en innovativ tilgang til målsygdomme forbundet med øget angiogenese, herunder cancer, aterosklerose og diabetiske retinopatier.

Cistanche kan forbedre immuniteten

Indkapslingen af ​​polyfenoler for at beskytte dem mod nedbrydning er et naturligt fænomen. Det er faktisk blevet vist, at planter rige på polyfenoler producerer elbiler, der bærer disse molekyler. For eksempel findes flavonoidglycosidet naringin og dets metabolit, naringenin, i grapefrugt-afledte EV'er [12]. Desuden kan nanopartikler afledt af planter bruges som vektorer for andre molekyler af interesse. Det er faktisk blevet rapporteret, at grapefrugt-afledte nanopartikler fyldt med en STAT3-hæmmer inaktiverer STAT3 i GL26-tumorceller og forbedrer overlevelsesraterne for mus [19]. En anden strategi til indkapsling af polyphenoler er at anvende vesikler afledt af pattedyrceller. En nylig rapport evaluerede den exosomale formulering af anthocyanidiner mod forskellige typer kræft [19]. sEV'er høstet fra rå bovin mælk fyldt med en blanding af cyanidin, delphinidin, petunidin, peonidin og malvidin øger den antiproliferative aktivitet af anthocyanidiner mod seks forskellige typer kræftceller via hæmningen af ​​TNFo-induceret aktivering af NF-kB [20] . Faktisk er virkningerne af sEV'er fyldt med anthocyanidiner mere effektive end dem, der opnås af frie anthocyanidiner. Denne metode har fordele; det er dog fortsat risikabelt. Faktisk kan brugen af ​​EV'er fra pattedyrsceller forårsage immunreaktioner. sEV'er afledt af umodne humane dendritiske celler inducerede ikke nogen toksicitet, og den umodne natur af dendritiske celler inducerede lav immunogenicitet [21,22]. Så vidt vi ved, er dette første gang, at en belastningseffektivitet for delphinidin i JAWS ⅡI sEVs er blevet beskrevet. Indlæsning af delphinidin i sEV'erne (9 procent) beskytter og begrænser sandsynligvis dets nedbrydning til metabolitter under de anvendte eksperimentelle forhold. De involverede mekanismer kræver yderligere undersøgelse. Metabolitterne fundet i sEV'erne, såsom delphinidin 3-O- -rutinosid eller peonidin-3-galactosid, findes også i in vivo eksperimenter med delphinidin 14,15]. Tidligere værker har rapporteret, at nedbrydningsprodukter af delphinidin har potente biologiske aktiviteter, herunder anti-cancer og anti-inflammatoriske aktiviteter [20]. Blandt phenolsyrer dannes gallussyre for det meste ved nedbrydning af delphinidin i dyrkningsmedier [23]. I denne undersøgelse fandt vi, at metabolitter påvist i sEV-ladet delphinidin var identiske med dem, der blev påvist fra fri delphinidin [18]. Selvom den nøjagtige andel af metabolitter indkapslet i disse sEV'er ikke blev bestemt, var de mere effektive på målceller end metabolitter alene. Således var delphinidin og dets metabolitter sandsynligvis mere stabile og beskyttet mod nedbrydning.

Vi har tidligere rapporteret, at delphinidin i bovine aorta-endotelceller stimulerer NO-frigivelse ved at øge intracellulær Ca2 plus koncentrationer via stigningen i superoxidaniondannelse. Dette var forbundet med øget tyrosinphosphorylering af adskillige intracellulære proteiner, hvilket resulterede i endotelafhængig vasodilatation [24,25]. Delphinidin interagerer direkte med aktivatorstedet for ER, hvilket fører til aktivering af endothelial NO-syntase, NO-produktion og endotelafhængig vasorelaxation. således ville det sandsynligvis være mere effektivt til at korrigere NO-endoteldysfunktionen forbundet med hjerte-kar-sygdomme, herunder hypertension, slagtilfælde eller metaboliske sygdomme [3].

