Virkninger af den vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt på tarmmikrobiotaen hos mus med tarmsygdomme

Xiaowei Bao, Dongwen Bai, Xiaolu Liu, Ying Wang, Lanjun Zeng, Chenye Wei og Weiquan Jin

College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Kina

Korrespondance skal rettes til Xiaowei Bao; xiaoweibao0723@xjau.edu.cn

Modtaget 29. april 2021; Accepteret 30. juni 2021; Udgivet 14. juli 2021

Dette er en artikel med åben adgang distribueret under Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat at det originale værk er korrekt citeret.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt

Forstyrrelser i tarmens mikrobiota er forbundet med mange sygdomme. Det vandige ekstrakt fraCistanchetubulosa(CT), en traditionel kinesisk urteformel, er blevet rapporteret at spille en rolle i at beskytte den menneskelige tarm. Der er dog lidt kendt om dets virkninger på tarmmikrobiotaen. Nærværende undersøgelse blev udført for at afgøre, omCistancheTubulosavandigt ekstrakt kan modulere tarmmikrobiomet hos mus med tarmsygdomme. Vi fandt ud af, at den beskadigede tarmmorfologi som følge af behandling med cefixim kunne reddes ved hjælp afCistancheTubulosavandigt ekstrakt. Sammenligningen af ​​mikrobiel diversitet mellem mus behandlet med Cistanche Tubulosa-ekstraktet og kontrolmus indikerede også, at lidelsen i mikrobiomsamfundet af modelgrupper kunne genoprettes ved behandling med høje og mellemstore koncentrationer afCistancheTubulosavandigt ekstrakt. Behandling med cefixim førte til et signifikant fald i mælkesyrebakterier; dog supplering af deCistancheTubulosavandigt ekstrakt genvandt væksten af ​​disse mælkesyrebakterier. DesudenCistancheTubulosavandigt ekstrakt var i stand til at moderere de dramatiske ændringer i de metaboliske veje i tarmmikrobiomet induceret af cefixim. Disse resultater gav et indblik i de gavnlige virkninger af det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt på tarmmikrobiota, og de gav også en vigtig reference for udviklingen af ​​relaterede lægemidler i fremtiden.

Cistanchetubulosahar mange effekter, klik her for at vide mere

1. Introduktion

Intestinale mikroorganismer koloniserer hovedsageligt tarmens lumen og slimhindelaget og gensidigt gensidigt med værten gennem materiale- og energiudveksling, transformation og andre processer [1]. *de er signalknudepunkter, der integrerer miljøbudskaber, såsom kost, med genetiske og immunsignaler, hvilket som konsekvens påvirker værtens stofskifte, immunitet, nervesystem og respons på infektioner [2]. Normalt er der en dynamisk balance mellem tarmfloraen og værterne; tarmdysbiose kan dog resultere i ændringer i balancen mellem sundhed og sygdom, immunforstyrrelser og en lang række sygdomme [3]. Moderate ændringer i tarmmikrobiotaen er acceptable for værten; dette kan dog stadig give muligheder for at forstærke ændringerne i andre forværrende faktorer, såsom bakteriofager, bakteriociner og oxidativt stress [4].

Tidligere undersøgelser har vist, at ethanolekstraktet af Cistanche tubulosa (CT), en traditionel kinesisk urteformel, kan regulere tarmens mikrobielle sammensætning hos rotter [5], og de samlede glykosider af Cistanche Tubulosa justerede den uordnede tarmmikrobiota [6]. Cistanche-arter, som hovedsageligt snylter på rødderne af Tamarix-arter, kaldes også "ørkenens ginseng", og en tonic bestående af stænglerne af Cistanche deserticola (CD) og Cistanche tubulosa (CT) bruges som urtemiddel [7 ]. De vigtigste kemiske komponenter i Cistanche Tubulosa phenylethanolglycosider (PHG'er), som er antioxidantstoffer [8, 9], blev fundet at forbedre reproduktiv dysfunktion [10], undertrykke leverstjernecelleaktivering, blokere ledningen af ​​signalveje i TGF{{6 }}/SMAD [11], og forhindre bovint serumalbumin-induceret leverfibrose hos rotter [12]. Blandt mere end 100 komponenter i Cistanche Tubulosa er polysaccharidet også et af de vigtige stoffer med rigeligt indhold [13, 14]. Tidligere undersøgelser har vist, at C. deserticola-polysaccharider inducerer melanogenese i melanocytter, reducerer oxidativt stress[15], lindrer kognitiv dysfunktion ved at regulere antioxidant- og antiinflammatoriske processer i rotter [16], beskytter PC12-celler mod OGD/RP-induceret skade [17] , forbedre echinacosid-absorptionen in vivo og påvirke tarmmikrobiotaen [18].

Probiotika er levende ikke-patogene mikroorganismer, som har sundhedsmæssige fordele og giver mikrobiel balance i mave-tarmkanalen, når de administreres i passende mængder [19]. *ey kan forstærke ikke-specifikke cellulære immunresponser karakteriseret ved aktivering af makrofager, naturlige dræberceller (NK) og antigenspecificitet over for toksiske T-lymfocytter og frigivelsen af ​​forskellige cytokiner på en stammespecifik og dosisafhængig måde [20 ]. Probiotiske stammer forbedrer tarmepitelets egenskaber via TJ-modulering, og specifikke probiotiske stammer er blevet påvist at regulere mucinekspression og derved påvirke slimlagets egenskaber og indirekte regulere tarmens immunsystem [21]. Stammer af mælkesyrebakterier (LAB) og Bifidobacterium er vigtige probiotika, der er blevet brugt på mange områder [22-26]. Deres sundhedsmæssige fordele er talrige, idet deres antioxidantkapacitet er en vigtig faktor i deres sundhedsrelaterede funktioner[27]. Probiotika kan chelatere metalioner for at forhindre dem i at katalysere oxidation [28, 29]; de kan også øge ekspressionen af ​​antioxidantenzymer [30, 31], producere forskellige metabolitter med antioxidantaktivitet [32, 33], mediere antioxidantsignalveje [34-36] og regulere enzymerne, der producerer reaktive oxygenarter (ROS) og tarmmikroorganismers respons på oxidativt stress[37].