Vi har tidligere rapporteret, at opregulering af NO-vejen ikke er ansvarlig for den antiproliferative virkning af delphinidin. Faktisk hæmmer delphinidin endotelcelleproliferation ved aktivering af ERK{{0}}/-2-vejen, hvilket fører til cellecyklusstop og akkumulering af celler i G0/G1-fasen via nedregulering af cyclin A og D1 ekspression og en opregulering af p27kip1 [6,7]. Vi fandt også, at delphinidin reducerer tumorvækst af melanomceller in vivo ved at virke specifikt på endotelcelleproliferation via inhibering af VEGFR2-signalering, MAPK, PI3K og på transkriptionsniveau på CREB/ATF1-faktorer og hæmning af phosphodiesterase 2 [9]. I den foreliggende undersøgelse var delphinidin-ladede sEV'er to gange mere potente end fri delphinidin til at hæmme endotelproliferation. Disse resultater indikerer således, at delphinidin-ladede sEV'er er en lovende tilgang til at forhindre patologier forbundet med overskydende endothelial proliferation og derfor generering af det vaskulære netværk såsom plakudvikling og stabilitet i aterosklerose og tumorudvikling i cancer.

I overensstemmelse med disse resultater viser vi, at delphinidin nedsætter kapillærlignende dannelse i en eksperimentel model for angiogenese. Interessant nok var delphinidin, når det blev indkapslet i sEV'er (selv ved belastning så lavt som 9 procent), 100-fold mere potent end frit delphinidin i faldende kapillærlignende dannelse.

Begrænsning af undersøgelsen: Det anti-angiogene potentiale, der udvises af mange naturlige forbindelser indeholdt i mange middelhavskostbestanddele, herunder delphinidin, gør dette kostmønster særligt interessant som en kilde til kemoforebyggende midler, defineret inden for angiopreventionsstrategien. Dette er for nylig blevet gennemgået af Martinez-Podeva et al. [26]. Delphinidin ser ud til at være lige så potent som andre flavonoider til at inducere anti-angiogene egenskaber. Selvom de er rigelige i kosten, absorberes anthocyaniner generelt og delphinidin i særdeleshed dårligt. En konsekvens af den ringe biotilgængelighed af anthocyaniner er, at mange effekter observeret in vitro (f.eks. hæmning af COX-2) sandsynligvis ikke vil forekomme in vivo, hvilket ikke er tilfældet for delphinidin, baseret på vores tidligere undersøgelser [{{ 5}}]. Imidlertid er yderligere undersøgelser, der anvender delphinidin indkapslet i sEV, nødvendige for at bekræfte stigningen i de anti-angiogene egenskaber af denne fremgangsmåde in vivo.

Sammenfattende øgede sEV-ladet delphinidin effektiviteten af ​​delphinidin 100-fold for proliferation, 10-fold for NO og 2-fold for kapillærlignende dannelse. Således beskyttede sEV'er enten delphinidin og dets metabolitter mod nedbrydning, eller nogle uidentificerede delphinidin-metabolitter indeholdt i sEV'erne var mere potente. Den differentielle styrke opnået for proliferation, NO-produktion og angiogenese understøtter hypotesen om, at delphinidin-ladede EV'er udøver virkninger på forskellige trin, der fører til angiogenese. Ikke desto mindre giver vi bevis for, at vi optimerede delphinidins effektivitet, sandsynligvis ved at reducere dets nedbrydning og øge dets levering, når det var indkapslet i elbiler. Delphinidin-belastede sEV'er repræsenterer således et kraftfuldt leveringssystem til at reducere angiogenese i endotelceller uden uønskede bivirkninger, idet man kender den lave biotilgængelighed af denne forbindelse. Vi understreger en innovativ terapeutisk strategi baseret på bio-konstruerede elbiler som vektorer af delphinidin for at hjælpe med at øge dets potentielle sundhedsmæssige fordel for at målrette angiogenese-relaterede sygdomme, herunder cancer, som i sidste ende kan udvides til yderligere sygdomme med overdreven vaskularisering.

Denne artikel er uddraget fra Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378 https://www.mdpi.com/journal/nutrients