cistanche blomst

En nylig undersøgelse viste, at polysacchariderne i Cistanche Deserticola kunne stimulere væksten af ​​nogle mælkesyrebakterier, hvilket kunne gavne menneskers sundhed [38]. Indholdet af polysaccharider i Cistanche Deserticola er dog anderledes end i Cistanche Tubulosa [7, 39], og denne forskel kan føre til forskellige effekter på tarmmikroorganismer. Selvom Cistanche Deserticola-polysaccharider kan reducere oxidativt stress ved at aktivere NRF2/HO-1-vejen [15], kan virkningerne af et enkelt polysaccharid afvige fra den samlede effekt af flere sammensætninger i Cistanche Tubulosa. Det er således nødvendigt at præcist definere virkningerne af Cistanche Tubulosa vandige ekstrakter på tarmmikroorganismer. Derudover kan PHG'er også modstå oxidativt stress [40] og undertrykke lipopolysaccharid-medierede inflammatoriske reaktioner ved at aktivere theKeap1/Nrf2/HO-1-vejen [41]. Derfor er det af stor værdi at bestemme effekten af ​​det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt. Desuden tyder virkningerne af visse bestanddele af det vandige Cistanche Deserticola-ekstrakt på oxidativt stress og tarmflora, at modstanden mod oxidativt stress kan være korreleret med tarmfloraændringer.

For at udfylde hullerne i viden om ovennævnte emner, undersøgte vi virkningerne af Cistanche Tubulosa vandige ekstrakt på tarmmikrobiotaen hos mus med tarmfloraforstyrrelser. Disse resultater vil give værdifuld information om de mulige mekanismer, hvorigennem Cistanche Tubulosa ændrer tarmfloraen og giver tarmresistens over for oxidativt stress.

2. Materialer og metoder

2.1. Forsøgsdyr.

I alt 18 SPF-klasse C57BL/6J hanmus, der vejede 18-22 g, blev købt fra Experimental Animal Center ved Xinjiang Medical University med licensnummer SCXK (nyt) 2018-0003. De blev anbragt i bure under standardiserede forhold: 12 timers lys/mørke fotoperiode, en temperatur på 23 ± 2 grader og en luftfugtighed på 55 ± 5 procent. *e dyr blev fodret med en kommerciel diæt (51 procent nitrogenfrit ekstrakt, 25 procent råprotein, 4,6 procent råfedt, 6,5 procent råaske, 4,0 procent råfibre og 8,9 procent fugt) og postevand . *e dyr blev behandlet i henhold til anbefalingerne beskrevet i vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health.

2.2. Ekstraktion af den vandige ekstrakt.

Tørrede skiver af C. tubulosa, leveret af Hotan Dichen PharmaceuticalBiotechnology Co., Ltd., blev formalet til pulver, og granulat med partikelstørrelser mellem 20 og 40 masker blev udvalgt. Ekstraktionsbetingelserne var som følger: faststof-væske-forhold på 1:19, temperaturen på 80 grader, mikrobølgetid på 6 minutter, ultralydstid på 16 minutter, mikrobølgeeffekt på 400 W og ultralydseffekt på 400 W. Indholdet af hovedkomponenterne i det vandige ekstrakt blev målt ved HPLC (Agilent 1260 Infinity II, Californien, USA). Kort fortalt blev standardstofferne echinacosid (0,2 mg/ml) og acteosid (0,2 mg/ml) opløst i 50 procent methanol for at tjene som referencestofopløsning. Derefter blev 1 g af den vandige CT-ekstrakt opløst i 100 ml 50% methanol og henstillet i 30 minutter. Ekstraktopløsningen blev behandlet med ultralyd ved 250 W og 35 kHz i 10 minutter og efterfølgende centrifugeret ved 12, 000 rpm/min. Supernatanten blev infiltreret af en 0,45 μm mikroporøs filtermembran. Referencestofopløsningen og filtratet blev derefter detekteret ved HPLC under følgende betingelser: octadecylsilan-bundet silicagel som fyldstof, methanol som mobil fase A og 0,1 procent myresyre som mobil fase B. Søjlens temperatur blev indstillet til 30 °C grad blev detektionsbølgelængden indstillet til 330 nm, og injektionsvolumenet var 10 μL.

2.3. Eksperimenter.

Efter en uges tilpasning blev de 18 mus tilfældigt opdelt i seks grupper: A (normal med middeldosis Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt tilsat), B (normal uden Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt), C (model uden det vandige ekstrakt), D (model med højdosis Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt tilføjet), E (model med middeldosis Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt tilføjet) og F (model med lavdosis Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt tilføjet). Grupperne blev behandlet som følger: den normale gruppe blev gennemblødt med normal saltvandsopløsning, modelgruppen blev gennemblødt med cefixim (30 mg/kg, Shiyao Group OuyiPharmaceutical Co., Ltd., Shijiazhuang, Kina) og normal saltvandsopløsning, den høje -dosisgruppen blev gennemblødt med cefixim og 221,14 mg/kg af det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt, middeldosisgruppen blev gennemblødt med cefixim og 165,54 mg/kg af det vandige ekstrakt, og lavdosisgruppen blev gennemblødt med cefixim og 110. mg/kg af den vandige ekstrakt. A-gruppen blev overhældt med 165,54 mg/kg vandig ekstrakt, og der blev ikke tilsat cefixim. Cefixim blev administreret dagligt kl. 12:00 timer, og andre stoffer blev administreret dagligt kl. 15:00 timer. Under eksperimenterne blev C-, D-, E- og F-grupperne holdt i modeltilstanden for tarmsygdomme. *e afføring blev opsamlet hver syvende dag på et sterilt operationsbord og opbevaret ved -20 grader.

2.4. Histopatologisk observation af musens tyktarm.

Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev musene dræbt ved cervikal dislokation, og deres kolonindhold blev opsamlet på et sterilt operationsbord og opbevaret ved -80 grader; samtidig blev tyktarmsvævsprøver fikseret i 10 procent neutral formalin. Derefter blev prøverne dehydreret under anvendelse af gradientkoncentration af ethanol, hyaliniseret under anvendelse af xylen, indlejret i paraffin, sektioneret og farvet med hæmatoxylin-eosin. Morfologiske ændringer i tyktarmsslimhinden blev observeret og sammenlignet med et optisk mikroskop. Villus længde og krypt dybde i tyktarmen blev målt, og forholdet mellem villus længde og krypt dybde (V/C værdi) blev beregnet (51).

2.5. DNA-udvinding og bibliotekskonstruktion. DNA blev ekstraheret fra fæces ved hjælp af EZNA ® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) i henhold til producentens protokol. DNA-kvaliteten blev bestemt ved hjælp af et fluorometer (QuantiFluor™-ST, Promega Corporation, USA). Parrede primere i V3-V4-regionen af ​​16s rDNA blev designet til at amplificere regionen og producere 466 bp DNA-fragmenter. *e fremadgående primer var 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-), og den omvendte primer var 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Hver PCR-volumen var 25 μL, indeholdende 2,5 μL 10 × PCR-buffer, 2 μL dNTP'er, 1 μL af hver primer og 20-30 ng template-DNA. *da, de indekserede adaptere blev fastgjort til enden af ​​amplikonerne for at generere sekventeringsbiblioteker. Bibliotekerne blev valideret ved anvendelse af et QuantiFluor™ fluorometer og kvantificeret til 10 nmol.

acteosid i cistanche kan booste immunsystemet

2.6. 16s rRNA-gensekventering og mikrobiel fællesskabsanalyse.

Illumina-platformen (Illumina MiSeq) blev brugt til at opnå 2 × 250 bp parrede data. Operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) blev opnået ved hjælp af Uparse-software gennem standardklynger med 97 procent lighed. Den naive Bayesianske tildelingsalgoritme for RDP-klassifikatoren blev brugt til at justere OTU'erne med Greengene-databasen Release 13.5 og udføre artsannotering. Alfa-diversiteten af ​​tarmmikrobiota blev beregnet ved hjælp af Shannon- og Simpson-indeksene, og forskellene mellem grupperne blev analyseret ved lineær diskriminantanalyse Effektstørrelse (LEfSe). Beta-diversiteten blev analyseret ved principiel koordinatanalyse (PCoA) af Brady-Curtis-uligheder. PICRUST2 blev brugt til at estimere den mikrobielle metaboliske kapacitet af tarmmikrobiomet [42].

2.7. Statistisk dataanalyse.

SPSS 20 blev brugt til envejs ANOVA, og de eksperimentelle data blev udtrykt som X ± S; X angiver gennemsnitsværdien, og S angiver standardafvigelsen.

3. Resultater

3.1. Virkningen af ​​det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt på kolonmorfologi.

De repræsentative forbindelser (echinacosid og acteosid) og deres koncentrationer af Cistanche Tubulosa-ekstraktet blev valideret ved HPLC (figur S1). For at bestemme virkningen af ​​det vandige ekstrakt på tarmen undersøgte vi længden af ​​colon villi og dybden af ​​fordybninger efter behandlingen med det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt. Colon villi i normal- og højdosisgrupperne (A, B og D) var længere og fingerlignende, hvorimod colonvilli i model- og lavdosisgrupperne (C og F) var korte, og spidserne af tyktarmen villi var brudt (figur 1). Derfor øgede højdosis vandig Cistanche Tubulosa-ekstrakt signifikant længden af ​​colon villi og reducerede fordybningsdybden hos mus med tarmsygdomme sammenlignet med musene i modelgruppen (P < 0.01).="" i="" modsætning="" hertil="" var="" fordybningsdybden="" ikke="" signifikant="" forskellig="" mellem="" højdosisgruppen="" og="" den="" normale="" gruppe="" (p=""> 0,05) (tabel S1). Disse resultater indikerede, at den høje dosis af det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt kan forbedre morfologien inde i tyktarmen hos mus med tarmsygdomme.

3.2. Virkningen af ​​det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt på mangfoldigheden af ​​tarmmikrobiota.

Vi udførte 16s rRNA-gensekventering for at undersøge den potentielle årsag til de morfologiske ændringer inde i tyktarmen og undersøge ændringerne i tarmmikrobiota efter behandling med det vandige CT-ekstrakt. Et gennemsnit på 100.553 effektive tags, der spænder fra 77.734 til 125.144, blev opnået fra rådataene (tabel S2). Disse tags blev grupperet i 4932 OTU'er (tabel S3). Vi analyserede derefter mangfoldigheden af ​​tarmmikrobiota baseret på Theseus. Shannon- og Simpson-indekserne viste ingen forskel mellem A-gruppen (normal med det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt) og B-gruppen (normalt uden det vandige CT-ekstrakt) (figur 2(a)). *indikeres, at hos musene uden cefixim-behandlingen, kan det vandige CT-ekstrakt ikke have haft yderligere gavnlige eller skadelige virkninger på tarmmikrobiotaens mangfoldighed. Men -diversiteten i modelgruppen (C) viste en faldende tendens sammenlignet med den i normalgrupperne. *e mus behandlet med høj- og mellemdosis vandige CT-ekstrakter viste tegn på -diversitetsgenvinding, hvorimod et sådant fænomen ikke blev observeret hos mus behandlet med lavdosis CT-vandekstrakt (figur 2(a)). I mellemtiden afslørede PCoA, at de normale grupper (A og B) og tarmlidelser gruppeadministreret højdosis (D) og middeldosis (E) CTaqueous-ekstrakter havde en tendens til at have kortere interprøveafstande end dem i modelgruppen og i lavdosis CTaqueous extract supplement group (F) (figur 2(b)). Disse resultater indikerede, at det vandige CT-ekstrakt kunne hjælpe med at forbedre mangfoldigheden af ​​tarmmikrobiotaen hos mus med tarmsygdomme.

3.3. Ændringer i sammensætningen af ​​tarmmikrobiota behandlet med Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt.

Mikrobiotasammensætningsprofilerne blev sammenlignet mellem forskellige grupper. På phylum-niveau var den relative overflod af proteobakterier i modelgruppen højere end i de andre grupper (figur 3(a)). Stigningen i Proteobacteria antydede, at mikrobiomet af modelmus blev ændret af cefixim, og at det vandige CT-ekstrakt kunne gavne tarmmikrobiotaen, da den øgede forekomst af Proteobacteria er en hub-markør for forstyrret tarmflora [43-45]. Derudover faldt den relative mængde af Lactobacillus i modelgruppen på slægtsniveau sammenlignet med den i normal- og højdosisgrupperne; den steg dog sammenlignet med den i middel- og lavdosisgruppen (figur 3(b)). Disse resultater indikerede, at den højdosis CTaqueous ekstrakt kunne fremme væksten af ​​nogle bakterier fra slægten Lactobacillus.

Differentiel mikrobiota mellem de undersøgte grupper blev yderligere bestemt i henhold til LEfSe-analysen. Denne analyse viste, at efter behandlingen med cefixim steg de relative mængder af Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales og Chloroflflexi signifikant, hvorimod de relative forekomster af lactobacillus, Eubacterium_nodatum_gruppe, Pseudo-gruppe, cardiales og Christensenellaceae_R-7_gruppen faldt signifikant sammenlignet med dem i den normale gruppe (Figur 4(a)). Påfaldende nok, når modelgruppen blev suppleret med højdosis CT-vandekstrakt, var de relative mængder af Muribaculaceae, Lactobacillus, Kineosporiaceae, Eubacterium no datum group og Pedobacter signifikant øget sammenlignet med dem i modelgruppen. I mellemtiden faldt de relative forekomster af Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 og Candidatus Stoquefifichus signifikant sammenlignet med dem i modelgruppen (Figur 4(b)).

3.4. Funktioner af tarmmikrobiotaen relateret til behandlingen med Cistanche Tubulosa vandig ekstrakt.

Vi brugte PICRUST2-software til at forudsige de metaboliske veje i tarmmikrobiotaen, og den normale gruppe blev brugt som reference til at analysere ændringerne i andre grupper. Under cefiximbehandlingen steg den relative overflod af ethylbenzennedbrydning, biosyntese af sideroforgruppe-nonribosomale peptider og metabolisme af xenobiotika ved cytokrom P450-veje; efter behandlingen med høj- og mellemdosis Cistanche Tubulosa vandige ekstrakter vendte deres relative mængde tilbage til normale niveauer. I mellemtiden faldt den relative overflod af cyanoaminosyremetabolismevejen under cefiximbehandlingen; den steg dog efter behandlingen med den højdosis CT-vandekstrakt. Endvidere var ændringerne i forskellige metabolitveje efter behandlingen med cefixim generelt signifikante sammenlignet med dem i den normale gruppe; tilsætningen af ​​det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt var imidlertid i stand til at forhindre for store ændringer (figur 5).

4. Diskussion

Kolonmorfologi kan ændres af vækst, fordøjelse og absorption, immunregulering og reparation af tarmskade[46-50]. V/C-forholdet kan udførligt afspejle fordøjelsestilstanden i tarmkanalen og er direkte proportional med tarmkanalens fordøjelses- og absorptionskapacitet [51, 52]. I denne undersøgelse viste villi og recessusbiopsi og statistiske data, at det højdosis vandige ekstrakt delvist kunne forbedre den defekte morfologi inde i tyktarmen. For at undersøge, hvordan det vandige ekstrakt ændrer tarmmorfologi og påvirker tarmmikrobiota, arbejdede vi baglæns fra ændringer i tarmfloraen. Vi fandt, at den relative overflod af Proteobacteria, en hub-markør for forstyrret tarmflora, steg under behandlingen med cefixim sammenlignet med den uden cefixim-behandling.*e relative mængder af andre hub-markører, Bacteroidetes og Firmicutes, havde ingen signifikante ændringer, selvom disse antioxidantaktiviteter in vitro [56] og kan fremme væksten af ​​nogle mælkesyrebakterier, hvilket kunne gavne værtens sundhed [43]. Parallelt hermed er Muribaculaceae probiotiske organismer forbundet med lang levetid [57]. Disse antydede, at den mekanisme, hvorved det vandige CT-ekstrakt forbedrer tarmmikrobiotaen, kan være fremme eller beskyttelse af væksten af ​​probiotiske organismer. En anden bakterie, der er værd at bemærke, var bakterien YE57. Selvom den højdosis CTaqueous ekstrakt fremmede den relative overflod af bakterien YE57 i den foreliggende undersøgelse (figur 4), har tidligere undersøgelser fundet, at dens overflod var højere i den normale tarm end i tarmen behandlet med højkoncentreret urtete-rester [ 58] og at dens overflod blev reduceret efter interventionen med Bacillus licheniformis kombineret med XOS(xylooligosaccharider) [59]. Derfor fortjener denne bakteries rolle i tarmmikrobiotaen yderligere undersøgelse. Desuden kan det relativt lille prøveantal i denne undersøgelse forårsage et mål for falsk positive og falsk negative, og fremtidig undersøgelse af større prøver foreslås for at validere de identificerede bakteriemarkører.

Cistanche Tubulosa vandig ekstraktsammensætning kan være vigtig for dens virkninger på sammensætningen og funktionelle ændringer i tarmmikrobiotaen hos mus med tarmsygdomme.PHG'er er almindelige aktive komponenter, der findes i Cistanche Deserticola og Cistacnche Tubulosa, og echinacosid blev identificeret som den vigtigste PNG i Cistache Tubulosa [60]. I de sidste årtier har echinacosid vist sig at have mange farmakologiske aktiviteter, såsom antialdring og neurobeskyttende virkninger, forbedring af hjertefunktionen, reduktion af hyperlipidæmi og hyperglykæmi og forebyggelse af fedme-induceret diabetes og metabolisk syndrom [53, 61-65] . Faktisk opdagede vi ændringer i de metaboliske veje i tarmmikrobiotaen.*e-behandling af cefixim førte til berigelse af bakterier relateret til ethylbenzen-nedbrydning og biosyntese af sideroforgruppe-nonribosomale peptider, mens behandlingerne med høj- og mellemdosis Cistanche Tubulosa vandigt ekstrakt kunne lindre disse ændringer, hvilket indikerer, at dette ekstrakt modererede bakteriesamfundet relateret til disse funktioner. Derudover indikerede den øgede bakterielle berigelse relateret til cyanoaminosyremetabolismevejen under behandlingen med det højdosis vandige ekstrakt og dens nedsatte berigelse i modelmus, at Cistanche Tubulosa-ekstraktet kan fremme metabolismen af ​​cyanoaminosyre. *Ændringer i relevante metabolitter kan give dette vandige ekstrakt farmakologiske aktiviteter.

cistanche urt

Selvom mekanismen, hvorved det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt ændrer sammensætningen og funktionen af ​​tarmmikrobiota, er kompleks, er der nogle spor til at spekulere om den potentielle mekanisme. Det er blevet rapporteret, at både mælkesyrebakterier og vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakter kan modvirke oxidativt stress. Oxidativ stress, der opstår under betændelse, er en fælles faktor, der forværrer tarmsygdomme ved kraftigt at reducere tarmens mikrobielle diversitet og fremme stigningen af ​​specifikke bakterier (4). Tværtimod fremmer reaktive oxygenarter også den selektive vækst af bakteriegrupper gennem nitrat- og tetrathionatrespiration [66-68]; fx kan bakterier fra familien Enterobacteriaceae vokse hurtigt som følge af ændringer i sammensætningen af ​​tarmfloraen under oxidative forhold under inflammation [69, 70]. De fleste levende organismer udvikler enzymatiske forsvar, ikke-enzymatiske antioxidantforsvar og reparationsmekanismer for at opfange iltradikaler [71]. Disse native antioxidantsystemer er imidlertid generelt ikke tilstrækkelige til at forhindre oxidativ skade i levende organismer. Adskillige yderligere syntetiske antioxidanter, herunder butyleret hydroxyanisol og butyleret hydroxytoluen, er blevet brugt i vid udstrækning til at reducere oxidation, men deres sikkerhed er blevet sat i tvivl [72, 73]. Derfor har forskere vendt sig mod at finde sikrere og mere naturlige antioxidanter opnået fra naturligt forekommende stoffer. På grund af både polysacchariders og mælkesyrebakteriers evne til at eliminere oxidativt stress, kræver bestemmelse af den præcise antioxidative mekanisme af Cistanche Tubulosa vandige ekstrakter på tarmmikrobiotaen yderligere undersøgelser i fremtiden.

Som konklusion fandt vi, at det vandige Cistanche Tubulosa-ekstrakt var i stand til at forbedre tarmmikrobiota hos mus med tarmsygdomme ved at fremme diversitet, moderere de metaboliske ændringer og ombygge strukturen af ​​tarmmikrobiota, og disse resultater kan give en reference for udviklingen. af relaterede lægemidler i fremtiden.

Datatilgængelighed

Statistikken over de operationelle taksonomiske enheder blandt hver prøvedata, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i de supplerende informationsfiler, og 16s rRNA-sekventeringsdataene, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, vil blive frigivet ved offentliggørelse.

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelser

Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af tilskud fra Kinas National Natural Science Foundation (81860766).

Supplerende materialer

Figur S1: HPLC-detektion af det vandige Cistanche tubulosa-ekstrakt. (a) Toppen af ​​echinacosid og acteosid i referencematerialet vises ved 5,066 min og 9,988 min separat. (b) *toppen af ​​echinacosid og acteosid i det vandige ekstrakt vises ved 5,097 min og 10,076 min separat, og koncentrationerne er 236 mg/g og 12,7 mg/g separat. Tabel S1: længden af ​​kolon villi og dybden af ​​fordybninger. Tabel S2: Statistisk information om 16S rRNA-sekventeringsdata. Tabel S3: statistik over de operationelle taksonomiske enheder blandt hver prøve. (supplerende materiale).

Referencer

[1] A. Heintz-Butchart og P. Wilmes, "Human gut microbiome: function matters," Trends in Microbiology, vol. 26, nr. 7, s. 563-574, 2018.

[2] CA Thaiss, N. Zmora, M. Levy og E. Elinav, "Mikrobiomet og medfødt immunitet," Nature, vol. 535, nr. 7610, s. 65-74, 2016.

[3] G. Quaranta, M. Sanguinetti og L. Masucci, "Fækal mikrobiotatransplantation: et potentielt værktøj til behandling af humane kvindelige forplantningsorganer," Frontiers in Immunology, vol. 10, s. 2653, 2019.

[4] GA Weiss og T. Hennet, "Mekanismer og konsekvenser af intestinal dysbiose," Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 74, nr. 16, s. 2959-2977, 2017.

[5] Y. Li, Y. Peng, P. Ma et al., "Antidepressiv-lignende virkninger af Cistanche tubulosa ekstrakt på kroniske uforudsigelige stressrotter gennem restaurering af tarmmikrobiota homeostase," Frontiers in Pharmacology, vol. 9, s. 967, 2018.

[6] L. Fan, Y. Peng, J. Wang, P. Ma, L. Zhao og X. Li, "Totalglykosider fra stængler af Cistanche tubulosa lindrer depressionslignende adfærd: tovejs interaktion mellem fytokemikalier og tarmmikrobiota, "Phytomedicine, vol. 83, artikel-id 153471, 2021.

[7] Y. Li, Y. Peng, M. Wang, P. Tu og X. Li, "Human gastrointestinal metabolisme af cistanche herba vandekstrakt invitro: belysning af den metaboliske profil baseret på omfattende metabolitidentifikation i mavesaft, intestinal juice, humane tarmbakterier og intestinale mikrosomer," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 65, nr. 34, s. 7447-7456, 2017.

[8] H. Wang, Y. Sun, W.-C. Ye et al., "Antioxidative phenylethanoid and phenolic glycosides from Picrorhiza Scrophularia flora," Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 52, nr. 5, s. 615-617, 2004.

[9] S.-L. Ji, K.-K. Cao, X.-X. Zhao et al., "Antioxidant aktivitet af phenylethanoid glycosider på glutamat-induceret neurotoksicitet," Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol. 83, nr. 11, s. 2016-2026, 2019.

[10] Q. Wang, J. Dong, W. Lu et al., "Phenylethanolglycosider fra Cistanche tubulosa forbedrede reproduktiv dysfunktion ved at regulere testikelsteroider gennem CYP450-3 -HSDpathway," Journal of Ethnopharmacology, vol. 251, artikel ID112500, 2020.

[11] S.-P. Dig, L. Ma, J. Zhao, S.-L. Zhang og T. Liu, "Phenylethanolglycosider fra Cistanche tubulosa undertrykker aktivering af leverstjerneceller og blokerer ledningen af ​​signalveje i TGF- 1/smad som potentielle antihepatiske fibrosemidler," Molecules, vol. 21, nr. 1, s. 102, 2016.

[12] S.-P. Du, J. Zhao, L. Ma, M. Tudimat, S.-L. Zhang og T. Liu, "Forebyggende virkninger af phenylethanoidglycosider fra Cistanche tubulosa på bovint serumalbumin-induceret hepatisk fibrose hos rotter," DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 23, nr. 1, s. 52, 2015.

[13] T. Morikawa, H. Xie, Y. Pan, et al., "En gennemgang af biologisk aktive naturlige produkter fra en ørkenplante Cistanche tubulosa," Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 67, nr. 7, s. 675-689, 2019.

[14] J. Li, J. Li, A. Aspire, et al., "Phenylethanoidglykosider fra Cistanche tubulosa hæmmer væksten af ​​B16-F10-celler både in vitro og in vivo ved induktion af apoptose via mitokondrie- afhængig vej," Journal of Cancer, vol. 7, nr. 13, s. 1877-1887, 2016.

[15] Y. Hu, J. Huang, Y. Li et al., "Cistanche deserticola polysaccharide inducerer melanogenese i melanocytter og reducerer oxidativ stress via aktiverende NRF2/HO-1-vej," Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 24, nr. 7, s. 4023-4035, 2020.

[16] S. Peng, P. Li, P. Liu, et al., "Cistanches lindrer sevofluran-induceret kognitiv dysfunktion ved at regulere PPAR-c-afhængig antioxidant og anti-inflammatorisk i rotter," Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 24, nr. 2, s. 1345-1359, 2020.

[17] Y. Liu, H. Wang, M. Yang, et al., "Cistanche deserticola polysaccharides beskytter PC12-celler mod OGD/RP-induceret skade," Biomedicine & Pharmacotherapy, vol. 99, s. 671-680,2018.

[18] Z. Fu, L. Han, P. Zhang, et al., "Cistanche-polysaccharider øger echinacoside-absorptionen in vivo og påvirker tarmmikrobiotaen," International Journal of Biological Macromolecules, vol. 149, s. 732-740, 2020.

[19] NT Williams, "Probiotics," American Journal of Health-System Pharmacy, vol. 67, nr. 6, s. 449-458, 2010.

[20] R. Ashraf og NP Shah, "Immunsystemstimulering af probiotiske mikroorganismer," Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 54, nr. 7, s. 938-956, 2014.

[21] G. La Fata, P. Weber og MH Mohajeri, "Probiotika og tarmens immunsystem: indirekte regulering," Probiotika og antimikrobielle proteiner, vol. 10, nr. 1, s. 11-21, 2018.

[22] MA Zocco, LZ dal Verme, F. Cremonini, et al., "Effektivitet af lactobacillus GG til at opretholde remission af ulcerøs colitis," Alimentary Pharmacology and 8erapeutics, vol. 23, nr. 11, s. 1567-1574, 2006.

[23] MJ Saez-Lara, C. Gomez-Llorente, J. Plaza-Diaz og A. Gil,"*e rolle af probiotiske mælkesyrebakterier og bifidobakterier i forebyggelsen og behandlingen af ​​inflammatorisk tarmsygdom og andre relaterede sygdomme: en systematisk gennemgang af randomiserede humane kliniske forsøg," BioMed Research International, vol. 2015, artikel-id 505878, 15 sider, 2015.

[24] MAO Dawood, S. Koshio, M. Ishikawa, et al., "Effekter af kosttilskud af Lactobacillus rhamnosus eller/og lactococcus lactis på væksten, tarmmikrobiotaen og immunreaktionerne af rød havbrasen, Pagrus major," Fish. & ShellfishImmunology, vol. 49, s. 275-285, 2016.

[25] A. Sivan, L. Corrales, N. Hubert, et al., "Kommensal bifidobacterium fremmer antitumorimmunitet og letter anti-PD-L1-effektivitet," Science, vol. 350, nr. 6264, s. 1084-1089,2015.

[26] PJ Whorwell, L. Altringer, J. Morel, et al., "Effektiviteten af ​​et indkapslet probiotisk Bifidobacterium spædbarn er 35624 hos kvinder med irritabel tyktarm," 8e American Journal of Gastroenterology, vol. 101, nr. 7, s. 1581-1590, 2006.

[27] Y. Wang, Y. Wu, Y. Wang et al., "Antioxidant properties of probiotic bacteria," Nutrients, vol. 9, nr. 5, s. 521, 2017.

[28] JMC Gutteridge, R. Richmond og B. Halliwell, "Inhibering af den jernkatalyserede dannelse af hydroxylradikaler fra superoxid og af lipidperoxidation af desferrioxamin," Biochemical Journal, vol. 184, nr. 2, s. 469-472, 1979.

[29] E. Deriu, JZ Liu, M. Pezeshki, et al., "Probiotiske bakterier reducerer salmonella Typhimurium intestinal kolonisering ved at konkurrere om jern," Cell Host & Microbe, vol. 14, nr. 1, s. 26-37, 2013.

[30] T. Kullisaar, M. Zilmer, M. Mikelsaar, et al., "To antioxidative lactobacilli-stammer som lovende probiotika," International Journal of Food Microbiology, vol. 72, nr. 3, s. 215-224, 2002.

[31] JG LeBlanc, S. del Carmen, A. Miyoshi, et al., "Brug af superoxiddismutase og katalaseproducerende mælkesyrebakterier i TNBS-induceret Crohns sygdom hos mus," Journal of Biotechnology, vol. 151, nr. 3, s. 287-293, 2011.

[32] M. Rossi, A. Amaretti og S. Raimondi, "Folatproduktion af probiotiske bakterier," Nutrients, vol. 3, nr. 1, s. 118-134,2011.

[33] A. Pompei, L. Cordisco, A. Amaretti, et al., "Administration af folatproducerende bifidobakterier forbedrer folatstatus hos Wistar-rotter," 8e Journal of Nutrition, vol. 137, nr. 12, s. 2742-2746, 2007.

[34] L.-X. Wang, K. Liu, DW Gao og JK Hao, "Beskyttende virkninger af to Lactobacillus Plantarum-stammer i hyperlipidæmiske mus," World Journal of Gastroenterology, vol. 19, nr. 20, s. 3150-3156, 2013.

[35] EO Petrof, K. Kojima, MJ Ropeleski, et al., "Probiotika inhiberer nuklear faktor-KB og inducerer varmechokproteiner i colonepitelceller gennem proteasomhæmning," Gastroenterology, vol. 127, nr. 5, s. 1474-1487, 2004.

[36] A. Seth, F. Yan, DB Polk og RK Rao, "Probiotika forbedrer den hydrogenperoxid-inducerede epitelbarriere-afbrydelse ved en PKC- og MAP-kinaseafhængig mekanisme," American Journal of Physiology-Gastrointestinal and lever Physiology , bind. 294, nr. 4, s. G1060–G1069, 2008.

[37] M. G'omezGuzm'an, M. Toral, M. Romero, et al., "Antihypertensive virkninger af probiotika Lactobacillus-stammer i spontant hypertensive rotter," Molecular Nutrition & FoodResearch, vol. 59, nr. 11, s. 2326-2336, 2015.

[38] H. Zeng, L. Huang, L. Zhou, P. Wang, X. Chen og K. Ding, "En galactoglucan isoleret fra Cistanchedeserticola YC Ma. og dens bioaktivitet på tarmbakteriestammer," Carbohydrate Polymers, vol. 223, artikel-id 115038, 2019.

[39] S. Zheng, X. Jiang, L. Wu, Z. Wang og L. Huang, "Kemisk og genetisk diskrimination af cistanche herba baseret på UPC-QTOF/MS og DNA-stregkodning," PLoS One, vol. 9, nr. 5, artikel-id e98061, 2014.

[40] M. Li, T. Xu, F. Zhou, et al., "Neurobeskyttende virkninger af fire phenylethanoidglycosider på H2O2-induceret apoptose på PC12-celler via Nrf2/ARE-vejen," International Journal of Molecular Sciences , bind. 19, nr. 4, s. 1135, 2018.

[41] A. Wu, Z. Yang, Y. Huang, et al., "Naturlige phenylethanoidglycosider isoleret fra Callicarpa kwangtungensis undertrykte lipopolysaccharid-medieret inflammatorisk respons via aktiverende Keap1/Nrf2/HO-1-vej i RAW 264. macrophages cell," Journal of Ethnopharmacology, vol. 258, artikel-id 112857, 2020.

[42] GM Douglas, VJ Maffffei, JR Zaneveld, et al., "PICRUSt2for forudsigelse af metagenomfunktioner," Nature Biotechnology, vol. 38, nr. 6, s. 685-688, 2020.

[43] H.-L. Li, L. Lu, X.-S. Wang et al., "Ændring af tarmmikrobiota og inflammatoriske cytokin-/kemokinprofiler i 5-fluorouracil-induceret tarmslimhindebetændelse," Frontiers in Cellular and infektion Microbiology, vol. 7, s. 455, 2017.

[44] M. Pammi, J. Cope, PI Tarr, et al., "Tarmdysbiose hos præmature spædbørn forud for nekrotiserende enterocolitis: en systematisk gennemgang og meta-analyse," Microbiome, vol. 5, nr. 1, s. 31, 2017.

[45] N.-R. Shin, TW When og J.-W. Bae, "Proteobacteria: microbial signature of dysbiose in gut microbiota," Trends in Biotechnology, vol. 33, nr. 9, s. 496-503, 2015.

[46] M. de Oliveira Bel'em, CP Cirilo, AP de Santi-Rampazzo et al., "Tarmmorfologiske justeringer forårsaget af diætrestriktioner forbedrer ernæringsstatus under ældningsprocessen for rotter," Experimental Gerontology, vol. 69, s. 85-93,2015.

[47] B. Potsic, N. Holliday, P. Lewis, D. Samuelson, V. DeMarco og J. Neu, "Glutamintilskud og -deprivation: effekt på kunstigt opdrættet rotte tyndtarmsmorfologi," Pediatric Research, vol. 52, nr. 3, s. 430-436, 2002.

[48] ​​JL Daniels, RJ Bloomer, M. van der Merwe, SL Davis, KK Buddington og RK Buddington, "Tarmtilpasninger til en kombination af forskellige diæter med og uden udholdenhedstræning," Journal of the International Society of Sports Nutrition, vol. 13, nr. 1, s. 35, 2016.

[49] L. Muñoz, MJ Borrero, M. 'Ubeda et al., "Tarmimmundysregulering drevet af dysbiose fremmer barriereforstyrrelser og bakteriel translokation hos rotter med cirrhose," Hepatology, vol. 70, nr. 3, s. 925-938, 2019.

[50] X. Li, Y. Wu, Z. Xu et al., "Effekter af hetiao Jianping afkog på tarmskade og reparation hos rotter med antibiotika-associeret diarré," Medical Science Monitor, vol. 26, artikel IDe921745, 2020.

[51] Y. Xie, F. Ding, W. Di et al., "Indvirkningen af ​​en kost med højt fedtindhold på intestinale stamceller og epitelbarrierefunktion hos midaldrende hunmus," Molecular Medicine Reports, vol. 21, nr. 3, s. 1133-1144, 2020.

[52] BL Bivolarski og EG Vachkova, "Morfologiske og funktionelle begivenheder forbundet med fravænning hos kaniner," Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, vol. 98, nr. 1, s. 9-18, 2014.

[53] H. Shimoda, J. Tanaka, Y. Takahara, K. Takemoto, S.-J. Shan og M.-H. Su, "*e hypokolesterolæmiske virkninger af Cistanchetubulosa-ekstrakt, en kinesisk traditionel råmedicin, hos mus," 8e American Journal of Chinese Medicine, vol. 37, nr. 6, s. 1125-1138, 2009.

[54] RE Ley, PJ Turnbaugh, S. Klein og JI Gordon, "Menneskelige tarmmikrober forbundet med fedme," Nature, vol. 444, nr. 7122, s. 1022-1023, 2006.

[55] J.-Y. Kim, YM Kwon, I.-S. Kim et al., "Effekter af tilskud af brun tang laminaria japonica på serumkoncentrationer af IgG, triglycerider og kolesterol og intestinal mikrobiotasammensætning hos rotter," Frontiers in Nutrition, vol. 5, s. 23, 2018.

[56] W. Zhang, J. Huang, W. Wang, et al., "Ekstraktion, oprensning, karakterisering og antioxidantaktiviteter af polysaccharider fra Cistanche tubulosa," International Journal of BiologicalMacromolecules, vol. 93, s. 448-458, 2016.

[57] M. Sibai, E. Altuntas¸, B. Yıldırım, G. ¨Ozt¨urk, S. Yıldırım og T. Demircan, "Mikrobiom og lang levetid: en høj overflod af levetidsforbundne Muribaculaceae i tarmen af ​​den langlevende gnaver Spalax leucodon," OMICS: A Journal of IntegrativeBiology, vol. 24, nr. 10, s. 592-601, 2020.

[58] Y. Xie, Z. Chen, D. Wang, et al., "Effekter af fermenterede urtete-rester på de intestinale mikrobiota-karakteristika hos Holstein-kvier under varmestress," Frontiers in Microbiology, vol. 11, s. 1014, 2020.

[59] Y. Li, M. Liu, H. Liu, et al., "Orale kosttilskud af kombineret Bacillus licheniformis zhengchangsheng og xylooligosaccharider forbedrer fedtrig diæt-induceret fedme og modulerer tarmmikrobiotaen hos rotter," BioMed Research International, vol. . 2020, artikel-id 9067821, 17 sider, 2020.

[60] Y. Jiang og P.-F. Tu, "Analyse af kemiske bestanddele i cistanche-arter," Journal of Chromatography A, vol. 1216, nr. 11, s. 1970-1979, 2009.

[61] F. Li, Y. Yang, P. Zhu, et al., "Echinacoside fremmer knogleregenerering ved at øge OPG/RANKL-forholdet i MC3T3-E1-celler," Fitoterapia, vol. 83, nr. 8, s. 1443-1450, 2012.

[62] F. Tang, Y. Hao, X. Zhang og J. Qin, "Echinacosides effekt på nyrefibrose ved inhibering af TGF- 1/Smads signalvej i DB/DB musemodellen for diabetisk nefropati "Drug Design, Development and 8erapy, vol. 11, s. 2813-2826, 2017.

[63] W.-T. Xiong, L. Gu, C. Wang, H.-X. Sun og X. Liu, "Antihyperglykæmiske og hypolipidæmiske virkninger af Cistanche tubulosa i type 2 diabetiske DB/DB-mus," Journal of Ethnopharmacology, vol. 150, nr. 3, s. 935-945, 2013.

[64] X.-x. Bao, H.-h. Ma, H. Ding, W.-w. Li og M. Zhu, "Foreløbig optimering af en formel for kinesisk urtemedicin baseret på de neurobeskyttende virkninger i en rottemodel af rotenon-induceret Parkinsons sygdom," Journal of IntegrativeMedicine, vol. 16, nr. 4, s. 290-296, 2018.

[65] Y. Chen, Y.-Q. Li, J.-Y. Fang, P. Li og F. Li, "Etablering af den samtidige eksperimentelle model for osteoporose kombineret med Alzheimers sygdom hos rotter og de dobbelte virkninger af echinacosid og acteosid fra Cistanche tubulosa," Journal of Ethnopharmacology, vol. 257, artikel-id 112834, 2020.

[66] M. Hensel, AP Hinsley, T. Nikolaus, G. Sawers og B. C. Berks, "*e genetiske grundlag for tetrathionate respiration i Salmonella Typhimurium," Molecular Microbiology, vol. 32, nr. 2, s. 275-287, 1999.

[67] SE Winter, P. Thiennimitr, MG Winter, et al., "Tarmbetændelse giver en respiratorisk elektronacceptor for salmonella," Nature, vol. 467, nr. 7314, s. 426-429, 2010.

[68] SE Winter, MG Winter, MN Xavier, et al., "værts-afledt nitrat booster væksten af ​​E. coli i den betændte tarm," Science, vol. 339, nr. 6120, s. 708-711, 2013.

[69] C. Lupp, ML Robertson, ME Wickham, et al., "Værtsmedieret inflammation forstyrrer tarmmikrobiotaen og fremmer overvæksten af ​​Enterobacteriaceae," Cell Host & Microbe, vol. 2, nr. 2, s. 119-129, 2007.

[70] B. Stecher, R. Robbiani, AW Walker, et al., "Salmonellaenterica serovar Typhimurium udnytter inflammation til at konkurrere med tarmmikrobiotaen," PLoS Biology, vol. 5, nr. 10, s. e244-2189, 2007.

[71] V. Mishra, C. Shah, N. Mokashe, R. Chavan, H. Yadav og J. Prajapati, "Probiotika som potentielle antioxidanter: en systematisk gennemgang," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 63, nr. 14, s. 3615-3626, 2015.

[72] JMP Mart'ın, PF Freire, L. Daimiel, et al., "Antioxidanten butyleret hydroxyanisol forstærker de toksiske virkninger af propylparaben i dyrkede pattedyrceller," Food andChemical Toxicology, vol. 72, s. 195-203, 2014.

[73] RS Lanigan og TA Yamarik, "Endelig rapport om sikkerhedsvurderingen af ​​BHT," International Journal of Toxicology, vol. 21, nr. 2, s. 19-94, 2002.